Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris

Nous vous proposons un protocole normalisé afin de caractériser la composition cellulaire des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques de dissection animale, incorporation de tissus, coupes, coloration et analyse des artères brachiocéphalique atheroprone muscle lisse cell lineage traçage souris.

L’athérosclérose demeure la principale cause de décès dans le monde et, malgré d’innombrables études précliniques décrivant des cibles thérapeutiques prometteuses, nouvelles interventions reste insaisissables. Cela s’explique probablement en partie, à un recours aux modèles précliniques de prévention portant sur les effets des manipulations génétiques ou des traitements pharmacologiques sur le développement de l’athérosclérose, plutôt que la maladie établie. Aussi, les résultats de ces études sont souvent confusion en raison de l’utilisation des analyses de lésion superficielle et l’absence de caractérisation de populations cellulaires de lésion. Pour aider à surmonter ces obstacles translationnelles, nous proposons un recours accru aux modèles d’intervention qui emploient l’enquête des changements dans la composition cellulaire au niveau unicellulaire par immunofluorescence et microscopie confocale. À cette fin, les auteurs décrivent un protocole pour tester un agent thérapeutique putatif dans un modèle murin d’intervention y compris une approche systématique pour la dissection animale, enrobage, coupes, coloration et quantification des lésions de l’artère brachiocéphalique. En outre, en raison de la diversité phénotypique des cellules à l’intérieur des stades de lésions athéroscléreuses, nous décrivons l’importance d’utiliser des systèmes de souris pour le traçage lignée cellulaire spécifique, inductible et comment cela peut être exploité pour la caractérisation objective des populations de cellules de lésion athéroscléreuse. Ensemble, ces stratégies peuvent aider les biologistes vasculaires plus précisément modéliser les interventions thérapeutiques et analyser la maladie athéroscléreuse et seront traduira si tout va bien un taux plus élevé de réussite dans les études cliniques.

L’athérosclérose est la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde entier qui sous-tend la plupart des maladies des artères coronaires, maladies artérielles périphériques et les AVC. Stades de l’athérosclérose coronarienne peut entraîner des complications sévères, y compris la comptabilité d’infarctus du myocarde pour près de 16 % du monde population mortalité^1,2. En raison de ses effets dévastateurs sur la santé publique, un effort important a été déposée auprès de décrypter les mécanismes conduisant la progression de l’athérosclérose, ainsi que de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pourtant, le taux de probabilité d’approbation (LOA) d’essais cliniques pour les maladies cardiovasculaires est parmi les plus faibles comparativement aux autres domaines cliniques (seulement 8,7 % pour la phase I)³. Cela peut s’expliquer en partie par les nombreux obstacles que l’athérosclérose pose au développement de médicaments efficaces dont sa nature presque ubiquiste, cliniquement silencieuse progression et hétérogénéité significative de la maladie. En outre, la conception sous-optimal des études précliniques sur des animaux aussi peut s’expliquer le manque de succès dans la traduction clinique. Plus précisément, il nous paraît nécessaire mettre en œuvre des études d’intervention lorsque c’est possible d’étudier l’efficacité des stratégies thérapeutiques. En outre, il y a un besoin essentiel d’effectuer des procédures normalisées pour les analyses de lésion incluant la caractérisation avancée des composition cellulaire avancé lésion athéroscléreuse de phénotypage et cartographie sort.

La grande majorité des études de l’athérosclérose se concentrer sur les modèles de prévention de l’athérosclérose consistant en médicaments traitement ou gène manipulation (knockout ou knock-in) chez la souris jeunes, avant le déclenchement de la maladie et la progression. Ces études ont découvert un grand nombre de gènes et molécules de signalisation qui jouent un rôle dans le développement de l’athérosclérose. Toutefois, la plupart de ces objectifs ne se traduisent par des thérapies efficaces chez les humains. En effet, il est difficile d’extrapoler l’effet une thérapie sur jeune chez la souris pour les personnes âgées atteintes de lésions athéroscléreuses avancées. Ainsi, la mise en œuvre des études d’intervention dans le pipeline expérimental préclinique probable offre une représentation plus précise de la pertinence et l’efficacité d’une nouvelle thérapeutique. L’idée est soutenue par les effets très divergentes de l’inhibition de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1β (IL-1β) lorsque vous employez une prévention^4,5,6 ou intervention stratégie⁷. Différences entre prévention et études d’intervention suggèrent que les différents processus cellulaires se produisent à différentes phases du développement de l’athérosclérose et met en évidence le fait que les études de prévention sont probables insuffisantes pour modéliser le scénario clinique adéquatement.

L’American Heart Association a récemment publié une déclaration scientifique détaillant les recommandations pour la conception expérimentale appropriée, normalisation procédurale, analyse et signalement des animaux athérosclérose études⁸. Il met en évidence les avantages et les limites des techniques prédominantes utilisées dans le domaine. Par exemple, visage en Soudan IV coloration de l’aorte est souvent interprétée comme une première lecture. Bien que le visage en Soudan IV coloration des dépôts de lipides est une méthode appropriée pour l’évaluation du fardeau global de plaque, il est incapable de distinguer les lésions de stade précoce gras strie de lésions de stades plus avancées. Par conséquent, l’interprétation de la coloration du visage en est souvent ambigu et superficielle⁹. Une analyse minutieuse des tissus, coupes à l’aide de la taille de navire, lésion et lumen paramètres morphologiques et la quantification des indices de stabilité de la lésion fournit une compréhension plus précise de l’effet d’une expérience.

Enfin, des études de histopathologie humaine ont suggéré que la composition cellulaire est un meilleur indicateur de rupture que la taille de lésion elle-même, avec les pauvres de lésions dans les cellules musculaires lisses (SMC) et riche en macrophages étant plus susceptibles de se rompre à^{10, 11}. Ces observations étaient basées sur une coloration pour marqueurs classiquement utilisés pour l’identification de la cellule (c.-à-d. ACTA2 pour SMC et LGALS3 ou CD68 de macrophages). Toutefois, l’expression de ces marqueurs n’est pas strictement limitée aux cellules du même type dans les lésions athérosclérotiques en raison de la plasticité de multiples lignées y compris SMC, les cellules endothéliales et les cellules myéloïdes¹². En particulier, l’identification sans ambiguïté du SMC au sein de la lésion athéroscléreuse était pratiquement impossible jusqu'à la dernière décennie en raison de la propriété de ces cellules de dédifférenciation et réprimer leurs gènes marqueur lignée spécifique (un processus appelé commutation phénotypique) dans les vaisseaux malades ou blessés,¹³. Cette limitation dans l’identification de la SMC a été contournée par le développement de la lignée traçage^{7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24}. il se compose de l’étiquetage en permanence SMC et leur progéniture pour suivre leur destin et leur évolution phénotypique au cours de la progression de l’athérosclérose en utilisant une combinaison de l’expression de la recombinase Cre grâce aux promoteurs de SMC spécifiques (p. ex., Myh11^{7,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24}, Acta2^25,26 et, SM22α^14,16) et l’activation des reporters (protéines fluorescentes, β-galactosidase) [revu Bentzon et Majesky 2018²⁷]. Dans l’une des premières études employant traçage lignée SMC à l’extérieur de réglage de l’embryogenèse, Speer et coll.¹⁴ fourni la preuve que SMC peut moduler leur phénotype et se transdifférencier en cellules chondrogéniques au cours de la calcification vasculaire à l’aide de un modèle de suivi SM22α Cre R26R LacZ lignée. Bien que ces études pionnier de traçage de lignée SMC, ils sont partiellement équivoques que toute donnée non-SMC SM22α exprimant dans le cadre de la maladie serait étiqueté par le journaliste. Cette limitation a été contournée par le développement et l’utilisation de la Cre inductibles par tamoxifène ERT/LoxP permettant un contrôle temporel de l’étiquetage de la cellule. Marquage de cellules se produit uniquement lors de l’accouchement de tamoxifène et se limitera à la cellule exprimant le promoteur spécifique au type cellule conduite expression Cre ERT au moment de l’exposition de tamoxifène, évitant le traçage des types de cellules alternative activation Cre dans la définition de progression de la maladie. Pour le traçage de la lignée des SMC dans l’athérosclérose, le transgène de - Cre/ERT2 Myh11inductibles par tamoxifène associé à fluorescents reporters (eYFP^{7,15,17,18 , 21}, mTmG^19,25, confettis^20,22,23 pour les études de l’expansion clonale) a démontré une efficacité remarquable et une spécificité dans l’étiquetage des SMC et a servi à devenir carte SMC populations dans les lésions athéroscléreuses dans des études récentes. Ce qui est important, ces études ont révélé que : 1) 80 % du SMC avancé dans les lésions athéroscléreuses pas exprès des marqueurs classiques de SMC (ACTA2, MYH11) utilisées dans l’analyse d’immunohistological et donc serait ont été confondues avec sans suivi de lignée ¹⁷; 2) sous-ensembles de SMC expriment des marqueurs de types de cellules remplaçant incluant des marqueurs de macrophages ou cellules souches mésenchymateuses marqueurs^16,17,19; et 3) SMC investir et remplir la lésion athéroscléreuse en expansion oligoclonales et SMC clones conservent la plasticité à la transition à phénotypiquement différentes populations^20,23. Pour résumer, il est clair désormais que les cellules musculaires lisses présentent une remarquable diversité phénotypique des lésions athéroscléreuses et peuvent avoir des rôles bénéfiques ou néfastes sur la pathogénie des lésions selon la nature de leurs transitions phénotypiques. Ces découvertes représentent une remarquable nouvelle voie thérapeutique pour le ciblage SMC athero-promotion phénotypiques transitions dans l’athérosclérose tardifs.

Dans les présentes, nous vous proposons un protocole standardisé pour l’analyse des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques pour la dissection animale, enrobage, coupes, coloration et quantification des lésions de l’artère brachiocéphalique. Pour déterminer l’effet d’inhibition de l’Interleukin-1β sur le devenir de la SMC et phénotype, nous avons utilisé lignée SMC traçage ApoE^{- / -} souris soumises à un régime occidental pendant 18 semaines avant de recevoir des injections hebdomadaires d’un anticorps anti-IL1β ou d’isotype IgG témoins.

Procédures, de manutention et d’élevage ont été approuvés par l’Université de Virginie et la University of Pittsburgh Institutional Animal Care et utilisation.

1. production de souris de traçage pour le lignage SMC

1. Se reproduisent Myh11- Cre/ERT2 mâles²⁸ (laboratoire Jackson ; #019079) avec des femelles de R26R-EYFP (laboratoire Jackson ; #006148) pour obtenir Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ / +} les hommes.
2. Reproduire la Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ / +} mâles avec ApoE^{- / -} souris femelles (laboratoire Jackson ; #002052). Traverser la progéniture et sélectionnez par génotypage Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ / +} ApoE^{- / -} mâle et R26R-EYFP^{+ / +} ApoE^{- / -} souris femelles comme éleveurs finales. Couper les queues et effectuer génotypage de même portée. Toutes les souris mâles devraient être Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ / +} ApoE^{- / -} et peut être utilisé comme souris expérimentales (Figure 1A).
   Remarque : Les protocoles de génotypage se trouvent sur le site du laboratoire de Jackson. Le transgène de Cre/ERT2 Myh11 est situé sur le chromosome Y, excluant l’utilisation des femelles. Autres systèmes de traçage de lignée peuvent être utilisés, mais ce système est à ce jour la stratégie de suivi de lignée plus fiable à la carte SMC de destin dans l’athérosclérose.

2. traitements et régime de souris muscle lisse cell lineage-traçage

1. Ont male Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ / +} ApoE^{- / -} souris reçoivent une série d’injections de tamoxifène 1 mg de six à huit semaines d’âge d’étiqueter en permanence Myh11⁺ SMC avec YFP et de suivre leur destin (Figure 1 ( A).
   1. Faire chauffer l’huile d’arachide à 55 ° C.
   2. Ajouter le tamoxifène dans l’huile d’arachide préchauffé à préparer une solution à 10 mg/mL et incuber à 55 ° C jusqu'à dissolution complète du tamoxifène.
   3. Effectuer une injection intrapéritonéale avec 0,1 mL de solution de tamoxifène 10 mg/mL pour une série de dix injections sur une période de deux semaines.
      NOTE : Tamoxifène représente un danger biologique et doit être manipulé avec soin.
2. Cinq à sept jours après la dernière injection et le tamoxifène, remplacer le régime avec une alimentation riche en graisses (p. ex., régime occidental ; 42 % kcal provenant des lipides ; 0,2 % cholestérol total) pour une durée de 18 semaines pour permettre le développement des lésions athéroscléreuses avancés, qui développe constamment dans les lits vasculaires multiples dont l’arc aortique, la racine aortique, artère brachiocéphalique et l’aorte abdominale.
3. À 18 semaines d’alimentation riche en graisses alimentation, commencent une intervention thérapeutique pour la durée désirée (Figure 1B).
   NOTE : À titre d’exemple, nous avons réalisé des injections intrapéritonéales hebdomadaires avec un anticorps anti-IL1β ou un témoins du même isotype IgG entre 18 et 26 semaines de régime riche en graisses.
4. Retirez les aliments à des souris rapides pendant 8 à 16 h avant récolte pour effectuer une lecture précise de triglycérides et de cholestérol plasmatique des tissus.

3. la cueillette de l’artère Brachiocéphalique (BCA)

1. Euthanasie animale doit suivre les règlements et exigences utilisation Comité (ACUC) et animalier. Euthanasier les souris expérimentales par asphyxie₂ CO pendant environ 5 minutes et vérifier la mort de pincement de l’orteil.
2. Peser la souris et recueillir le sang.
   1. Peser la souris
   2. Vaporiser la partie ventrale de la souris avec 70 % éthanol
   3. Effectuer la ponction cardiaque en insérant une aiguille 25G, reliée à une seringue de 1 mL dans le ventricule du côté gauche de la cage thoracique. 0,1 à 1 mL de sang peuvent être prélevé.
   4. Transférer le sang dans un tube à vide EDTA en rinçant la seringue et placer le tube sur une bascule ou coiffe pendant 10-15 min.
   5. Transférer sang dans un tube de 1,5 mL et la centrifugeuse pour 10 minutes 250 x g à 4 ° C. Extraire délicatement la phase plasmatique supérieure avec une pipette et des conseils adéquats et le transférer dans un nouveau tube. Conserver à-20 ° C avant de mesurer le taux de cholestérol et de triglycérides.
      NOTE : sang entier peut être utilisé pour des études supplémentaires, y compris le nombre de cellules sanguines et autres produits sanguins labiles, y compris les cytokines ou profilage des cellules immunitaires.
3. Faire une incision d’environ 2 cm de la peau au niveau du milieu de l’abdomen à l’aide de ciseaux et tirer la peau pour exposer la cavité abdominale. Couper le péritoine jusqu'à le sternum sans endommager les tissus. Faire deux incisions sur la ligne axillaire moyenne à travers le thorax, en veillant à ne pas endommager le cœur et les poumons.
4. Soulever le sternum avec des pincettes et couper le diaphragme pour exposer partiellement le cœur. Si le cœur n’est pas facilement accessible, découper la cage thoracique suffisamment pour atteindre l’oreillette droite.
5. Perfuse la souris avec un système de perfusion par gravité (Figure 2A). Installer le système de perfusion par gravité telle que la pression du fluide perfusion équivaut à la moyenne tension artérielle murine (Figure 2B). Ce système permet par souci de cohérence en perfusion et les deux maintient les navire morphologie et flushes culots globulaires.
   Remarque : Comme référence, souris C57Bl6 ont une pression artérielle et physiologique entre 120 mmHg (pression systolique moyenne) et 70 mmHg (pression diastolique moyenne)^29,30. La pression artérielle systolique et diastolique moyenne peut varier avec le bagage génétique de souris.
   1. Connecter un 23 ou 25G papillon aiguille pour le système de perfusion par gravité et traversent l’aiguille pour évacuer l’air des tubes de solution Saline tamponnée au Phosphate (PBS). Introduire l’aiguille dans le ventricule gauche et fixer l’aiguille en place. À l’aide de ciseaux iris, faire une petite incision (< 2 mm) dans l’oreillette droite ou l’aorte ascendante.
   2. Perfuse avec 5 mL de PBS, ensuite 10 mL de solution de 4 % de paraformaldéhyde (PFA), puis 5 mL de PBS. Utilisez une solution PFA fois PBS et 4 % à la température ambiante.
   3. Recueillir des tissus d’intérêt (p. ex., foie, poumon, rate) et placez-les dans la solution PFA de 4 %.
6. Exposer le BCA
   1. Nettoyer la région du cou en enlevant la peau et les glandes salivaires.
   2. Effectuer une coupe vers le bas de la ligne médiane du sternum par l’intermédiaire du manubrium à l’aide de ciseaux. Veillez à ce que les ciseaux restent près de l’arrière du sternum pour éviter d’endommager le système vasculaire situé près sous le sternum. Tirez sur les deux côtés de la cage thoracique avec une pince pour ouvrir complètement la cavité thoracique. Carotides doivent être partiellement visibles.
   3. Nettoyer en tirant sur les muscles et les tissus conjonctifs et en enlevant la graisse avec des pinces fines jusqu'à la carotide droite, l’artère brachiocéphalique la bifurcation sous-clavière et la crosse aortique sont nettoyées et isolées du tissu conjonctif et graisse (Figure environnantes 2C).
7. Supprimer le BCA
   1. À l’aide de pinces, prends la carotide droite au-dessous de sa bifurcation et produit une première coupe au-dessus de la pince (Figure 2D).
   2. Tout en maintenant la carotide, faire une deuxième coupe par l’intermédiaire de l’artère sous-clavière. Les deux coupes finales sont par le biais de la crosse aortique, de chaque côté de l’artère brachiocéphalique (Figure 2D).
   3. Recueillir les autres tissus vasculaires d’intérêt (p. ex., aorte abdominale, partie supérieure du cœur contenant la racine aortique).
   4. Placez le BCA et autres tissus en solution à 4 % PFA du jour au lendemain à la température ambiante.
      NOTE : Le temps de fixation doit rester cohérent tout au long de l’étude.

4. tissu traitement et sectionnement

1. Retirez le tissu de 4 % PFA et la place dans une cassette de tissu marqué (Figure 3A). Utilisation des blocs de mousse dans la cassette pour s’assurer que le tissu conservent son orientation et les restes de la cassette par l’étape de transformation (Figure 3B). Fermer les cassettes et plonger dans l’éthanol à 70 % jusqu’au tissu traitement (24 à 72 h).
   1. BCA process et autres tissus collectés pour histologiques et immunofluorescence souillant comme suit (exemple de procédure de routine durant la nuit en utilisant un processeur avec une pénétration sous vide) : 10 % neutre tamponné au formol pendant 30 min à température ambiante (2 x), 75 % éthanol pendant 60 min à 30 ° C (1 x), l’éthanol à 90 % pendant 60 min à 30 ° C (1 x), l’éthanol à 95 % pendant 60 min à 30 ° C (1 x), l’éthanol à 100 % pendant 60 min à 30 ° C (3 x), xylène pendant 60 min à 30 ° C (3 x) et la cire de paraffine pour 80 min à 62 ° C (x 3).
2. Incorporer la BCA verticalement, avec la crosse aortique plus proche de la face du bloc (Figure 3C).
3. Coupez le bloc de paraffine sur un microtome rotatif (10 µm d’épaisseur) jusqu'à atteindre le tissu incorporé.
4. Une fois le tissu est visible, examiner un article sous un microscope pour déterminer la position. Si la crosse aortique est encore visible, retirer jusqu'à dix 10 µm sections à la fois, examinant une section à chaque intervalle.
5. Lorsque l’arc aortique a été sectionnée par l’intermédiaire et l’artère brachiocéphalique est visible, ajustez l’orientation du bloc pour positionner le tissu complètement perpendiculaire à la lame au microtome.
6. Couper le BCA à une épaisseur de coupe de 10 µm. À ce stade, toutes les sections sont collectées en série avec trois sections par diapositive. Recueillir jusqu'à arriver à la bifurcation sous-clavière (Figure 3D).
   Remarque : Il est important de couper la BCA à une épaisseur de coupe de 10 µm pour acquisition d’image confocale z-pile ultérieurs et comptage de cellule unique. Cette épaisseur permettra l’évaluation rigoureuse et non-travers de l’association entre un seul noyau et du cytoplasme ou membrane coloration bien que la profondeur de la coupe transversale.

5. immunofluorescence

Remarque : Une caractérisation complète des lésions athéroscléreuses comprend l’évaluation des paramètres morphologiques et indices de stabilité de la plaque ou de l’instabilité et de composition cellulaire qui ne seront pas l’objet du présent protocole. La morphologie de la lésion, la teneur en collagène et hémorragie intraplaque peuvent être analysés par Movat^7,17, PicroSirius rouge ^7,31, Ter119 coloration ^7,18, respectivement. Ici, nous allons décrire le protocole pour l’analyse de la composition cellulaire des lésions.

1. Incuber les lames dans les solutions suivantes à la température ambiante sous une hotte chimique : xylène pour 5 min (2 x), de l’éthanol à 100 % pendant 5 min (2 x), l’éthanol à 95 % pendant 5 min (2 x), éthanol à 70 % pendant 5 min (x 2) et désionisée H2O (diH₂O) pendant 5 min (2 x).
2. Incuber les lames dans une solution d’antigène selon les instructions du fabricant.
   1. Avec de l’acide citrique basé solution démasquer l’antigène (voir Table des matières), diluer 3 mL de solution à 320 mL de diH₂O. placer les lames dans un réservoir de coloration et de remplir vers le haut avec la solution de l’antigène préparée.
   2. Remplir des cases vides dans la grille coulissante avec diapositives vierges pour assurer le chauffage égal. Couvrir le récipient avec un couvercle pour permettre à la solution de l’antigène à bouillir sans évaporation.
   3. Faire chauffer les diapositives dans un four à micro-ondes pendant 20 min à environ 675-700 watts. Vérifiez les lames régulièrement et les remplacer évaporé liquides par diH₂O tels que les articles restent immergées dans solution démasquer en permanence.
   4. Laisser les lames refroidir dans la solution pendant 1 h à température ambiante.
3. Dissoudre 6 g de gélatine de peau de poisson (FSG) dans 1 L de PBS. PBS/FSG est utilisée comme tampon de lavage. Préparer une solution de blocage du sérum normal de 10 % dans PBS/FSG.
   NOTE : Gélatine de peau de poisson est utilisée dans la préparation de la mémoire tampon de blocage. FSG ne contient-elle pas de protéines du sérum qui peuvent provoquer une réaction croisée avec des anticorps chez les mammifères, réduisant au minimum le bruit de fond. Toutefois, les autre option de blocage doit être privilégiée avec systèmes de détection de biotine car FSG contient biotine endogène. Le type du sérum normal utilisé est basé sur l’anticorps secondaire utilisé. Lorsqu’on utilise des anticorps secondaires âne, sérum de cheval normal doit être sélectionné pour les dilutions de blocage et d’anticorps.
4. Incuber les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Sections du cercle de tissu avec un stylo hydrophobe. Couvrir les sections avec le tampon de blocage sérum PBS/FSG/normal pendant 1 h à température ambiante. Préparer la solution de l’anticorps primaire dans le sérum de PBS/FSG/normal au cours de cette étape alors que les tissus sont bloquent.
5. Incuber les anticorps primaire dilué dans du sérum de PBS/FSG/normal durant la nuit à 4 ° C dans une chambre humide. Une section par lame doit être incubée avec un mélange d’IgG anticorps de contrôle à la même concentration que les anticorps primaires au contrôle de la spécificité de l’anticorps primaire.
6. Laver les lames comme suit à la température ambiante : PBS/FSG pendant 5 min (3 x), puis PBS pendant 5 min (1 x).
7. Incuber avec l’anticorps secondaires conjugué à un fluorophore (voir Table des matières) et diamidino-2-phénylindole (DAPI) noyau contre-coloration dilué dans du sérum de PBS/FSG/normal pendant 1 h à température ambiante. Protéger les diapositives de la lumière.
8. Les lames comme indiqué au point 5.6.
9. Montage de diapositives à l’aide de supports de montage adapté pour la fluorescence (voir Table des matières).

6. confocal microscopy

Remarque : L’utilisation d’un microscope confocal et acquisition de z-pile est essentielle pour le comptage des cellules individuelles.

1. Définir les paramètres d’acquisition à utiliser tout au long de l’étude : image de résolution (1024 x 1024 ou 2048 x 2048 pixels) ; Chemin optique et nombre de canaux, qui sont fonction de la combinaison des anticorps secondaires choisies ; vitesse de numérisation (vitesse de balayage a recommandé : 7-8) ; et canal (CID) de contraste interférentiel différentiel.
2. En utilisant des sections colorées avec l’anticorps primaires et le contrôle de l’IgG, régler la sensibilité du détecteur, puissance du laser et décalage à chaque canal individuellement. Le contrôle de l’IgG est utilisé pour réduire le signal de fond.
3. Mettre en place des positions supérieures et inférieures pour l’acquisition de z-pile. Prédéterminer l’épaisseur et le nombre de piles d’acquérir. Ces paramètres doivent rester cohérentes tout au long de l’étude.
   Remarque : Nous recommandons d’imagerie 8 à 10 piles de 1 µm d’épaisseur. Rester cohérent dans le nombre de piles photographié tout au long de l’étude.
4. Des sections de tissu image colorées avec les anticorps primaires et IgG contrôle pour tous les canaux, y compris les DIC.
5. Marquer au moins une image avec une échelle graphique pour la calibration d’image pendant le comptage de cellule unique.

7. seule cellule comptage

1. Installez et ouvrez ImageJ. Si nécessaire, téléchargez les Plugins dans la section télécharger > entrée/sortie de l’ImageJ site pour ouvrir le fichier image généré en fonction du format des images générées par la microscopie confocale.
2. Ouvrez le fichier image dans ImageJ.
3. Calibrer l’image avec une échelle de référence bar en utilisant l’image générée en 6,6.
4. Délimiter la zone d’intérêt dans lequel seule cellule comptage sera effectué à l’aide de la chaîne DIC (Figure 4).
   Remarque : Une région peut être délimitée à la fois. En fonction des questions expérimentales, comptage de cellule unique peut être effectuée dans la région de toute lésion (voir 7.3.1) et/ou dans un emplacement secondaire de la lésion. Par exemple, enquête sur la zone de cap fibreux (voir 7.3.2) convient particulièrement bien, puisque sa composition cellulaire est un indice important de la propension de la lésion à la rupture.
   1. Délimiter la zone de la lésion en suivant la frontière de lumen (Figure 4A; flèches blanches) et de la limitante élastique interne (Figure 4A, flèches jaunes) visible sur l’image de la DIC.
   2. Pour l’analyse de la zone de cap fibreux, déterminer la frontière distante de 30 µm de la lumière et tracer la frontière ( Figure 4B-D).
      Remarque : La zone de cap fibreux est classiquement définie comme la région riche en cellules ACTA2 + et collagène Egaliser la lumière (Figure 4B). L’enrichissement en ACTA2 + cell et le collagène joue un rôle essentiel dans la stabilité de la lésion. Des études antérieures ont déterminé que la région de cap fibreuse riche ACTA2 + cellule en moyenne une épaisseur de 30 µm de la lumière en SMC-lignée traçant ApoE^{- / -} souris nourries une alimentation riche en graisses pendant 18 à 26 semaines (Figure 4C). Ainsi, méticuleuse caractérisation des effets de manipulation génétique ou traitement pharmacologique sur la composition cellulaire de zone cap fibreux est remarquablement pertinente.
5. Ouvrez le panneau Outils canaux (Image > couleur > outils de canal) et des taches de pseudo-couleur les différents canaux (Figure 5A; encadré 1).
6. Fusionner les couches de couleur (Image > couleur > fusionner les couleurs) (Figure 5A; case 2). Tous les canaux doivent être visibles sur la même image (Figure 5B). Activer et désactiver les couches de couleur individuelles utilisant le Canal outils panneau (Figure 5A; encadré 1).
7. Mettre en place l’outil comptage.
   1. Faites un clic droit sur l’icône de comptage dans la barre d’outils (Figure 5C; encadré 1) et sélectionnez l’Outil multi-Point.
   2. Double-cliquez sur l’icône pour ouvrir le panneau Outil Point (Figure 5C; case 2).
   3. Sélectionnez le type et la taille des éléments utilisés pour compter les cellules.
   4. Cocher Afficher tout.
8. Allumez le canal DAPI que dans le panneau Outils canal et sélectionnez le canal compteur 0 (Figure 5C; case 3). Cliquez sur les noyaux individuels qui seront balisés (p. ex., jaune points en Figure 5C-D). Mettez en surbrillance z-piles pour compter tous les noyaux colorés dans la région d’intérêt. Le nombre d’événements est indiqué sous le canal de compteur dans Outil Point panneau (Figure 5C; encadré 4).
9. Tourner sur un autre canal de coloration (p. ex., eYFP coloration). Sélectionnez le canal compteur 1. Cliquez sur la cellule dans laquelle il y a une colocalisation entre DAPI et coloration. Pour une coloration cytoplasmique, sélectionnez les cellules pour avec coloration entoure le noyau sur toute la profondeur du noyau (vérifier plusieurs z-piles).
10. Répéter en modifiant la coloration des combinaisons et en sélectionnant les nouveaux canaux de compteur pour compter les populations de cellules d’intérêt. Chaque couleur de point représente une population de cellules différentes (Figure 5D). Résultats peuvent être exprimées en nombre de cellules au nombre total de DAPI ou le nombre de cellules de la région.

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} souris ont été injectés par le tamoxifène entre six et huit semaines avant d’être nourris avec un régime riche en graisses. À 18 semaines de régime riche en graisses alimentation, deux groupes de huit souris ont été traitées par semaine avec un anticorps anti-IL-1β monoclonal de souris ou un témoins du même isotype IgG à 10 mg/kg pendant 8 semaines (Figure 1)⁷. Souris ont été sacrifiées et perfusés avec une solution de PFA-PBS de 4 %. Brachiocéphalique artères ont été disséqués, traitées et sectionnés comme décrit ci-dessus (Figure 2 et Figure 3).

Après coloration par immunofluorescence avec des anticorps ciblant la lignée traçage reporter (YFP) et les marqueurs phénotypiques (ACTA2, LGALS3, RUNX2), une épaisseur de 8 à 10 µm de la BCA coupes a été photographié à l’aide d’un microscope confocal. Les images de chaque coloration individuelle, DAPI (coloration nucléaire) et DIC ont été acquises. Délimitation des régions d’intérêt pour la seule cellule de comptage (lésion, cap fibreux) a été réalisée en utilisant des images DIC (Figure 4). Cellule de comptage pour déterminer l’abondance des différentes populations dérivées de SMC a effectué un ImageJ (Figure 5).

Nous présentons deux immunofluorescence représentatif et unique comptant évaluant l’effet d’inhibition d’IL-1β sur composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées. Tout d’abord, la coloration a été faite pour le reporter de traçage de lignée SMC YFP, le marqueur SMC ACTA2 et le marqueur de macrophage LGALS3 dans les sections efficaces à deux endroits différents de la BCA (480 µm et 780 µm de la crosse aortique) (Figure 6). Analyse comptage de cellule unique dans la région de cap fibreux de ces section ont été réalisées et des différences remarquables dans la composition cellulaire de la zone de cap fibreux entre les souris traitées avec l’anticorps anti-IL-1β et souris traitées avec le appariés selon l’isotype IgG contrôle (Figure 6A). L’inhibition de l’IL-1β a été associée à une diminution YFP + SMC et une augmentation des cellules LGALS3 + (Figure 6B). Concernant les phénotypes des populations de la SMC, a observé une diminution du nombre de YFP + ACTA2 + SMC, tandis que le nombre relatif de dérivés de SMC (YFP + LGALS3 +) a notablement augmenté aux deux endroits de la BCA (Figure 6C).

Enfin, nous avons étudié l’effet d’inhibition d’IL-1β sur la transition phénotypique du SMC en cellules chondrogéniques. Cette transition phénotypique est un moteur important de la calcification vasculaire, la principale caractéristique des stades l’athérosclérose^14,32,33. Coupes BCA ont été colorés pour le journaliste de traçage de lignée SMC YFP, le marqueur d’osteochondrogenic RUNX2 et le marqueur de macrophage LGALS3 (Figure 7A). L’abondance et l’origine des cellules chondrogéniques RUNX2 + ont été caractérisés dans la zone de lésion dans nos deux groupes expérimentaux. Nous avons trouvé que l’inhibition de l’IL-1β n’avait aucune incidence le nombre total de cellules RUNX2 + au sein de la lésion, ni la proportion de dérivés de SMC (YFP + RUNX2 +) et les macrophages dérivés (YFP-LGALS3 + RUNX2 +) des cellules chondrogéniques (Figure 7B).

Figure 1 : Études d’intervention dans le Muscle lisse de cellules souris de lignée traçage. (A) représentation schématique de la Cre - Myh11/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} tamoxifène-inducible SMC lignée spécifique suivi modèle murin. Traitement par le tamoxifène induit la recombinaison du locus R26R-YFP et l’excision d’un codon STOP et l’expression permanente de YFP par SMC. (B) schéma d’intervention étudie dans quelles Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} souris nourris avec un régime occidental pour 18 semaines ont reçu une injection par semaine avec l’anticorps IL-1β ou un anticorps de contrôle appariés selon l’isotype IgG à une concentration de 10 mg / kg pour 8 semaines. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dissection de l’artère Brachiocéphalique. (A) schéma d’un système de perfusion par gravité. Le système est mis en place à une hauteur précise, ce qui permet la perfusion à une pression proche de la moyenne tension artérielle systolique chez les souris. La pression varie légèrement avec la hauteur du volume liquide est utilisée durant la perfusion entre la hauteur h₁ et h₂. Équation (B) pour le calcul de la pression des fluides statiques et la détermination de la hauteur pour atteindre une pression de perfusion égale à la C57Bl6 souris moyenne tension artérielle systolique. Photos (C) de l’aorte proximale et la ramifications artères chez la souris C57Bl6 soumis à une diète de chow (photo de gauche) et Apoe^{- / -} souris nourris avec un régime riche en graisses pendant 26 semaines (photo de droite). L’astérisque indique la présence de lésions athéroscléreuses. Schéma (D) de l’aorte proximale et la ramification des artères. Les flèches rouges représentent des coupes pour l’isolement de la carotide droite et numéros et l’isolement de l’artère brachiocéphalique indiquent l’ordre des découpes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Traitement de tissus, enrobage et sectionnant. (A) photographie d’une cassette d’encastrement avec tissu BCA. La BCA est positionné sur un coussinet de mousse. (B) de Zoom-in de la BCA positionné sur le coussin de mousse. La BCA est orientée avec la crosse aortique à proximité de la partie de l’étiquette de la cassette et la carotide redressé verticalement. Echelle : 1 cm. (C) schéma de paraffine bloquer après l’incorporation de l’artère brachiocéphalique. (D) schéma de série diapositives avec 10 µm d’épaisseur de coupes sériées avec indication de la distance de la crosse aortique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Délimitation des lésions athéroscléreuses et zone fibreuse cap. (A) micrographies représentatifs de DIC image lésion athéroscléreuse dans l’artère brachiocéphalique sections transversales de Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -}. La Luminale et les frontières de la limitante élastique interne sont localisées en blanc et jaune des flèches, respectivement (panneau de gauche). La zone de la lésion est délimitée par une barre d’échelle de pointillés (panneau de droite) : 100 µm. (B) représentant micrographies de DIC et ACTA2 coloration. Double-tête flèches indiquent l’épaisseur de la ACTA2 coloration dans la zone Egaliser la lumière définissant la zone cap fibreux. (C) Quantification de la sous-lumineuse ACTA2⁺ épaisseur en Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} soumis à une diète riche en matières grasses pour les 18, 21 et 26 semaines. À l’aide de cette souche de souris, la PAC fibreuse a une épaisseur moyenne de 25 à 30 µm dans les lésions athérosclérotiques avance. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. (D) la délimitation d’une zone de cap fibreux épais de 30 µm fixe pour le comptage de cellule unique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Cellule comptage en utilisant ImageJ. Captures d’écran illustrant les étapes clés de la cellule unique comptant avec ImageJ sur les images acquises par microscopie confocale. (A) chaque coloration individuelle channel et z-pile individuelle sont visibles en faisant défiler c: et z: barres au bas de l’image. Canaux de coloration sont pseudo coloré à l’aide du panneau de canal (1) chaînes de coloration (YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI pour la coloration des noyaux et DIC) sont fusionnés en utilisant le panneau fusion canal (2). (B) résultats du canal fusion YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI et DIC. (C) noyau de comptage basé sur la coloration DAPI à l’aide de l’icône de comptage (1) et le panneau outil Point (2). Un canal compteur différent est utilisé pour chaque population de cellules (3). Le nombre d’événements comptés est indiqué sous le canal de comptoir (4). Rectangle blanc : région élargie sur la droite. (D) image représentative de la cellule unique comptant dans la zone de cap fibreux (ligne pointillée) pour plusieurs populations de cellules, y compris au DAPI (points jaunes), cellules YFP⁺ (magenta dots), YFP^–LGALS3⁺ cellules (cyan points), YFP⁺LGALS3⁺ YFP⁺ACTA2 des cellules (points orange),⁺ cellules (points verts) et ACTA2 YFP^–+ cellules (points bleus foncés). Rectangle blanc : région élargie sur la droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Caractérisation des effets d’inhibition d’IL-1β sur la composition cellulaire de la région de cap fibreux à deux endroits distincts de BCA de lignée SMC traçage souris Apoe-/-. (A) BCA cross sections à 480 µm et 780 µm de la crosse aortique de souris traitées avec l’anticorps IL-1β ou le contrôle d’IgG tel qu’illustré à la Figure 1 ont été colorés pour YFP, LGALS3, et DAPI (coloration nucléaire) et la section a été photographié par DIC. Canaux par immunofluorescence ont fusionné (panneaux de droite en bas). Les lignes en pointillés délimitent les régions cap fibreux. Barreaux de l’échelle : 100 µm. (B) seule cellule comptage révèle que l’inhibition de l’IL-1β est associée à une diminution significative des cellules YFP⁺ et une augmentation de LGALS3⁺ des cellules dans la zone de cap fibreux. Population, une diminution YFP⁺ACTA2⁺ et une augmentation dans la YFP⁺LGALS3⁺ de cellules C) au sein de la YFP⁺ populations sont observées. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Statistical analysis : non appariés t-test multiple. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Effet d’inhibition de l’IL-1β sur le nombre de RUNX2 + chondrogéniques de cellules avec des lésions athéroscléreuses. BCA A) sections efficaces sont colorées pour YFP, LGALS3, RUNX2 et DAPI (coloration nucléaire), et tous les canaux ont été fusionnés (panneaux de fond). Les lignes en pointillés délimitent la zone de la lésion. Barreaux de l’échelle : 100 µm. B) comptage de cellule unique montre que l’inhibition de l’IL-1β n’influe pas sur le nombre total de RUNX2 des cellules au sein de la lésion, ni la proportion de RUNX2^{+ +} cellules d’origine SMC (YFP⁺RUNX2⁺; YFP⁺LGALS3⁺RUNX2⁺) et l’origine myéloïde (YFP^–LGALS3⁺RUNX2⁺). Les résultats sont exprimés en moyenne SEM. Statistical analysis : non appariés t-test multiple. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Malgré des décennies de recherche et de progrès techniques dans l’étude de l’athérosclérose, le domaine a une histoire décevante de traduire des résultats scientifiques aux thérapies cliniques^34,35. Ce phénomène peut s’expliquer en partie par des différences dans les modèles animaux expérimentaux et analyses de la lésion. Ici, nous décrivons un pipeline expérimental que nous avons utilisé pour analyser la composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées à l’aide de la lignée de souris suivi⁷. Cette méthode permet une enquête minutieuse de la cellule sort cartographie et phénotypage, qui sont des paramètres clés contrôlées par des mécanismes potentiels à joue dans les lésions athérosclérotiques avancées.

Le modèle de souris de traçage SMC-lineage est un outil puissant pour suivre précisément le sort et les modulations phénotypiques de cette lignée et leur contribution à la pathogenèse de l’athérosclérose. Le système de Cre-loxP inductibles par tamoxifène permet d’étiquetage du SMC de vasculaire mature exprimant MYH11 avant l’ouverture de l’athérosclérose. Impérieuses de preuve à l’aide de ce système a démontré que les plaques d’athérome sont fortement plastiques et SMC vasculaire peut subir commutation phénotypique, perdre leur phénotype contractile et marqueurs spécifiques des SMC, prolifération, migration et même transdifferentiating à macrophage-comme des cellules^17,18. Dans le présent protocole, nous montrons comment lineage-traçage détection et immunofluorescence pour marqueurs d’intérêt peut être intégré pour déterminer précisément les transitions phénotypiques entreprises par SMC et leur fréquence relative parmi les autres populations de SMC.

Cette méthodologie est très complémentaire avec les autres analyses exécutées fréquemment dans le domaine. Tout d’abord, l’évaluation du fardeau de la lésion athéroscléreuse de visage en préparations aortique combinées avec les lipides, la coloration par le Soudan IV est largement utilisée en raison de sa commodité et de rapidité. Toutefois, il s’agit d’une mesure inadéquate des principaux paramètres morphologiques tels que la taille de la lésion, la taille de lumen et transformant le navire. Coloration du visage de fr aortique préparation par le Soudan IV de visualiser les dépôts de lipides peut être utilisée pour quantifier la zone de lésion relative dans l’aorte, mais il peut donner incompatible la coloration des lésions, comme seule la composante de lipides neutres est visualisée tandis que régions occupées par les autres composants, tels que de la matrice extracellulaire, sont généralement négligées⁸. Par ailleurs, visage en coloration ne peut informer sur la morphologie de la lésion et ne peut pas distinguer les traînées grasses et lésions avancées. Morphologie du navire est un paramètre important utilisé pour évaluer l’athérosclérose risque de stade et de la rupture, y compris la taille de la lésion, diamètre du lumen, navire remodelage^7,36,37. Ces analyses requièrent la conservation de la morphologie du navire pour la quantification appropriée. Ce qui est important, des protocoles pour l’étude des paramètres morphologiques se chevauchent considérablement avec le protocole détaillé ici. En particulier, ils s’appuient sur l’utilisation d’un système de perfusion vasculaire gravitaire pour PBS et la perfusion fixateur fournir une plus grande cohérence dans la pression appliquée. Le système gravitaire infiltration garantit une vitesse de débit constant et une pression entre chaque souris indépendants et empêche l’incohérence de la perfusion d’axée sur la force manuelle entre expériences indépendantes ou des chercheurs. Le système de perfusion par gravité doit être mis en place pour induire la perfusion à une pression près de la moyenne tension artérielle murine (70-120 mmHg). Deuxièmement, nous avons fourni une méthode standardisée et systématique de l’incorporation et profilés pour l’artère brachiocéphalique. En définissant le site d’initiation de coupes et de quantifier la région lésée à plusieurs endroits dans l’artère brachiocéphalique, nous pouvons limiter la variation aléatoire qui est livré avec un échantillonnage limité.

Cytométrie en flux est une autre technique très complémentaire avec immunofluorescence couplé avec comptage de cellule unique qui a été largement utilisée pour quantifier les populations de cellules au sein de lésions athéroscléreuses³⁸. Il se compose de la digestion de l’aorte de la souris et l’étiquetage des cellules libérées avec des anticorps fluorescents. Cytométrie en flux offre une analyse quantitative des populations cellulaires présentes dans l’aorte. Cependant, comme toutes les technologies, écoulement cytometry a ses limites. Malgré l’avantage distinct de montage d’un large éventail de marqueurs simultanées, il y a une perte complète de la résolution spatiale, et il est peu clair si une population cellulaire est enrichie dans la PAC fibreuse ou le noyau nécrotique. En outre, il y a un risque d’effet de dilution puisque cytométrie nécessite un grand nombre de cellules et souvent ne se concentre pas uniquement sur les zones athérosclérotiques. Pour cette raison, immunofluorescence et cytométrie peuvent servir de manière complémentaire pour permettre le profilage dimensionnelle élevée et la localisation de la lésion.

Enfin, le protocole est axé sur la quantification des populations de la SMC dans BCA avancé la lésion à l’aide des sections de tissu paraformaldéhyde-fixé et inclus en paraffine. Toutefois, ce protocole peut être utilisé pour étudier les autres lits vasculaires, y compris la racine aortique ou l’aorte abdominale, deux territoires vasculaires sous réserve de développement de l’athérosclérose. Traitement systématique et le sectionnement de la racine aortique ont été bien décrites précédemment^8,39. Comme l’athérosclérose se développe à différents endroits et cette manipulation génétique ou l’intervention thérapeutique peut influer de façon non homogène de ces sites²¹, il est important d’enquêter sur les lits vasculaires autant que possible de tirer des conclusions précises. Immunofluorescence et comptage de cellule unique peuvent également être effectuées à l’aide de coupes congelées. Cela pourrait être nécessaire en raison de l’incompatibilité des anticorps avec des sections de paraffine. Bien que la perfusion animale et incorporation de tissu différeront de ce protocole, les enquêteurs peuvent suivre le reste des procédures expérimentales décrites ici.

En conclusion, les techniques décrites ici esquisse une approche systématique à l’analyse de populations de cellules de lésion et les phénotypes dans l’athérosclérose murin de stade avancé. Ce protocole peut servir de modèle pour étudier les populations de lésion par immunofluorescence dans tous les types de conception expérimentale dont l’athérosclérose précoce et avancé, ainsi que des études de prévention et d’intervention.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous remercions le centre d’imagerie biologique (pris en charge par le NIH 1S10OD019973-01) à l’Université de Pittsburgh, pour leur aide. Ce travail a été soutenu par est pris en charge par bourse de développement scientifique 15SDG25860021 de l’American Heart Association à la D.G. R.A.B. a été pris en charge par NIH grant F30 HL136188.