Количественный анализ клеточного состава в передовых атеросклеротическим поражением гладкомышечные клетки Lineage трассировки мышей

Мы предлагаем стандартизированный протокол характеризовать клеточного состава поздней стадии мышиных атеросклеротических поражений, включая систематические методы животных рассечение, встраивание ткани, секционирование, окрашивание и анализ плечеголовной артерии от atheroprone гладкомышечные клетки линии трассировки мышей.

Атеросклероза остается ведущей причиной смерти во всем мире, и, несмотря на бесчисленные доклинические исследования, описывающие перспективных терапевтических целей, Роман мероприятия остаются недостижимой. Это, вероятно, частично, обусловлено опоры на доклинических предупреждения модели, изучение последствий генетических манипуляций или фармакологических препаратов по развитию атеросклероза, а не установленного заболевания. Кроме того результаты этих исследований часто смешанные из-за использования поверхностных поражений анализов и отсутствие характеристика поражения клеточных популяций. Чтобы помочь преодолеть эти поступательные препятствия, мы предлагаем растущая зависимость модели вмешательства, которые используют исследование изменения клеточного состава на уровне отдельной ячейки immunofluorescent окрашивание и confocal микроскопии. С этой целью мы описываем протокол для тестирования предполагаемый терапевтический агент в модели мышиных вмешательства, включая систематический подход для животных рассечение, встраивание, секционирование, окрашивание и количественной оценки поражения плечеголовной артерии. Кроме того вследствие фенотипического разнообразия клеток в поздней стадии атеросклеротических поражений, опишем важность использования конкретных ячеек, индуцибельной линии трассировки мыши систем и как это может быть использованы для объективной характеристики атеросклеротические поражения клеточных популяций. Вместе эти стратегии могут помочь сосудистой биологи более точно модель терапевтических вмешательств и анализировать атеросклеротического заболевания и многообещающе будет перевести на более высокий уровень успеха в клинических испытаниях.

Атеросклероз является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире лежащие в основе большинства ишемической болезни сердца, заболевания периферических артерий, и инсульта. Поздней стадии коронарный атеросклероз может привести к тяжелых осложнений, включая учет миокарда нарушения почти 16% мирового населения смертности^1,2. Из-за его разрушительное воздействие на общественное здравоохранение расшифровать механизмы вождения прогрессирование атеросклероза, а также разрабатывать новые терапевтические стратегии был достигнут значительные усилия. Тем не менее уровень вероятность утверждения (LOA) клинических испытаний для сердечно-сосудистых заболеваний является одним из самых низких по сравнению с другими клинических областях (только 8,7% для этапа I)³. Это можно объяснить отчасти многие барьеры, атеросклероз представляет для разработки эффективной лекарств, включая почти повсеместный характер, клинически молчаливый прогрессии и значительные болезни неоднородности. Кроме того субоптимальные дизайн доклинические исследования на животных также могут учитываться для отсутствие успеха в клинической перевода. В частности мы считаем, что это необходимо для осуществления вмешательства исследования возможности исследовать эффективность терапевтических стратегий. Кроме того ощущается насущная необходимость для выполнения стандартных процедур для поражения анализов, включая передовые характеристики поздней стадии атеросклеротических поражений клеточного состава судьба сопоставления и фенотип.

Подавляющее большинство исследований атеросклероза сосредоточиться на модели профилактики атеросклероза, состоящий из наркотиков лечения или гена манипуляций (нокаут или забивные) в здоровых молодых мышей, до начала болезни и прогрессии. Эти исследования обнаружили большое количество генов и сигнальных молекул, которые играют определенную роль в развитии атеросклероза. Однако большинство из этих целей не перевести на эффективной терапии в человека. Действительно трудно экстраполировать эффект терапии на здоровых молодых мышей для пожилых пациентов с передовых атеросклеротических поражений. Таким образом осуществление исследований вмешательства в доклинические экспериментальные конвейере вероятно обеспечивает более точное описание актуальность и эффективность нового терапевтического. Идея поддерживается поразительно различные эффекты ингибирующих провоспалительных цитокинов интерлейкина 1β (IL-1β) при найме предупреждения^4,5,6 или вмешательства стратегия⁷. Различия между предотвращением и практические исследования показывают, что различные клеточные процессы происходят на разных этапах развития атеросклероза и подчеркивается тот факт, что предотвращение исследования, вероятно, недостаточно для моделирования клинических сценарий адекватно.

Американская ассоциация сердца недавно опубликовал научное заявление, подробно рекомендации для надлежащего экспериментальный дизайн, процедурные стандартизации, анализа и отчетности о животных атеросклероза исследования⁸. В нем освещаются преимущества и ограничения преобладающим методы, используемые в поле. Например en лицом Судан IV пятнать аорты часто выполняется как первого считывания. Хотя en лицом Судан IV пятнать липидов осаждения является подходящим методом для оценки глобальных налет бремя, она не может отличить ранней стадии жирных полоса поражений от более продвинутые поздней стадии поражения. Таким образом интерпретация en лицом окрашивание часто является двусмысленным и поверхностные⁹. Тщательный анализ ткани сечений, используя судно, поражения и Люмене размер морфологических параметров и количественной оценки показателей стабильности поражения обеспечивает более точное понимание последствий эксперимента.

Наконец человека гистопатология исследования показали, что клеточный состав является лучше предиктором разрыв чем сам, размер поражения с бедными поражений в клетках гладких мышц (SMC) и богатыми в макрофагах, которые более восприимчивы к разрыву^{10, 11}. Эти замечания были основаны на окрашивание для маркеров, классически используется для идентификации клетки (то есть, ACTA2 для SMC и LGALS3 или CD68 для макрофагов). Однако выражение этих маркеров не является строго ограничивается одной ячейки типа в атеросклеротических поражений благодаря пластичности несколько линий, включая SMC, эндотелиальных клеток и миелоидных клеток¹². В частности однозначной идентификации SMC в пределах атеросклеротического поражения было практически невозможно до последнего десятилетия из-за свойства этих клеток дедифференцироваться и подавления их линии конкретных маркерных генов (процесс называют Фенотипические переключение) в¹³раненых или больных сосудов. Это ограничение в SMC идентификации было обойти путем развития линии трассировки^{7,14,,1516,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24}. Он состоит из постоянно маркировки SMC и их потомства для отслеживания их судьба и фенотипические эволюции во время прогрессирование атеросклероза, используя комбинацию выражения рекомбиназа Cre, движимый SMC-конкретных промоутеров (т.е., Myh11^{7,15,,1718,19,20,21,,2223 , 24},^25, Acta2²⁶ и SM22α^14,16) и активация журналистов (например, флуоресцентных белков, β-галактозидазы) [обзор в Bentzon и Majesky 2018²⁷]. В одном из первых исследований, используя SMC трассировки линии вне эмбриогенеза параметр Шпеер et al.¹⁴ представила доказательства того, что SMC может модулировать их фенотипа и transdifferentiate в хондрогенном клетки во время сосудистой кальцификации с помощью модель трассировки линии Cre R26R LacZ SM22α . Хотя эти исследования впервые трассировки линии SMC, они были частично двусмысленным в том, что выражая SM22α любого заданного номера SMC в параметре болезни будут обозначены репортер. Это ограничение было обойти путем разработки и использования тамоксифен индуцибельной Cre ERT/LoxP разрешительные временной контроль маркировки клеток. Маркировки клеток происходит исключительно во время доставки тамоксифен и будет ограничен в ячейку, выражая ячейки конкретного типа промоутер вождения Cre ERT выражение в то время экспозиции тамоксифен, избегая трассировки типов альтернативных клеток, активация КРР в Настройка прогрессирования заболевания. Для трассировки линии SMC в атеросклероза, тамоксифен индуцибельной Myh11- Cre/ERT2 трансген, связанные с журналистами флуоресцентные (eYFP^{7,15,17,18 , 21}, mTmG^19,25, конфетти^20,,2223 клоновых расширения исследований) продемонстрировал замечательную эффективность и специфичность в SMC маркировки и имеет используется для населения SMC карта судьбы в атеросклеротических поражений в последних исследованиях. Важно отметить, что эти исследования показали, что: 1) 80% SMC в расширенный атеросклеротическим поражением ДУ не выразить любые обычные SMC маркеры (ACTA2, MYH11) используется в иммуногистохимического анализа и поэтому будет ошибочно без родословной трассировки ¹⁷; 2) подмножеств SMC Экспресс маркеры типов альтернативных клеток, включая маркеры макрофагов или мезенхимальных стволовых клеток маркеры^16,,1719; и 3) SMC инвестировать и заполнить атеросклеротического поражения, расширение oligoclonal и SMC клоны сохраняют пластичности для перехода к фенотипически различных популяциях^20,23. Итак, теперь ясно, что гладкомышечные клетки представляют замечательную фенотипического разнообразия в атеросклеротических поражений и может иметь положительное или ущерб роли в патогенезе поражений в зависимости от характера их фенотипические переходы. Эти открытия представляют собой замечательные новые терапевтические авеню для ориентации SMC athero содействие фенотипические переходы в поздней стадии атеросклероза.

Здесь мы предлагаем стандартный протокол для анализа поздней стадии мышиных атеросклеротических поражений, включая систематические методы для животных рассечение, встраивание, секционирование, окрашивание и количественной оценки поражения плечеголовной артерии. Чтобы определить влияние интерлейкинов 1β торможения на судьбу SMC и фенотип, мы использовали SMC линии отслеживания ароЕ^{- / -} мышей кормили западной диеты в течение 18 недель до получения еженедельных инъекций антитела анти IL1β или управления IgG изотипа соответствием.

Животноводство, обработки и процедуры были утверждены Виргинского университета и университета Питтсбурга институционального ухода за животными и использования Комитетом.

1. поколение мышей трассировки линии SMC

1. Породы Myh11мужчины - Cre/ERT2²⁸ (Лаборатория Джексон; #019079) с R26R-EYFP самок (Лаборатория Джексон; #006148), чтобы получить Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+/ +} мужчин.
2. Порода - Cre/ERT2 Myh11⁺ R26R-EYFP^{+/ +} мужчины с ароЕ^{- / -} самок мышей (Лаборатория Джексон; #002052). Крест потомства и выберите по генотипированию Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+/ +} ароЕ^{- / -} мужчин и R26R-EYFP^{+/ +} ароЕ^{- / -} самок мышей как окончательный заводчиков. Обрезать хвосты и выполнить генотипирования однопометники. Все мужчины мыши должно быть Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+/ +} ароЕ^{- / -} и может использоваться в качестве экспериментальных мышей (рис. 1А).
   Примечание: Протоколы генотипирования можно найти на веб-сайте Лаборатория Джексон. Трансген Cre/ERT2 Myh11 расположен в Y хромосоме, исключающих использование женщин. Другие системы трассировки линии могут быть использованы, но эта система является на сегодняшний день наиболее надежным стратегию трассировки линии судьбы карта SMC в атеросклероза.

2. гладких мышц клеток линии отслеживание мыши диета и лечение

1. У мужчин - Cre/ERT2 Myh11⁺ R26R-EYFP^{+/ + - / -} мышей ароЕ получают серии инъекций 1 мг тамоксифен от шести до восьми недель возраста постоянно маркировать Myh11⁺ SMC с рекламы ЯФП и отслеживать их судьба (рис. 1 A).
   1. Тепла арахисовое масло при температуре 55 ° C.
   2. Добавление тамоксифен в предварительно нагретой арахисовое масло приготовляют раствор на 10 мг/мл и Инкубируйте на 55 ° C до полного растворения тамоксифен.
   3. Выполните внутрибрюшинной инъекции с 0,1 мл раствора 10 мг/мл тамоксифен для серии 10 инъекций более двух недель.
      Примечание: Тамоксифен биологической и должны быть обработаны с осторожностью.
2. 5-7 дней после последнего введения тамоксифен, заменить Чоу диеты с высоким содержанием жиров (например, Западная диета; 42% ккал от жира 0,2% общего холестерина) продолжительностью в 18 недель, чтобы разрешить для развития передовых атеросклеротических поражений, которые последовательно развивается в нескольких сосудов кровати, включая аорты, корня аорты, плечеголовной артерии и брюшной аорты.
3. В 18 недель, высоким содержанием жиров питание Начните терапевтического вмешательства для требуемой продолжительности (рис. 1Б).
   Примечание: В качестве примера, мы провели загрузок внутрибрюшинной инъекции с анти IL1β антитела или элемент IgG изотипа соответствием между 18 и 26 недель высоким содержанием жиров.
4. Удаление продовольствия быстро мышей для 8-16 h до тканей, заготовки для выполнения точных результатов Плазменные холестерина и триглицеридов.

3. заготовка плечеголовной артерии (МДС)

1. Эвтаназия животных должны следовать животное уход и использование Комитета (ACUC) требований и правил. Усыпить экспериментальной мышей CO₂ удушение приблизительно 5 минут и проверить смерть, мыс пинча.
2. Весят мыши и собирать кровь.
   1. Весят мыши
   2. Spray вентральной стороне мыши с 70% этанол
   3. Выполните сердечной прокол, вставляя иглу 25G подключен к 1 мл шприц в желудочке с левой стороны грудной полости. 0,1-1 мл крови могут быть собраны.
   4. Передать ЭДТА механотронное крови промывкой шприц и поместите трубки на качалку или ротатор для 10-15 мин.
   5. Передача крови 1,5 мл трубки и центрифуги для 10 минут 250 x g при 4 ° C. Осторожно снять этапа Топ плазмы с пипетки и адекватные советы и передачи новой трубки. Хранить при температуре-20 ° C до измерения холестерина и триглицеридов.
      Примечание: цельная кровь может использоваться для дополнительных исследований, включая клеток крови и других компонентов крови, включая цитокинов или профилирование иммунных клеток.
3. Сделать надрез около 2 см в коже в середине живота с помощью ножницы и потяните кожу подвергать брюшной полости. Вырежьте брюшины до грудины без повреждения тканей. Сделайте два надреза в середине подмышечных линии через грудной клетки, стараясь не повредить сердце и легкие.
4. Поднимите грудины с помощью пинцета и сократить диафрагму частично подвергать сердце. Если сердце не является легко доступной, срезаем грудной клетки достаточно, чтобы добраться до правого предсердия.
5. Perfuse мышь с системой перфузии гравитации (рисA). Установка системы перфузии гравитации, таким образом, что давление жидкости перфузии эквивалентен средняя мышиных кровяного давления (рис. 2B). Эта система позволяет для последовательности в перфузии и поддерживает оба судна морфологии и сбрасывает красных кровяных клеток.
   Примечание: Как ссылка, C57Bl6 мышей у физиологическое кровяное давление между 120 мм рт.ст. (среднего систолического артериального давления) и 70 мм рт.ст. (средняя диастолическое артериальное давление)^29,30. Средняя систолическое и диастолическое кровяное давление может варьироваться с мыши генетический фон.
   1. Подключите 23 или 25G Бабочка иглы к системе перфузии гравитации и запустить фосфат амортизированное Saline (PBS) через иглу изгнать воздух из трубы. Вставить иглу в левый желудочек и зафиксируйте иглы в месте. С помощью ножниц Ирис, Сделайте небольшой надрез (< 2 мм) в правое предсердие или восходящей части аорты.
   2. Perfuse с 5 мл PBS, затем 10 мл 4% раствора параформальдегида (PFA), затем 5 мл ФСБ. Используйте решение PFA PBS и 4% при температуре окружающей среды.
   3. Собирать ткани интерес (например, печени, легких, селезенки) и поместите их в 4% раствор PFA.
6. Разоблачить BCA
   1. Чистота области шеи путем удаления кожи и слюнных желез.
   2. Выполнение одной сократить срединной линии грудины через рукоятка, с помощью ножниц. Будьте осторожны, что ножницы остаться близко к задней части грудины, чтобы избежать повреждения сосудистую, тесно расположенные ниже грудины. Вытяните обе стороны грудной клетки с щипцами полностью открыть грудной полости. Аорт должно быть частично видимым.
   3. Очистка, потянув мышц и соединительной ткани и удаление жира с помощью пинцета, штраф до правой сонной артерии, плечеголовной артерии подключичные бифуркации аорты очищены и изолированной окружающей соединительной ткани и жира (Рисунок 2C).
7. Удаление BCA
   1. С помощью щипцов, захватить правой сонной ниже его раздвоения и первоначальный голову выше щипцы (Рисунок 2D).
   2. Все еще держа сонной артерии, сделайте второй разрез через подключичной артерии. Окончательный два разрезы через аорты, по обе стороны плечеголовной артерии (Рисунок 2D).
   3. Сбор других сосудистых тканей интерес (например, брюшной аорты, Улучшенный часть сердца, содержащий корня аорты).
   4. Место BCA и другие ткани в 4% раствор PFA на ночь при комнатной температуре.
      Примечание: Время фиксации должны быть постоянной в течение всего исследования.

4. ткань обработки и секционирование

1. Удаление ткани от 4% PFA и место в кассету Приклеенные этикетку ткани (рис. 3А). Использование пены колодки в кассету для обеспечения ткани сохраняют свою ориентацию и остается в кассету через шаг обработки (рис. 3B). Закройте кассеты и погрузиться в 70% этанол до тканей, обработки (24-72 ч).
   1. Процесс BCA и другие ткани, собранные для гистологического и immunofluorescent окрашивание следующим образом (пример рутинной процедурой в течение ночи, использование процессора с вакуумной проникновения): 10% нейтральные буферизуются формалином для 30 мин при температуре (2 x), 75% этанол 60 мин при 30 ° C (1 x), 90% этанола для 60 мин при 30 ° C (1 x), этанол 95% за 60 мин при 30 ° C (1 x), 100% этанола для 60 мин при 30 ° C (3 x), ксилол 60 мин при 30 ° C (3 x) и парафин для 80 мин на 62 ° C (3 x).
2. Внедрить BCA вертикально, с аорты ближе к поверхности блока (рис. 3C).
3. Вырежьте через блок парафин микротом роторный (10 мкм толщина) до достижения встроенных ткани.
4. Как только ткань является видимым, изучите раздел под микроскопом для определения позиции. Если все еще виден аорты, удалите до десяти 10 мкм разделы одновременно, изучения раздела на каждом интервале.
5. Когда аорты была секционного через и плечеголовной артерии является видимым, Отрегулируйте ориентацию блока в положение ткани полностью перпендикулярно ножа микротома.
6. Вырежьте BCA на секции толщиной 10 мкм. В тот момент все разделы собираются серийно с тремя разделами на слайд. Собирайте до достижения подключичные бифуркации (рис. 3D).
   Примечание: Важно сократить BCA на секции толщиной 10 мкм для последующих z стек конфокальное изображение приобретения и одноклеточного подсчета. Эта толщина позволит строгий и не cofounding оценки ассоциации между одного ядра и цитоплазмы или мембраны, пятнать хотя глубина поперечного сечения.

5. immunofluorescent окрашивание

Примечание: Полной характеристики атеросклеротических поражений включает оценку морфологических параметров и показателей стабильности налета или нестабильности и клеточного состава, который не будет в центре внимания настоящего Протокола. Поражением морфологии, содержание коллагена и intraplaque кровоизлияния могут быть проанализированы по Movat^7,17, PicroSirius Red ^7,31, Ter119 окрашивание ^7,18, соответственно. Здесь мы будем описывать протокол для анализа состав клеточных повреждений.

1. Инкубируйте слайды в следующих решениях при комнатной температуре под капотом химического: Ксилол за 5 мин (2 x), 100% этанола за 5 мин (2 x), этанол 95% для 5 мин (2 x), этанол 70% для 5 мин (2 x) и деионизированную H2O (diH₂O) за 5 мин (2 x).
2. Инкубируйте слайды в антиген поиска решения согласно инструкции производителя.
   1. С лимонной кислотой антигена демаскирующих решение на базе (см. Таблицу материалы), разбавить 3 мл раствора в 320 мл diH₂O. место слайды в окрашивание резервуара и заполнить на вершину с подготовленной антигена поиска решения.
   2. Заполните любые пустые слоты в стойке слайд с пустых слайдов обеспечить равномерный нагрев. Обложка контейнер с крышкой, чтобы позволить антигена поиска решения варить без испарения.
   3. Тепло слайды в микроволновую печь на 20 мин в приблизительно 675-700 Вт. Проверьте слайды регулярно и заменить испарится жидкость с diH₂O такие, которые разделы остаются погруженной в разоблачении решения во все времена.
   4. Разрешить слайды остыть в растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
3. Растворите 6 g рыбы кожу желатина (ФСГ) в 1 Л PBS. PBS/FSG используется как отмывающего буфера. Приготовляют блокирующий раствор 10% нормальной сыворотки в PBS/FSG.
   Примечание: Рыба кожи желатин используется в подготовке блокировки буфера. FSG не содержат сыворотку белков, которые могут cross-react с млекопитающих антител, минимизации фонового шума. Однако другие блокирования должно быть предпочтительным с системами обнаружения биотина FSG содержит эндогенный биотин. Тип нормальной сыворотки используется основан на вторичные антитела, используемые. Когда осел вторичные антитела используются, сыворотке нормальный лошади должны выбираться для блокирования и антитела разведениях.
4. Инкубируйте слайды в PBS для 5 мин при комнатной температуре. Разделах ткани в круг с гидрофобным пера. Охватывают разделы с блокирующий буфер PBS/ФСГ/нормальной сыворотки 1 ч при комнатной температуре. Подготовьте раствор основной антител в сыворотке PBS/ФСГ/нормальный во время этого шага, в то время как блокирование тканей.
5. Проинкубируйте с первичных антител, разбавленных в PBS/ФСГ/нормальной сыворотки на ночь при 4 ° C в камере влажности. Один раздел на слайд следует инкубировали с смесь антител IgG управления на такой же концентрации как основного антитела к управления для основного антитела специфичности.
6. Вымойте слайды следующим при комнатной температуре: PBS/FSG 5 мин (3 x), затем PBS для 5 мин (1 x).
7. Инкубируйте с Флюорофор конъюгированных вторичные антитела (см. Таблицу материалы) и diamidino-2-phenylindole (DAPI) ядро counterstaining разводят в PBS/ФСГ/нормальной сыворотки 1 ч при комнатной температуре. Защищайте от света слайды.
8. Вымойте слайды, как описано в шаге 5.6.
9. Смонтировать слайды с помощью монтаж носителей, подходящих для флуоресценции (см. Таблицу материалы).

6. конфокальная микроскопия

Примечание: Использование Конфокальный микроскоп и приобретение z стека имеет решающее значение для подсчета одной ячейки.

1. Задать параметры приобретения использоваться на протяжении всего исследования: изображения резолюции (1024 x 1024 или 2048 x 2048 пикселей); Оптического пути и количество каналов, которые являются функцией комбинацию вторичных антител выбран; скорость сканирования (рекомендуется скорость сканирования: 7-8); и дифференциальной помехи контраст (DIC) канала.
2. Использование секций, окрашенных и первичных антител IgG управления, установите чувствительность детектора, мощность лазера и смещение для каждого отдельного канала. IgG управления используется для минимизации фонового сигнала.
3. Установите вверх верхней и нижней позиции для приобретения z стека. Предопределяют толщины и количество стеков для приобретения. Эти параметры должны оставаться постоянной в течение всего исследования.
   Примечание: Мы рекомендуем изображений 8 до 10 штабеля толщиной 1 мкм. Оставаться последовательной в количество стеков, отображаемого на протяжении всего исследования.
4. Изображения из разделов ткани окрашивали первичных антител и IgG управления для всех каналов, включая DIC.
5. Ярлык по крайней мере одно изображение с линейки для калибровки изображения во время подсчета одну ячейку.

7. одну ячейку подсчета

1. Установка и запуск ImageJ. При необходимости, скачать плагины в разделе скачать > ввода/вывода из ImageJ веб-сайт, чтобы открыть файл изображения создаются в зависимости от формата изображений, генерируемых конфокального микроскопа.
2. Откройте файл изображения в ImageJ.
3. Калибровка изображения с ссылкой шкалы используя изображения, созданные в 6,6.
4. Разграничить области интереса, в котором одну ячейку подсчет будет осуществляться с помощью DIC канал (рис. 4).
   Примечание: Один регион могут быть определены одновременно. В зависимости от экспериментальных вопросов, считая одной ячейки может быть выполнена в поражения всей области (см. 7.3.1) и/или в район поражения. Например расследование области волокнистые Кап (см. 7.3.2) имеет особое значение, поскольку его клеточного состава является важным индекс поражения склонность к разрыву.
   1. Разграничить области поражения, следуя люмен границы (рис. 4A; белые стрелки) и внутренней упругой пластинки (рис. 4A; Желтые стрелки) видно на изображении DIC.
   2. Для анализа области волокнистые Кап определить границы далекие 30 мкм от просвета и отслеживать границы ( рис. 4B-D).
      Примечание: Классически области волокнистые Кап определяется как региона, обогащенный ACTA2 + клетки и коллаген нижележащего люмен (Рисунок 4B). Обогащения в ACTA2 + клеток и коллаген играет важную роль в стабильности поражения. Предыдущие исследования определили, что область ячейки богатых фиброзной Кап ACTA2 + средние толщиной 30 мкм от просвета в SMC-линии отслеживания ароЕ^{- / -} мышей кормили высоких жиров 18 до 26 недель (рис. 4C). Таким образом дотошный характеристика влияния генетических манипуляций или медикаментозное лечение на клеточный состав области волокнистые Кап чрезвычайно актуальна.
5. Открыть панель Инструментов каналы (изображение > Цвет > инструменты канала) и псевдо-различные цвета окрашивания каналов (рис. 5A; Вставка 1).
6. Слияние цветовые каналы (изображение > Цвет > слияния цвета) (рис. 5A; вставку 2). Все каналы должны быть видны на то же изображение (рис. 5B). Включение и выключение отдельных цветовых каналов, с помощью панели Инструментов канала (рис. 5A; Вставка 1).
7. Настройте средство подсчета.
   1. Щелкните правой кнопкой мыши на значке подсчета в панели инструментов (рис. 5C; Вставка 1) и выберите Многоточечный инструмент.
   2. Дважды щелкните на тот же значок, чтобы открыть панели Инструментов точки (рис. 5C; вставку 2).
   3. Выберите тип и размер элементов, используемых для подсчета клеток.
   4. Проверьте, Показать все.
8. Включите канал DAPI только в панели Инструментов канал и выберите счетчик канал 0 (рис. 5C; вставку 3). Нажмите на отдельных ядер, которые будут помечены (например, желтые точки на рис. 5C-D). Прокрутки z стеки для подсчета всех ядер, окрашенных в регионе интереса. Количество событий, указанных ниже счетчика канал в Точку, инструмент панели (рис. 5C; вставку 4).
9. Включите другой окрашивание канал (например, eYFP окрашивание). Выберите счетчик канал 1. Щелкните ячейки, в которых есть colocalization между DAPI и пятнать. Для окрашивания цитоплазмы, выберите ячейки для окрашивания окружает ядро на всю глубину ядра (проверить несколько z стеки).
10. Повторите, изменяя пятнать комбинаций и выбор новых каналов счетчик для подсчета популяции клеток интерес. Каждый цвет точка представляет население различных клеток (рис. 5D). Результаты могут быть выражены как количество клеток на общее количество DAPI или количество клеток в области.

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP ароЕ^{- / -} мышей вводили тамоксифен от шести до восьми недель возраста до кормили высоких жиров. В 18 недель, высоким содержанием жиров питание две группы восьми мышей лечили еженедельно с мыши моноклональные антитела анти ИЛ 1β или элемент IgG изотипа согласованной на 10 мг/кг за 8 недель (рис. 1)⁷. Мышей были принесены в жертву и увлажненную с 4% раствор PFA-PBS. Плечеголовной артерии были расчленены, обрабатываются и секционного как описано выше (рис. 2 и рис. 3).

После immunofluorescent окрашивание с антителами, ориентированные на линии отслеживание репортером (рекламы ЯФП) и фенотипические маркеры (ACTA2, LGALS3, RUNX2), толщиной 8-10 мкм BCA сечений был воспроизведен образ с помощью конфокального микроскопа. Были приобретены изображения каждого индивидуального окрашивание, DAPI (ядерной окрашивание), и DIC. Определение областей, представляющих интерес для одной ячейки, подсчета (поражение, волокнистых Кап) проводилось с использованием DIC изображения (рис. 4). Одноячеистый подсчета для определения обилие различных групп населения, SMC-производный была выполнена с использованием ImageJ (рис. 5).

Мы представляем два представителя immunofluorescent окрашивание и одного подсчета оценки эффекта ИЛ 1β ингибированием клеточного состава в передовых атеросклеротических поражений. Во-первых, окрашивание было сделано для SMC линии трассировки репортер рекламы ЯФП, SMC маркер ACTA2 и макрофагов маркер LGALS3 в поперечных сечений в двух разных местах BCA (480 мкм и 780 мкм от аорты) (рис. 6). Подсчитывая анализ одну ячейку в регионе волокнистых Кап эти сечения были выполнены и существенные различия были найдены в клеточный состав области волокнистые колпачок между мышей, получавших антитела анти IL-1β и мышей относились с соответствием изотипа IgG управления(рис. 6). Ингибирование ИЛ 1β был связан с уменьшением рекламы ЯФП + SMC и увеличение LGALS3 + клеток (рис. 6B). Относительно фенотипы SMC населения, было отмечено снижение количества рекламы ЯФП + ACTA2 + SMC, тогда как относительное количество SMC-производные макрофагов (рекламы ЯФП + LGALS3 +) был значительно увеличен в обоих местах BCA (рис. 6C).

Наконец мы исследовали влияние ИЛ 1β ингибирование SMC фенотипические переход в хондрогенном клетки. Эта Фенотипическая переход является важной движущей силой сосудистой кальцификации, главной особенностью поздней стадии атеросклероза^14,32,33. BCA сечений были витражи для SMC линии трассировки репортер рекламы ЯФП, маркер osteochondrogenic RUNX2 и макрофагов маркер LGALS3 (рисA). Изобилие и происхождение RUNX2 + хондрогенном клетки были охарактеризованы в области поражения в наших двух экспериментальных группах. Мы обнаружили, что ингибирование ИЛ 1β не влияет общее количество RUNX2 + клеток в пределах очага поражения, ни доли SMC-производные (рекламы ЯФП + RUNX2 +) и макрофагов, полученных (рекламы ЯФП-LGALS3 + RUNX2 +) хондрогенном клеток (рис. 7Б).

Рисунок 1 : Исследования вмешательство в гладких мышц клетки мышей линии трассировки. (A) схематическое представление Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP ароЕ^{- / -} тамоксифен индуцибельной SMC конкретной линии мыши модели трассировки. Лечение с тамоксифен индуцирует рекомбинации Локус R26R-рекламы ЯФП и иссечение стоп-кодон и постоянное выражение рекламы ЯФП по SMC. (B) схемы вмешательства исследования в Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP ароЕ^{- / -} мышей кормили западной диеты для 18 недель вводили еженедельно с ИЛ 1β антитела или управления соответствием изотипа IgG антитела в концентрации 10 мг / кг за 8 недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Рассечение плечеголовной артерии. (A) схема гравитации инициативе перфузии системы. Система настроена на точную высоту, позволяя перфузии при давлении около среднем систолическое артериальное давление у мышей. Давление слегка варьируется в зависимости от объема высота как жидкость используется во время перфузии между высота h₁ и h₂. (B) уравнение для расчета давления статической жидкости и определение высоты до давления перфузии равен C57Bl6 мышь среднего систолического артериального давления. (C) фотографии проксимального отдела аорты и ветвления артерий в C57Bl6 мышь, откармливаются Чоу (слева) и^{- / -} мышь ароЕ кормили высоких жиров 26 недель (фото справа). Звездочка указывает на наличие атеросклеротических поражений. (D) схема проксимального отдела аорты и артерий ветвления. Красные стрелки обозначают вырезы для изоляции правой сонной артерии и плечеголовной изоляции и число указания порядка сокращений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Обработка ткани, внедрение и резании. (A) фотография внедрения кассету с BCA ткани. BCA позиционируется на поролоновую подкладку. (B) масштаб в BCA, на поролоновую подкладку. BCA ориентирована аорты рядом метки часть кассеты и сонной артерии, поправил вертикально. Линейки: 1 cm. (C) схема парафина блок после встраивания плечеголовной артерии. (D) схема последовательного слайды с 10 мкм толщиной последовательных секций с указанием расстояния от аорты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Разграничение атеросклеротического поражения и области волокнистые Кап. (A) представитель микроскопии DIC изображение атеросклеротического поражения в сечениях плечеголовной артерии от Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP ароЕ^{- / -}. Люминал границы внутреннего упругой пластинки локализованы на белые и Желтые стрелки, соответственно (левая панель). Зона поражения, разделенное по пунктирной линии (правая панель) шкалы бар: 100 µm. (B) представитель микроскопии DIC и ACTA2 окрашивание. Двойной головкой стрелки показывают толщину ACTA2 окрашивание в пределах района нижележащего люмен, определение области волокнистые Кап. (C) количественная оценка subluminal ACTA2⁺ толщина в Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP ароЕ^{- / -} кормили высоких жиров 18, 21 и 26 недель. Используя этот штамм мышей, волокнистых cap есть средняя толщина 25-30 мкм в заранее атеросклеротических поражений. Результаты выражаются как среднее ± SEM. (D) определение фиксированной области толстые волокнистые крышка 30 мкм для подсчета одну ячейку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Одну ячейку подсчет с помощью ImageJ. Иллюстрирующие ключевые шаги одной ячейки, считая с ImageJ на изображения, полученные с помощью конфокальной микроскопии снимки экрана. (A) каждый индивидуальный пятнать канала и отдельных z стек видны прокрутив c: и z: баров в нижней части изображения. Окрашивания каналы являются псевдо-цветные с помощью панели канала (1) каналы окрашивания (рекламы ЯФП, LGALS3, ACTA2, DAPI для ядерной окрашивания и ОПК) объединяются с помощью панели слияния канала (2). (B) результаты канала слияния для рекламы ЯФП, LGALS3, ACTA2, DAPI и ОПК. (C) ядро подсчета основе DAPI окрашивание с помощью подсчета значок (1) и панель инструментов точку (2). Канал другого счетчика используется для каждой популяции клеток (3). Количество событий, учитываются указанные ниже счетчика канал (4). Белый прямоугольник: регион увеличен справа. (D) представитель изображение одной ячейки, подсчет внутри области волокнистые колпачок (пунктирная линия) для нескольких клеточных популяций, включая DAPI (желтые точки), рекламы ЯФП⁺ клетки (пурпурный точек), рекламы ЯФП^–LGALS3⁺ клетки (голубой точек), Рекламы ЯФП⁺LGALS3⁺ клетки (оранжевые точки), рекламы ЯФП⁺ACTA2⁺ клетки (зеленые точки) и рекламы ЯФП^–ACTA2⁺ клеток (темно синие точки). Белый прямоугольник: регион увеличен справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 : Характеристика влияния ИЛ 1β торможение на клеточный состав области волокнистые Кап в двух различных местах BCA SMC линии отслеживания ароЕ/мышей. (A) BCA сечения на 480 мкм и 780 мкм от аорты от мышей, получавших с ИЛ 1β антитела или IgG элемента, как показано на рисунке 1 были пятнами для рекламы ЯФП, LGALS3, и DAPI (ядерной окрашивание) и секции был образ от DIC. Immunofluorescent каналы были объединены (нижней правой панели). Пунктирные линии разграничения волокнистых Кап регионов. Масштаб бары: 100 µm. (B) одноклеточного подсчет показывает, что ингибирование ИЛ 1β связано с значительным снижением рекламы ЯФП⁺ клеток и увеличение LGALS3⁺ ячеек в пределах области волокнистые Кап. C) в рамках рекламы ЯФП⁺ клеток населения, снижением рекламы ЯФП⁺ACTA2⁺ и увеличение рекламы ЯФП⁺LGALS3⁺ населения наблюдаются. Результаты выражаются как среднее ± SEM. Статистический анализ: непарные несколько t теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7 : Влияние ИЛ 1β ингибирование на количество RUNX2 + хондрогенном клеток с передовых атеросклеротических поражений. A) BCA сечений витражи для рекламы ЯФП, LGALS3, RUNX2 и DAPI (ядерной окрашивание), и были объединены все каналы (нижней панели). Пунктирные линии разграничить области поражения. Масштаб бары: 100 µm. B) одноклеточного подсчет показывает, что ингибирование ИЛ 1β не влияет на общее количество RUNX2⁺ клеток в пределах очага поражения, ни доли RUNX2⁺ клеток из SMC происхождения (рекламы ЯФП⁺RUNX2⁺; Рекламы ЯФП⁺LGALS3⁺RUNX2⁺) и миелоидного происхождения (рекламы ЯФП^–LGALS3⁺RUNX2⁺). Результаты выражаются как среднее SEM. Статистический анализ: непарные несколько t теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Несмотря на десятилетия научно-технические достижения в изучении атеросклероза поле имеет разочарование истории перевода научных выводов по клинической терапии^34,35. Это явление может частично объяснить расхождения в животных моделях, экспериментальные проекты и поражения анализа. Здесь мы описываем экспериментальной трубопровода, который мы использовали для анализа клеточного состава в передовых атеросклеротическим поражением, с помощью мыши трассировки линии⁷. Этот метод позволяет для тщательного расследования клеток судьба картографирования и фенотип, которые являются ключевые параметры, контролируемые потенциальных механизмов на играть в передовых атеросклеротических поражений.

SMC-линии модель трассировки мыши является мощным инструментом для точного отслеживания судьбы и фенотипические модуляции этой линии и их вклада в патогенезе атеросклероза. Тамоксифен индуцибельной Cre-loxP система позволяет маркировки зрелых сосудистой SMC, выражая MYH11 до начала атеросклероза. Убедительных доказательств с помощью этой системы показывает, что атеросклеротические бляшки весьма пластиковые и сосудистой SMC может претерпеть фенотипические переключения, теряя их сократительная фенотипа и SMC-специфических маркеров, пролиферирующих, миграция и даже transdifferentiating в Макрофаг подобных клеток^17,18. В настоящем протоколе мы покажем, как линии трассировки обнаружения и immunofluorescent окрашивания для отметок интереса могут быть интегрированы точно определить фенотипические переходы, SMC и их относительной частотой среди населения других SMC.

Эта методика весьма взаимодополняющими с других анализов, часто исполняются в поле. Во-первых оценка бремени атеросклеротического поражения en лицом аорты препаратами в сочетании с липидов, окрашивание, Судан IV широко используется из-за его удобства и скорости. Однако это является неадекватной мерой ключевых морфологических параметров, таких как размер, размер поражения, люмен и ремонт судна. Окрашивание en лицом аорты, подготовка Судан IV визуализировать липидов осаждения может использоваться для количественного определения относительного поражения область в пределах аорты, но он может предоставить несовместимым пятнать поражений, как только компонент липидный нейтральными визуализируется в то время как регионы, занимаемых других составляющих, таких как внеклеточного матрикса, обычно пренебрегают⁸. Кроме того en лицом окрашивания не может сообщить о морфологии поражения и не могут различать между жирных разводов и передовых поражений. Морфология судна является важным параметром для оценки стадии и разрыв риска атеросклероза, включая поражения размер, диаметр просвета, судно, Ремоделирование^7,,3637. Эти анализы требуют сохранения морфологии судна для надлежащей количественной оценки. Главное протоколы для расследования морфологических параметров сильно перекрываются с протоколом подробно здесь. В частности они полагаются на использование гравитации инициативе сосудистой перфузии системы для PBS и фиксирующие перфузии для обеспечения большей последовательности в давление. Гравитации инициативе инфильтрации система гарантирует постоянный поток скорость и давление между каждой независимой мыши и предотвращает несоответствия ручной изгнаны силой перфузии между независимыми экспериментов или исследователи. Тяжести перфузии должна быть создана система побудить перфузии при давлении около среднем мышиных артериального давления (70-120 mmHg). Во-вторых мы предоставили стандартизированных и систематический метод встраивания и секционирование для плечеголовной артерии. Определяя стартовый сайт секционирование и количественного определения области поражения в нескольких местах на всей территории плечеголовной артерии, мы можем ограничить случайные вариации, которая поставляется с ограниченной выборки.

Проточной цитометрии является другой метод отлично дополняют друг друга, с immunofluorescent окрашивание в сочетании с одной ячейке подсчета, широко используемый в количественном определении популяции клеток в пределах атеросклеротическим поражением³⁸. Он состоит из пищеварения мыши аорты и маркировки выпустила клеток с флуоресцентных антител. Проточной цитометрии предлагает количественный анализ клеточных популяций, присутствующих в аорту. Однако как и все технологии, проточной цитометрии имеет ограничения. Несмотря на собственный преимущество установки большой массив одновременных маркеров полной потери пространственного разрешения, и он становится неясным ли популяции клеток обогащается в крышку волокнистых или некротических ядро. Кроме того существует риск эффекта растворения с проточной цитометрии требуется большое количество клеток и часто направлена не только на атеросклеротической областях. По этой причине иммунофлюоресценции и проточной цитометрии может использоваться на взаимодополняющей основе для обеспечения высокой размерной профилирования и локализации поражения.

Наконец протокол ориентирована на количественной оценке SMC населения в BCA расширенный поражения с помощью параформальдегида исправлена и парафин врезанных тканей секций. Однако этот протокол может использоваться для расследования других сосудистых кровати, включая корня аорты или брюшной аорты, два сосудистой территории при условии развития атеросклероза. Ранее хорошо описана^8,39были систематической обработки и вырезание из корня аорты. Как атеросклероз развивается в разных местах, и что генетическая манипуляция или терапевтического вмешательства не содержанием однородно может повлиять на эти сайты²¹, важно исследовать как много сосудистых кровати как можно сделать точные выводы. Immunofluorescent окрашивание и одноклеточного подсчета может также выполняться с помощью замороженных секций. Это может быть необходимо из-за несовместимости антител с парафиновых срезах. Хотя животных перфузии и встраивание ткани будет отличаться от этого протокола, следователи могут выполнить остальные экспериментальных процедур, описанные здесь.

В заключение приемы, описанные здесь наброски систематический подход к анализу поражения клеточных популяций и фенотипы в поздней стадии мышиных атеросклероза. Этот протокол может служить в качестве шаблона для расследования поражения населения immunofluorescent окрашивание во всех типах экспериментального дизайна, включая ранней и поздней стадии атеросклероза, а также профилактики и вмешательства исследования.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мы благодарим центр за биологическими Imaging (поддерживается низ 1S10OD019973-01) в университете Питтсбурга за их помощь. Эта работа была поддержана, поддерживается грантом научного развития 15SDG25860021 от Американской ассоциации сердца к R.A.B. д.г. была поддержана NIH Грант F30 HL136188.