Análise quantitativa da composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas de ratos de rastreamento de linhagem celular músculo liso

Propomos um protocolo padronizado para caracterizar a composição celular do tarde-estágio lesões ateroscleróticas murino, incluindo métodos sistemáticos de dissecação animal, incorporação de tecido, corte, coloração e análise das artérias Braquiocefálica de ratos de rastreamento do linhagem de células de músculo liso atheroprone.

Aterosclerose continua a ser a principal causa de morte no mundo e, apesar de inúmeros estudos pré-clínicos descrevendo alvos terapêuticos promissores, intervenções romance permanecem indescritíveis. Isto é provavelmente devido, em parte, para uma dependência de modelos pré-clínicos prevenção investigando os efeitos de manipulações genéticas ou tratamentos farmacológicos sobre o desenvolvimento de aterosclerose em vez da doença estabelecida. Também, os resultados desses estudos são muitas vezes confusão devido a utilização de análises de lesão superficial e uma falta de caracterização de populações de células da lesão. Para ajudar a superar esses obstáculos translacionais, propomos um aumento da dependência em modelos de intervenção que empregam a investigação das alterações na composição celular a um nível de célula única por imunofluorescência coloração e microscopia confocal. Para este fim, descrevemos um protocolo para teste um putativo agente terapêutico em um modelo murino de intervenção, incluindo uma abordagem sistemática para dissecação animal, incorporação, corte, coloração e quantificação das lesões da artéria Braquiocefálica. Além disso, devido à diversidade fenotípica de células dentro de lesões ateroscleróticas do tarde-estágio, descrevemos a importância do uso de sistemas de rato de rastreamento de linhagem celular específica, inducible e como isso pode ser aproveitado para a caracterização imparcial da populações de células da lesão aterosclerótica. Juntos, essas estratégias podem auxiliar biólogos vasculares mais precisamente modelo intervenções terapêuticas e analisar a doença aterosclerótica e Tomara que se traduzirá em uma maior taxa de sucesso em ensaios clínicos.

A aterosclerose é a principal causa de morbidade e mortalidade subjacente em todo o mundo a maioria de doença arterial coronariana, doenças das artérias periféricas e derrame. Estágio final de aterosclerose coronariana pode levar a complicações graves, incluindo a contabilização de infração miocárdica de quase 16% da população de mundo a mortalidade^1,2. Devido ao seu impacto devastador sobre a saúde pública, fez esforço substancial para decifrar os mecanismos de progressão da aterosclerose, bem como a conduzir e desenvolver novas estratégias terapêuticas. Ainda, a taxa de probabilidade de aprovação (LOA) de ensaios clínicos para a doença cardiovascular é um dos mais baixos quando comparados com outros campos clínicos (apenas 8,7% para a fase I)³. Isto pode ser explicado em parte por muitas barreiras que aterosclerose poses para o desenvolvimento de drogas eficientes, incluindo a sua natureza quase onipresente, progressão clinicamente silenciosa e heterogeneidade da doença significativa. Além disso, o design de qualidade inferior de estudos pré-clínicos em animais também pode ser contabilizado a falta de sucesso na tradução clínica. Especificamente, acreditamos que é necessário implementar estudos de intervenção, sempre que possível investigar a eficácia de estratégias terapêuticas. Além disso, há uma necessidade crítica para realizar procedimentos padronizados para análises de lesão, incluindo avançados de caracterização da composição celular do tarde-estágio de lesão aterosclerótica por fenotipagem e mapeamento de destino.

A grande maioria dos estudos de aterosclerose focar em modelos de prevenção de aterosclerose consistindo de drogas tratamento ou gene manipulação (nocaute ou bater-em) em ratos jovens saudáveis, antes do início da doença e a progressão. Estes estudos revelaram um grande número de genes e moléculas sinalizadoras que desempenham um papel no desenvolvimento de aterosclerose. No entanto, a maioria dessas metas conseguiu traduzir a terapias eficientes em humanos. Realmente, é difícil de extrapolar o efeito de que uma terapia tem em ratos jovens saudáveis para pacientes idosos com lesões ateroscleróticas avançadas. Como tal, a implementação dos estudos de intervenção no pipeline experimental pré-clínicos provável fornece uma descrição mais exata da relevância e da eficácia de uma nova terapêutica. A ideia é apoiada pelos efeitos extremamente divergentes de inibir a citocina pró-inflamatória interleucina-1 β (IL-1 β) quando empregando uma prevenção^4,5,6 ou intervenção estratégia⁷. Diferenças entre prevenção e estudos de intervenção sugerem que diferentes processos celulares ocorrem em diferentes fases de desenvolvimento de aterosclerose e destaca o fato de que os estudos de prevenção são prováveis insuficiente para modelar o cenário clínico adequadamente.

A American Heart Association publicou recentemente uma fundamentação científica detalhando recomendações para projeto experimental apropriado, padronização de procedimento, análise e relatórios de animais aterosclerose estudos⁸. Ele destaca as vantagens e limitações das técnicas predominantes usadas no campo. Por exemplo, rosto pt Sudan IV coloração da aorta é frequentemente realizado como uma primeira leitura. Embora o rosto pt Sudan IV coloração de deposição de lipídios é um método adequado para a avaliação da carga global de placa, é incapaz de distinguir lesões raia gordurosos fase inicial de lesões mais avançadas do tarde-estágio. Como tal, a interpretação de manchar o rosto do pt é muitas vezes ambígua e superficial⁹. Análise cuidadosa do tecido seções transversais usando o tamanho de navio, lesão e lúmen de parâmetros morfológicos e quantificação dos índices de estabilidade de lesão fornece uma compreensão mais exata do efeito de uma experiência.

Finalmente, humano histopatologia estudos sugerem que a composição celular é melhor preditor de ruptura do que o tamanho da lesão em si, com lesões pobres em células musculares lisas (SMC) e ricos em macrófagos, sendo mais suscetíveis à ruptura^{10, 11}. Estas observações foram baseadas na mancha para marcadores classicamente utilizados para a identificação da célula (isto é, ACTA2 para SMC e LGALS3 ou CD68 por macrófagos). No entanto, a expressão destes marcadores não é estritamente restrita a um único tipo de células em lesões ateroscleróticas devido a plasticidade das linhagens múltiplas incluindo SMC, células endoteliais e células mieloides¹². Em particular, a identificação inequívoca do SMC dentro lesão aterosclerótica era virtualmente impossível até a última década por causa da propriedade dessas células dedifferentiate e reprimir seus genes de marcador de linhagem específica (um processo conhecido como fenotípica de comutação) em vasos feridos ou doentes¹³. Esta limitação na identificação de SMC foi contornada pelo desenvolvimento da linhagem rastreamento^{7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24}. consiste de rotulagem permanentemente a SMC e seus descendentes para controlar seu destino e evolução fenotípica durante a progressão da aterosclerose, usando uma combinação da expressão da Cre recombinase conduzido pelos promotores de SMC-específicos (i.e., Myh11^{7,15,17,18,19,20,21,22,23 ,} E ²⁴, Acta2^25,26 ,^, SM22α¹⁴¹⁶) e a ativação de repórteres (por exemplo, as proteínas fluorescentes, β-galactosidase) [revisto em bentson e Majesky 2018²⁷]. Em um dos primeiros estudos empregando o rastreamento de linhagem SMC fora da configuração de embriogênese, Speer et al¹⁴ forneceu evidências que SMC pode modular seu fenótipo e transdifferentiate em células de chondrogenic durante a calcificação vascular, usando um modelo de rastreamento de linhagem do SM22α Cre R26R LacZ. Embora estes estudos pioneira em rastreamento de linhagem SMC, eram parcialmente ambíguas em que qualquer SM22α expressando determinado-o SMC no cenário da doença seria rotulado pelo repórter. Esta limitação foi desviada pelo desenvolvimento e uso de tamoxifeno-inducible Cre ERT/LoxP permitindo um controle temporal de rotulagem de célula. Rotulagem de célula ocorre exclusivamente durante o parto de tamoxifeno e devem restringir-se a célula expressar o promotor específico tipo celular dirigindo a expressão Cre ERT aquando da exposição de tamoxifeno, evitando o rastreamento de tipos alternativos de célula ativando Cre na definição de progressão da doença. Para rastreamento de linhagem de SMC em aterosclerose, o tamoxifeno-inducible Myh11- Cre/ERT2 transgene associado com repórteres fluorescentes (eYFP^{7,15,17,18 , 21}, mTmG^19,25, confete^20,22,23 , para estudos de expansão clonal) tem demonstrado uma notável eficiência e especificidade na rotulagem de SMC e tem foi usado para as populações de SMC de mapa de destino em lesões ateroscleróticas em estudos recentes. Importante, estes estudos revelaram que: 1) 80% de SMC avançada dentro fazer lesões ateroscleróticas não expressam qualquer convencional SMC marcadores (ACTA2, MYH11) utilizados na análise reagidos e, portanto, que têm sido identificados incorretamente sem rastreamento de linhagem ¹⁷. o; 2) subconjuntos de SMC expressam marcadores tipos de células alternativo, incluindo os marcadores de macrófagos ou células-tronco mesenquimais marcadores^16,17,19; e 3) SMC investir e preencher a lesão aterosclerótica pela expansão oligoclonais e clones SMC retêm plasticidade a transição para populações fenotipicamente diferentes^20,23. Para resumir, é agora claro que células musculares lisas apresentam uma notável diversidade fenotípica em lesões ateroscleróticas e podem ter funções benéficas ou prejudiciais na patogênese da lesão dependendo da natureza de suas transições fenotípicas. Estas descobertas representam uma notável nova avenida terapêutica para o direcionamento de SMC athero-promoção fenotípicas transições no estágio final de aterosclerose.

Neste documento, propomos um protocolo padronizado para analisar o estágio final de lesões ateroscleróticas murino incluindo métodos sistemáticos para dissecação animal, incorporação, corte, coloração e quantificação das lesões da artéria Braquiocefálica. Para determinar o efeito da inibição da interleucina-1 β no destino SMC e fenótipo, usamos a linhagem SMC ApoE^{- / -} ratos alimentados com uma dieta ocidental por 18 semanas antes de receber injeções semanais de um anticorpo anti-IL1β ou correspondência do isotipo IgG controle de rastreamento.

Procedimentos, manipulação e criação de animais foram aprovados pelo Comitê de utilização e cuidados animais institucionais da Universidade de Pittsburgh e a Universidade da Virgínia.

1. geração de ratos de rastreamento de linhagem SMC

1. Raça de machos - Cre/ERT2 Myh11²⁸ (laboratório Jackson; #019079) com fêmeas R26R-EYFP (laboratório Jackson; #006148) para obter Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ +} machos.
2. Reproduzem o Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ +} machos com ApoE^{- / -} ratos fêmeas (laboratório Jackson; #002052). Atravessar a progenitura e selecione por genotipagem Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ +} ApoE^{- / -} macho e R26R-EYFP^{+ +} ApoE^{- / -} ratos fêmeas como criadores de finais. Clipe de caudas e realizar genotipagem em littermates. Todos os ratos masculinos devem ser Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ +} ApoE^{- / -} e pode ser usado como ratos experimentais (Figura 1A).
   Nota: Os protocolos de genotipagem podem ser encontrados no site do laboratório de Jackson. O transgene de Cre/ERT2 Myh11 está localizado no cromossomo Y, impedindo o uso de fêmeas. Outros sistemas de rastreamento de linhagem podem ser usados, mas este sistema é até à data a estratégia de rastreamento de linhagem mais confiável para o mapa do destino SMC na aterosclerose.

2. músculo liso célula linhagem de rastreamento do mouse dieta e tratamentos

1. Tem macho Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ +} ApoE^{- / -} ratos recebem uma série de injeções de tamoxifeno 1 mg de seis a oito semanas de idade para rotular permanentemente Myh11⁺ SMC com YFP e para controlar o seu destino (Figura 1 ).
   1. Aqueça o óleo de amendoim a 55 ° C.
   2. Adicione o tamoxifeno em óleo de amendoim pré-aquecido para preparar uma solução a 10 mg/mL e incubar a 55 ° C até a dissolução completa do tamoxifeno.
   3. Realize uma injeção intraperitoneal com 0,1 mL de solução de tamoxifeno 10 mg/mL para uma série de dez injeções durante duas semanas.
      Nota: O tamoxifeno é um agente biológico e deve ser manuseado com cuidado.
2. Cinco a sete dias após a última injecção com tamoxifeno, substituir a dieta de comida com alto teor de gordura dieta (por exemplo, dieta ocidental; 42% kcal de gordura; 0,2% colesterol total) para uma duração de 18 semanas para permitir o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas avançadas, que consistentemente desenvolve em várias camas vasculares, incluindo o arco aórtico, raiz da aorta, artéria Braquiocefálica e a aorta abdominal.
3. Com 18 semanas de alto teor de gordura dieta alimentar, começam a intervenção terapêutica para a duração desejada (Figura 1B).
   Nota: Como exemplo, realizamos semanais injeções intraperitoneal com um anticorpo anti-IL1β ou um correspondência isotipo IgG controle entre 18 e 26 semanas de dieta de alta gordura.
4. Remova o alimento aos ratos rápidos para 8 a 16 h antes da colheita para fazerem leituras precisas de triglicéridos e colesterol do plasma de tecido.

3. a colheita da artéria Braquiocefálica (BCA)

1. Eutanásia animal deve seguir regulamentos e requisitos de cuidado Animal e Comissão de utilização (ACUC). Abater os ratos experimentais por asfixia de CO₂ por cerca de 5 minutos e verifique se morte por pitada de dedo do pé.
2. Pesar o mouse e coletar o sangue.
   1. Pesar o mouse
   2. Pulverize o lado ventral do mouse com 70% etanol
   3. Realizar punção cardíaca, inserindo uma agulha 25g ligada a uma seringa de 1 mL no ventrículo do lado esquerdo da cavidade torácica. 0,1 a 1 mL de sangue pode ser coletado.
   4. Transferir o sangue para um tubo de vácuo EDTA, nivelando a seringa e colocar o tubo em um balancim ou rotador por 10-15 min.
   5. Transferir o sangue para um tubo de 1,5 mL e centrifugar por 10 minutos 250 x g a 4 ° C. Cuidadosamente retirar a fase superior do plasma com uma pipeta e pontas adequadas e transfira para um tubo novo. Armazenar a-20 ° C antes da medição de colesterol e triglicérides.
      Nota: o sangue total pode ser usado para estudos adicionais, incluindo a contagem de células do sangue e outros componentes do sangue incluindo citocinas ou célula imune de criação de perfil.
3. Faça uma incisão de aproximadamente 2 cm na pele no abdômen médio usando tesouras e puxar a pele para expor a cavidade abdominal. Corte o peritônio até o esterno sem danificar os tecidos. Fazer dois cortes na linha axilar média pelo tórax, tomando cuidado para não danificar o coração e os pulmões.
4. Levante o esterno com pinças e cortar o diafragma para expor parcialmente o coração. Se o coração não é facilmente acessível, corte afastado da caixa torácica suficiente para atingir o átrio direito.
5. Perfundir o mouse com um sistema de perfusão de gravidade(Figura 2). Instale o sistema de perfusão de gravidade tal que a pressão do fluido da perfusão é equivalente à pressão média de sangue murino (Figura 2B). Este sistema permite a consistência na perfusão e ambos mantém os navio morfologia e flushes células vermelhas do sangue.
   Nota: Como referência, camundongos C57Bl6 tem uma pressão arterial fisiológica entre 120 mmHg (pressão arterial sistólica média) e 70 mmHg (pressão arterial diastólica média)^29,30. Pressão arterial média de pressão sistólica e diastólica pode variar com base genética do rato.
   1. Conecte um 23 ou 25G borboleta agulha para o sistema de perfusão de gravidade e executar tampão fosfato salino (PBS) através da agulha para expelir o ar dos tubos. Insira a agulha no ventrículo esquerdo e fixe a agulha no lugar. Usando uma tesoura de íris, faça uma pequena incisão (< 2 mm) para o átrio direito ou a aorta ascendente.
   2. Perfundir com 5 mL de PBS, em seguida 10 mL de solução de paraformaldeído (PFA) de 4%, em seguida 5 mL de PBS. Use solução PFA PBS e de 4% à temperatura ambiente.
   3. Recolher os tecidos de interesse (por exemplo, fígado, pulmão, baço) e colocá-los na solução PFA de 4%.
6. Expor o BCA
   1. Limpe a área do pescoço, removendo a pele e glândulas salivares.
   2. Execute um corte para baixo a linha do esterno através do manúbrio usando a tesoura. Cuidado que a tesoura fique perto atrás do esterno para não danificar a vasculatura estreitamente localizada abaixo do esterno. Puxe ambos os lados da caixa torácica com fórceps para abrir completamente a cavidade torácica. Carótidas devem ser parcialmente visíveis.
   3. Limpar puxando os músculos e tecido conjuntivo e remover a gordura com uma pinça fina até a carótida direita, Braquiocefálica artéria subclávia bifurcação e o arco aórtico são limpos e isolados da envolvente de tecido conjuntivo e gordura (Figura 2C).
7. Remover o BCA
   1. Usando a pinça, pegue a carótida direita abaixo sua bifurcação e fazer um corte inicial acima a pinça (Figura 2D).
   2. Ainda segurando a carótida, faça um segundo corte através da artéria subclávia. Os dois cortes finais são através da aorta, em ambos os lados da artéria Braquiocefálica (Figura 2D).
   3. Colete outros tecidos vasculares de interesse (por exemplo, aorta abdominal, parte superior do coração que contém a raiz aórtica).
   4. Coloque o BCA e outros tecidos em solução PFA 4% durante a noite em temperatura ambiente.
      Nota: O tempo de fixação deve ser mantido consistente ao longo do estudo.

4. tecido transformação e seccionamento

1. Retire o tecido do 4% PFA e coloque em uma fita de tecido rotulado(Figura 3). Uso de almofadas de espuma na gaveta para garantir que o tecido retém sua orientação e permanece na gaveta através do passo de processamento (Figura 3B). Feche as fitas e mergulhe em etanol a 70% até tecido processamento (24 a 72 h).
   1. Processo BCA e outros tecidos coletaram para histológica e imunofluorescência de coloração como segue (exemplo de procedimento de rotina durante a noite usando um processador com penetração vácuo): 10% neutro tamponado formalina por 30 min à temperatura ambiente (2x), 75% etanol para 60 minutos a 30 ° C (1x), etanol a 90% para 60 minutos a 30 ° C (1x), etanol a 95% para 60 min a 30 ° C (1x), 100% de etanol para 60 minutos a 30 ° C (3x), xileno por 60 min a 30 ° C (3 x) e a cera de parafina para 80 min a 62 ° C (3x).
2. Incorpore o BCA verticalmente, com o arco aórtico mais próximo à face do bloco (Figura 3C).
3. Corte o bloco de parafina em um micrótomo rotativo (10 µm de espessura) até atingir o tecido incorporado.
4. Uma vez que o tecido é visível, examine uma seção sob um microscópio para determinar a posição. Se o arco aórtico é ainda visível, remova até dez 10 µm seções ao mesmo tempo, examinando uma seção em cada intervalo.
5. Quando o arco aórtico tem sido seccionado através de e a artéria Braquiocefálica é visível, ajuste a orientação do bloco para posicionar o tecido completamente perpendicular a lâmina do micrótomo.
6. Corte o BCA em uma espessura de 10 µm. Nesse ponto, todas as seções são coletadas em série com três seções por slide. Colete até atingir a bifurcação subclávia (Figura 3-D).
   Nota: É importante cortar o BCA em uma espessura de 10 µm para aquisição de imagens confocal de z-pilha subsequentes e única célula contando. Esta espessura permitirá que a avaliação rigorosa e não-co-fundadora da associação entre um único núcleo e citoplasma ou membrana coloração embora a profundidade do corte transversal.

5. imunofluorescência coloração

Nota: Uma caracterização completa de lesões ateroscleróticas inclui avaliação dos parâmetros morfológicos e índices de placa estabilidade ou instabilidade e composição celular que não será o foco do presente protocolo. Morfologia da lesão, conteúdo de colágeno e intraplaque hemorragia podem ser analisados pelo Movat^7,17, PicroSirius vermelho ^7,31, Ter119 coloração ^7,18, respectivamente. Aqui, descrevemos o protocolo para analisar a composição celular de lesões.

1. A incubar nas seguintes soluções à temperatura sob uma capa de química: xileno por 5 min (2x), 100% de etanol por 5 min (2x), etanol a 95% por 5 min (2x), etanol a 70% por 5 min (2 x) e H2O deionizada (diH₂O) por 5 min (2x).
2. Incube em solução de recuperação de antígeno de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Com ácido cítrico baseado desmascarar solução do antígeno (ver Tabela de materiais), diluir 3 mL de solução em 320 mL de diH₂lugar O. os slides em um reservatório de coloração e preencher a parte superior com a solução de recuperação de antígeno preparado.
   2. Preencha qualquer vazios slots no rack slide com slides em branco para garantir o mesmo aquecimento. Cubra o recipiente com uma tampa para permitir que a solução de recuperação de antígeno ferver sem evaporação.
   3. Aqueça os slides no microondas por 20 min em aproximadamente 675-700 watts. Confira os slides regularmente e substituir evaporado líquido com diH₂O tal que as seções permanecem submersos em solução de desmascarar em todos os momentos.
   4. Permita slides arrefecer na solução por 1h à temperatura ambiente.
3. Dissolva 6 g de gelatina de pele de peixe (FSG) em 1 L de PBS. PBS/FSG é usado como tampão de lavagem. Prepare uma solução de bloqueio do soro normal de 10% em PBS/FSG.
   Nota: Gelatina de pele de peixe é usada na preparação da tampão de bloqueio. FSG não contém proteínas de soro que podem reação cruzada com anticorpos de mamíferos, minimizando o ruído de fundo. No entanto, outra opção de bloqueio deve ser preferencial com sistemas de deteção de biotina como FSG contém biotina endógena. O tipo de soro normal utilizado baseia-se o anticorpo secundário usado. Quando são utilizados anticorpos secundários de burro, soro de cavalo normal deverá ser seleccionado para bloqueio e anticorpo diluições.
4. Incube em PBS durante 5 min à temperatura ambiente. Seções de círculo do tecido com uma caneta hidrofóbica. Cobrir as seções com o tampão de bloqueio soro normal/PBS/FSG por 1h à temperatura ambiente. Prepare a solução de anticorpo primário no soro normal/PBS/FSG durante esta etapa, enquanto os tecidos estão bloqueando.
5. Incube com anticorpos primários diluídos em soro de PBS/FSG/normal durante a noite a 4 ° C, em uma câmara de umidade. Uma seção por slide deve ser incubada com uma mistura de anticorpos IgG de controle na mesma concentração como os anticorpos primários de controle para a especificidade do anticorpo primário.
6. Lave os slides como segue à temperatura ambiente: PBS/FSG por 5 min (3x), então PBS por 5 min (1x).
7. Incube com anticorpos secundarios conjugados fluoróforo (ver Tabela de materiais) e diamidino-2-phenylindole (DAPI) núcleo counterstaining diluída em soro de PBS/FSG/normal por 1h à temperatura ambiente. Protege os slides da luz.
8. Lave slides conforme descrito na etapa 5.6.
9. Montagem de slides usando a mídia de montagem apropriada para fluorescência (ver Tabela de materiais).

6. Confocal da microscopia

Nota: O uso de um microscópio confocal e aquisição de z-pilha é essencial para a contagem de célula única.

1. Definir parâmetros de aquisição a ser usado ao longo do estudo: imagem resolução (1024 x 1024 ou 2048 x 2048 pixels); Caminho óptico e número de canais, que são uma função da combinação de anticorpos secundários selecionado; velocidade de digitalização (recomendado velocidade de digitalização: 7-8); e o canal de interferência diferencial (DIC) de contraste.
2. Usando seções manchadas com o controle de IgG e anticorpos primários, defina a sensibilidade do detector, poder do laser e o deslocamento para cada canal individual. O controle de IgG é usado para minimizar o sinal de fundo.
3. Configure as posições superiores e inferiores para aquisição de z-pilha. Predeterminar a espessura e o número de pilhas para adquirir. Esses parâmetros devem permanecer consistentes ao longo do estudo.
   Nota: Recomendamos pilhas de 8 a 10 de imagem de 1 µm de espessura. Fique consistente no número de pilhas fotografada ao longo do estudo.
4. Cortes histologicos imagem manchada com os anticorpos primários e IgG controle para todos os canais incluindo DIC.
5. Rotule a pelo menos uma imagem com uma barra de escala para calibração de imagem durante a contagem de célula única.

7. única célula contando

1. Instalar e abrir o ImageJ. Se necessário, baixar Plugins na seção Download > entrada/saída do ImageJ site para abrir o arquivo de imagem gerado dependendo do formato das imagens geradas pelo microscópio confocal.
2. Abra o arquivo de imagem no ImageJ.
3. Calibre a imagem com uma escala de referência bar usando a imagem gerada em 6.6.
4. Delinear a região de interesse na qual célula única contagem será executada usando o canal DIC (Figura 4).
   Nota: Uma região pode ser delineada por vez. Dependendo das perguntas experimentais, contando com única célula pode ser executado na área toda lesão (ver 7.3.1) e/ou em um sublocation da lesão. Por exemplo, investigação da área de tampa fibrosa (ver 7.3.2) é particularmente relevante, desde que sua composição celular é um índice importante de propensão de lesão a ruptura.
   1. Delinear a área de lesão, seguindo a fronteira do lúmen (Figura 4A; setas brancas) e a interna elástica lâmina (Figura 4A; setas amarelas) visível na imagem DIC.
   2. Para análise da área de tampa fibrosa, determinar a fronteira distante de 30 µm do lúmen e traçar a fronteira ( Figura 4B-D).
      Nota: A área de tampa fibrosa classicamente é definida como a região rica em células ACTA2 + e colágeno Português do lúmen (Figura 4B). O enriquecimento em ACTA2 + celular e colágeno desempenha um papel crítico na estabilidade da lesão. Estudos anteriores determinaram que a área de tampa fibrosa rica de célula ACTA2 + em média uma espessura de 30 µm do lúmen em SMC-linhagem rastreamento ApoE^{- / -} ratos alimentados com uma dieta high-fat para 18 a 26 semanas (Figura 4C). Assim, meticulosa caracterização dos efeitos da manipulação genética ou tratamento farmacológico na composição fibrosa cap área celular é extremamente relevante.
5. Abra o painel de Ferramentas de canais (imagem > cor > ferramentas de canal) e coloração de pseudo cor a diferentes canais (Figura 5A; caixa 1).
6. Mesclar os canais de cor (imagem > cor > Mesclar cores) (Figura 5A; caixa 2). Todos os canais devem estar visíveis na mesma imagem (Figura 5B). Ligar e desligar os canais de cores individuais usando o painel de Ferramentas do canal (Figura 5A; caixa 1).
7. Configure a ferramenta de contagem.
   1. Clique com o botão direito no ícone na barra de ferramentas Counting (Figura 5C; caixa 1) e selecione a Ferramenta de multi-ponto.
   2. Clique duas vezes no ícone do mesmo para abrir o painel Ferramenta ponto (Figura 5C; caixa 2).
   3. Selecione o tipo e o tamanho dos itens usados para contar as células.
   4. Verifique Mostrar tudo.
8. Ligar o canal DAPI somente no painel de Ferramentas do canal e seleccione o canal de contador 0 (Figura 5C; caixa 3). Clique em núcleos individuais que serão marcados (por exemplo, amarelo pontos em Figura 5C-D). Z-pilhas de rolagem para contar todos os núcleos corados na região de interesse. O número de eventos é indicado abaixo o canal de contador no painel de Ferramenta ponto (Figura 5C; caixa 4).
9. Ligue no outro canal de coloração (por exemplo, eYFP coloração). Selecione o canal de balcão 1. Clique em células no qual há um colocalization entre DAPI e coloração. Para a coloração citoplasmática, selecione células para com coloração circunda o núcleo em toda a profundidade do núcleo (verificar várias pilhas de z).
10. Repito, modificando a coloração combinações e selecionando novos canais de contador para contar as populações de células de interesse. Cor cada ponto representa uma população de células diferentes (Figura 5-D). Resultados podem ser expressa como o número de células para o número total de DAPI ou número de células para a área da região.

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} ratos foram injetados com tamoxifeno entre seis e oito semanas de idade, antes sendo alimentados com uma dieta de alta gordura. Com 18 semanas de alta gordura dieta alimentar, dois grupos de oito ratos foram tratados semanalmente com um anticorpo anti-IL-1 β anticorpo monoclonal de rato ou um controle de IgG isotipo-combinadas em 10 mg/kg para 8 semanas (Figura 1)⁷. Ratos foram sacrificados e pintados com uma solução de PFA-PBS de 4%. Braquiocefálica artérias foram dissecadas, processadas e seccionadas conforme descrito acima (Figura 2 e Figura 3).

Após coloração imunofluorescência com anticorpos visando o repórter de rastreamento de linhagem (YFP) e marcadores fenotípicos (ACTA2, LGALS3, RUNX2), espessura de 8-10 µm de BCA seções transversais foi fotografada usando um microscópio confocal. Imagens de cada coloração individual DAPI (coloração nuclear) e DIC foram adquiridas. Delimitação das regiões de interesse para uma única célula contando (lesão, tampa fibrosa) foi realizada utilizando imagens DIC (Figura 4). Única célula contando determinar a abundância de diferentes populações de SMC-derivado foi realizada usando o ImageJ (Figura 5).

Apresentamos dois coloração imunofluorescente representativa e único contando a avaliação dos efeitos de inibição de IL-1 β na composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas. Primeiro, a coloração foi feita para o repórter de rastreamento de linhagem SMC YFP, o marcador SMC ACTA2 e o marcador de macrófagos LGALS3 em seções transversais em dois locais diferentes de BCA (480 µm e 780 µm do arco aórtico) (Figura 6). Foram realizadas análise de contagem única célula na região de tampa fibrosa desses cross-section e foram encontradas diferenças notáveis na composição celular da área tampão fibroso entre ratos tratados com o anticorpo anti-IL-1 β e ratos tratadocom com o correspondência do isotipo IgG controle (Figura 6A). Inibição da IL-1 β foi associada com uma diminuição YFP + SMC e aumento de células LGALS3 + (Figura 6B). Sobre os fenótipos de populações de SMC, foi observada uma diminuição no número de YFP + ACTA2 + SMC, Considerando que o número relativo de macrófagos SMC-derivado (YFP + LGALS3 +) aumentou significativamente em ambos os locais de BCA (Figura 6C).

Finalmente, nós investigamos o efeito da inibição de IL-1 β na transição SMC fenotípica em células chondrogenic. Esta transição fenotípica é um importante driver de calcificação vascular, a característica principal do tarde-estágio aterosclerose^14,32,33. Secções transversais BCA estavam manchadas para o repórter de rastreamento de linhagem SMC YFP, o marcador de osteochondrogenic RUNX2 e o marcador para macrófagos LGALS3 (Figura 7A). A abundância e a origem das células RUNX2 + chondrogenic foram caracterizados dentro da área de lesão em nossos dois grupos experimentais. Nós achamos que a inibição da IL-1 β não teve impacto o número total de células RUNX2 + no interior da lesão, nem a proporção de SMC-derivado (YFP + RUNX2 +) e macrófago-derivado (YFP-LGALS3 + RUNX2 +) chondrogenic células (Figura 7-B).

Figura 1 : Ratos de rastreamento de linhagem de células de estudos de intervenção no músculo liso. (A) representação esquemática da - Cre Myh11/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} tamoxifeno-inducible SMC linhagem específica rastreamento modelo do rato. Tratamento com tamoxifeno induz a recombinação do locus R26R-YFP e a excisão de um codão STOP e a expressão permanente de YFP pela SMC. (B) esquema de intervenção estuda em qual Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} ratos alimentados com uma dieta ocidental para 18 semanas foram injetadas semanalmente com o anticorpo de IL-1 β ou um anticorpo de controle de IgG isotipo-combinadas em uma concentração de 10 mg / kg por 8 semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Dissecação da artéria Braquiocefálica. (A) diagrama esquemático de um sistema de perfusão conduzido de gravidade. O sistema está configurado a uma altura precisa, permitindo que a perfusão a uma pressão perto da pressão arterial sistólica média em camundongos. A pressão varia ligeiramente com altura de volume como líquido é usado durante a perfusão entre altura h₁ e h₂. (B) equação para cálculo da pressão de fluidos estáticos e determinação da altura para alcançar uma pressão de perfusão igual a C57Bl6 rato média pressão arterial sistólica. (C) fotos da aorta proximal e ramificação das artérias C57Bl6 rato alimentados com uma dieta de comida (foto à esquerda) e Apoe^{- / -} mouse alimentados com uma dieta de alta gordura por 26 semanas (foto direita). O asterisco indica a presença de lesões ateroscleróticas. (D) esquema da aorta proximal e artérias ramificação. Setas vermelhas representam cortes para isolamento da carótida direita e artéria Braquiocefálica isolamento e números indicam a ordem dos cortes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Processamento do tecido, incorporação e seccionamento. (A) fotografia de uma gaveta de encastre com tecido BCA. O BCA é posicionado em uma almofada de espuma. (B) Zoom-in de BCA posicionado sobre a almofada de espuma. O BCA é orientado com o arco aórtico próximo a parte de rótulo de fita e a carótida esticado verticalmente. Barra de escala: 1 cm. (C) esquema de parafina bloquear após a incorporação da artéria Braquiocefálica. (D) o esquema de slides seriais com 10 µm de espessura seriais seções com a indicação da distância do arco aórtico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Delimitação da área de tampa fibrosa e lesão aterosclerótica. (A) micrografias representativas de DIC imagem lesão aterosclerótica em artéria Braquiocefálica secções transversais de Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -}. O luminal e as bordas da lâmina elástica interna são localizadas por branco e amarelo flechas, respectivamente (painel esquerdo). A área de lesão é delimitada por uma barra de escala de linha tracejada (painel direito): 100 µm. (B) representante micrografias de DIC e ACTA2 de coloração. Dobro-cabeça setas mostram a espessura do ACTA2 a coloração dentro da área de Português do lúmen definindo a área de tampa fibrosa. (C) quantificação da Viajavamos ACTA2⁺ espessura em Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} alimentados uma dieta high-fat para 18, 21 e 26 semanas. Usando esta cepa de ratos, a tampa fibrosa tem uma espessura média de 25-30 µm em lesões ateroscleróticas de avanço. Os resultados são expressos em média ± SEM. (D) delimitação de uma área de tampa fibrosa espessa fixo 30 µm para a contagem de célula única. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Única célula contagem usando o ImageJ. Capturas de tela ilustrando etapas-chave de uma única célula contando com ImageJ imagens adquiridas pela microscopia confocal. Canal (A) cada coloração individual e individual z-pilha são visíveis ao rolar c: e z: barras na parte inferior da imagem. Canais de coloração são pseudo coloridas usando o painel de canal (1) canais de coloração (YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI para coloração nuclear e DIC) são mesclados usando o painel de mesclagem Channel (2). (B) resultados do canal mesclagem para YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI e DIC. (C) núcleo contando com base na coloração de DAPI usando o ícone de contagem (1) e o painel ferramenta de ponto (2). Um canal diferente do contador é usado para cada população celular (3). O número de eventos contados é indicado abaixo do canal de contador (4). Retângulo branco: região alargada à direita. (D) a imagem representativa da única célula contagem dentro da área de tampa fibrosa (linha tracejada) para várias populações de células, incluindo DAPI (pontos amarelos), células YFP⁺ (magenta pontos), YFP^–LGALS3⁺ células (ciano pontos), YFP⁺LGALS3⁺ células (pontos laranja), YFP⁺ACTA2⁺ células (pontos verdes) e YFP^–ACTA2⁺ células (pontos azuis escuros). Retângulo branco: região alargada à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Caracterização dos efeitos da inibição de IL-1 β sobre a composição celular da área em dois locais distintos do BCA da linhagem SMC rastreamento Apoe-/-ratos fibroso cap. (A) BCA cruzar seções em 480 µm e 780 µm da aorta de ratos tratados com o anticorpo de IL-1 β ou o controle de IgG, como mostrado na Figura 1 foram corados por YFP, LGALS3, e DAPI (coloração nuclear) e a seção foi fotografada por DIC. Canais de imunofluorescência foram fundidas (parte inferior direito painéis). As linhas tracejadas delineiam as regiões tampa fibrosa. Barras de escala: 100 µm. (B) célula única contagem revela que a inibição da IL-1 β é associada com uma diminuição significativa nas células YFP⁺ e um aumento na LGALS3⁺ células dentro da área de tampa fibrosa. População, uma diminuição YFP⁺ACTA2⁺ e aumento da YFP⁺LGALS3⁺ de células C) dentro YFP⁺ populações são observadas. Os resultados são expressos em média ± análise estatística SEM.: unpaired t-teste de múltipla. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Efeito de inibição de IL-1 β no número de RUNX2 + chondrogenic células com lesões ateroscleróticas avançadas. A) BCA seções transversais estão manchadas para YFP, LGALS3, RUNX2 e DAPI (coloração nuclear), e todos os canais foram fundidos (painéis de fundo). As linhas tracejadas delineiam a área de lesão. Barras de escala: 100 µm. B) única célula contagem mostra que a inibição da IL-1 β não afeta o número total de RUNX2⁺ células dentro da lesão nem a proporção de RUNX2⁺ células de origem SMC (YFP⁺RUNX2⁺; YFP⁺LGALS3⁺RUNX2⁺) e origem mieloide (YFP^–LGALS3⁺RUNX2⁺). Os resultados são expressos como média análise estatística SEM.: Unpaired t-teste de múltipla. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Apesar de décadas de pesquisa e avanços técnicos em estudar a aterosclerose, o campo tem uma história decepcionante de traduzir as descobertas científicas para terapias clínicas^34,35. Este fenômeno pode ser explicado em parte por discrepâncias em modelos animais, desenhos experimentais e análises de lesão. Aqui, descrevemos um pipeline experimental que usamos para analisar a composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas usando a linhagem de ratos rastreamento⁷. Este método permite uma investigação meticulosa da célula destino mapeamento e fenotipagem, que são parâmetros-chave controlados por mecanismos potenciais em joga em lesões ateroscleróticas avançadas.

O modelo de rato de rastreamento SMC-linhagem é uma ferramenta poderosa para controlar com precisão o destino e modulações fenotípicas desta linhagem e sua contribuição para a patogênese da aterosclerose. O tamoxifeno-inducible Cre-loxP sistema permite rotular de maduro SMC vascular expressando MYH11 antes do início da aterosclerose. Usando este sistema de evidências convincentes demonstrou que o ateroma é altamente plástica e SMC vascular pode sofrer mudança fenotípica, perdendo seu fenótipo contrátil e marcadores específicos SMC, proliferação, migração e mesmo transdifferentiating em macrófagos, como células de^17,18. No presente protocolo, mostramos como rastreamento de linhagem deteção e coloração imunofluorescente para marcadores de interesse pode ser integrado para determinar precisamente fenotípicas transições realizadas pela SMC e sua frequência relativa entre outras populações de SMC.

Esta metodologia é altamente complementar com outros ensaios frequentemente realizados no campo. Em primeiro lugar, a avaliação da carga de lesão aterosclerótica pelo rosto pt aórtica preparações combinadas com lipídios coloração pelo Sudan IV é amplamente utilizada devido à sua conveniência e velocidade. No entanto, é uma medida inadequada da chaves parâmetros morfológicos como tamanho da lesão, tamanho do lúmen e remodelação do navio. Coloração da face do pt aórtica preparação pelo Sudão IV para visualizar a deposição de lipídios pode ser usada para quantificar a lesão relativa a área dentro da aorta, mas pode fornecer inconsistente coloração de lesões, como somente o componente de lipídios neutros é visualizado enquanto regiões ocupadas por outros constituintes, tais como a matriz extracelular, são geralmente negligenciadas⁸. Além disso, manchando o rosto do pt é incapaz de informar sobre a morfologia da lesão e não conseguem distinguir entre estrias gordas e lesões avançadas. Morfologia da embarcação é um importante parâmetro utilizado para avaliar o risco de palco e ruptura aterosclerose, incluindo o tamanho da lesão, diâmetro do lúmen, embarcação remodelação^7,36,37. Essas análises exigem a conservação da morfologia navio para quantificação adequada. Importante, protocolos para a investigação de parâmetros morfológicos grandemente se sobrepõem com o protocolo detalhado aqui. Em particular, eles contam com o uso de um sistema de perfusão vascular orientada por gravidade para PBS e perfusão fixador para fornecer maior coerência na pressão aplicada. O sistema de infiltração movido a gravidade garante um fluxo constante velocidade e pressão entre cada rato independente e evita a inconsistência de perfusão de orientado a força manual entre experimentos independentes ou pesquisadores. O sistema de perfusão de gravidade deve ser configurado para induzir a perfusão a uma pressão perto da média pressão arterial murino (70-120 mmHg). Em segundo lugar, nós fornecemos um método padronizado e sistemático de incorporação e de corte para a artéria Braquiocefálica. Definindo o local de início de seccionamento e quantificar a área de lesão em vários locais ao longo da artéria braquiocefálica, podemos limitar a variação aleatória que vem com amostragem limitada.

Citometria de fluxo é altamente complementares com coloração imunofluorescente acoplado com a contagem de célula única outra técnica que tem sido amplamente utilizada para quantificar as populações de células dentro de lesões ateroscleróticas³⁸. Consiste a digestão da aorta de rato e rotulagem das células lançadas com anticorpos fluorescentes. Citometria de fluxo oferece uma análise quantitativa das populações celulares presentes na aorta. No entanto, como todas as tecnologias, citometria de fluxo tem limitações. Apesar do benefício distinto da montagem de uma grande variedade de marcadores simultâneas, há uma completa perda de resolução espacial, e torna-se claro se uma população de células é enriquecida com a tampa fibrosa ou o núcleo necrótico. Além disso, há um risco de efeito de diluição, desde que citometria de fluxo requer um grande número de células e muitas vezes não se concentrar apenas em áreas ateroscleróticas. Por esta razão, imunofluorescência e citometria de fluxo podem ser usados de forma complementar, para permitir a criação de perfil dimensional elevada e localização da lesão.

Finalmente, o protocolo está voltado para a quantificação das populações de SMC no BCA avançado lesão usando cortes histologicos paraformaldeído-fixo e parafina. No entanto, este protocolo pode ser usado para investigar outros leitos vasculares incluindo a raiz aórtica ou na aorta abdominal, dois territórios vasculares à desenvolvimento de aterosclerose. Sistemática de processamento e corte da raiz aórtica foram bem descritas anteriormente^8,39. Como a aterosclerose se desenvolve em diferentes locais e a manipulação genética ou intervenção terapêutica não-homogênea pode afetar esses sites²¹, é importante investigar como muitos leitos vasculares possível tirar conclusões precisas. A coloração imunofluorescente e única célula contando também podem ser realizadas usando seções congeladas. Isto pode ser necessário devido à incompatibilidade de anticorpos com cortes de parafina. Embora o animal da perfusão e incorporação de tecido serão diferente do presente protocolo, os investigadores podem acompanhar o resto dos procedimentos experimentais descritos aqui.

Concluindo, as técnicas descritas aqui contorno uma abordagem sistemática para análise de populações de células de lesão e fenótipos em estágio final murino aterosclerose. Este protocolo pode servir como um modelo para investigar as populações de lesão pela coloração imunofluorescente em todos os tipos de delineamento experimental, incluindo aterosclerose precoce e tardio, bem como estudos de prevenção e intervenção.

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecemos o centro biológico Imaging (suportado pelo NIH 1S10OD019973-01) da Universidade de Pittsburgh, por sua assistência. Este trabalho foi apoiado por é suportado por concessão de desenvolvimento científico 15SDG25860021 da associação americana do coração para D.G. R.A.B foi apoiada pelo NIH conceder HL136188 F30.