Análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones

Proponemos un protocolo estandarizado para caracterizar la composición celular de etapa tardía las lesiones ateroscleróticas murinas como métodos sistemáticos de disección animal, tejido inclusión, seccionamiento, tinción y análisis de las arterias braquiocefálicas de atheroprone músculo liso células linaje seguimiento ratones.

Aterosclerosis es la principal causa de muerte en todo el mundo y, a pesar de innumerables estudios preclínicos que describe objetivos terapéuticos prometedores, nuevas intervenciones han permanecido esquivas. Esto es probablemente debido, en parte, a una dependencia de modelos preclínicos prevención investigando los efectos de la manipulación genética o tratamientos farmacológicos sobre el desarrollo de aterosclerosis en lugar de la enfermedad establecida. También, resultados de estos estudios son a menudo confusión debido al uso de análisis superficial de la lesión y la falta de caracterización de poblaciones de células de la lesión. Para ayudar a superar estos obstáculos traslacionales, proponemos una mayor dependencia en los modelos de intervención que emplean la investigación de los cambios en la composición celular a nivel unicelular por tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal. Para ello, se describe un protocolo para las pruebas de un supuesta agente terapéutico en un modelo murino de la intervención como un enfoque sistemático para la disección animal, inclusión, corte, coloración y cuantificación de las lesiones de la arteria braquiocéfala. Además, debido a la diversidad fenotípica de las células dentro de las lesiones ateroscleróticas de la tarde-etapa, describimos la importancia del uso de sistemas de linaje de la célula-específica, inducible calco ratón y cómo esto se puede aprovechar para la caracterización objetiva de poblaciones celulares de la lesión aterosclerótica. Juntos, estas estrategias pueden ayudar a los biólogos vasculares con mayor precisión las intervenciones terapéuticas del modelo y analizar la enfermedad aterosclerótica y que se traducirán en una mayor tasa de éxito en los ensayos clínicos.

La ateroesclerosis es la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo que la mayoría de las enfermedades coronarias, enfermedades de las arterias periféricas y accidente cerebrovascular. Aterosclerosis coronaria de etapa tardía pueden llevar a complicaciones severas, incluyendo la contabilidad de la infracción miocardio casi el 16% del mundo población mortalidad^1,2. Debido a su impacto devastador en la salud pública, se han hecho esfuerzos importantes para descifrar los mecanismos de conducción de progresión de la aterosclerosis, así como para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. Sin embargo, la tasa de probabilidad de aprobación (LOA) de ensayos clínicos para la enfermedad cardiovascular es entre los más bajos en comparación con otros campos clínicos (sólo 8,7% para la fase I)³. Esto puede explicarse en parte por muchas barreras que ateroesclerosis plantea al desarrollo de drogas eficaces incluyendo su naturaleza casi omnipresente, clínicamente silenciosa progresión y heterogeneidad de la enfermedad significativa. Por otra parte, el diseño subóptimo de los estudios preclínicos en animales también puede explicarse por la falta de éxito en la traducción clínica. En concreto, creemos que es necesario implementar estudios de intervención siempre que sea posible investigar la eficacia de estrategias terapéuticas. Además, hay una necesidad crítica para llevar a cabo procedimientos estandarizados para el análisis de la lesión incluyendo caracterización avanzada de composición celular de la etapa tardía de la lesión aterosclerótica phenotyping y asignación de destino.

La gran mayoría de los estudios de aterosclerosis se centrará en modelos de prevención de la aterosclerosis consisten en drogas tratamiento gene manipulación o (golpe de gracia o knock-in) en los ratones jóvenes sanos, antes de la iniciación de la enfermedad y la progresión. Estos estudios han descubierto un gran número de genes y moléculas de señalización que juegan un papel en el desarrollo de aterosclerosis. Sin embargo, la mayoría de estos objetivos no se traducen en terapias eficaces en humanos. De hecho, es difícil extrapolar el efecto de que una terapia tiene en ratones jóvenes saludables a pacientes ancianos con lesiones ateroscleróticas avanzadas. Como tal, la realización de estudios de intervención en la preclínica experimental probablemente proporciona una representación más precisa de la pertinencia y la eficacia de una nueva terapéutica. La idea es apoyada por los efectos sorprendentemente divergentes de inhibición de la citocina proinflamatoria interleukina-1β (IL-1β) cuando emplee una prevención^4,5,6 o intervención estrategia⁷. Diferencias entre prevención y estudios de intervención sugieren que diversos procesos celulares ocurren en diferentes fases de desarrollo de aterosclerosis y destaca el hecho de que están probables que estudios de prevención suficientes para modelar el escenario clínico adecuadamente.

La American Heart Association publicó recientemente una Declaración científica que detalla las recomendaciones para el diseño experimental apropiado procedimiento estandarización, análisis y reporting de ateroesclerosis animal estudios⁸. Se destacan los beneficios y limitaciones de las técnicas predominantes utilizadas en el campo. Por ejemplo, la cara en Sudán IV tinción de la aorta se realiza a menudo como una primera lectura. Aunque cara en tinción de Sudan IV de deposición de lípidos es un método adecuado para la evaluación de la carga global de la placa, es incapaz de distinguir las lesiones de la estría grasa incipiente de lesiones más avanzadas de última etapa. Como tal, la interpretación de la cara en la coloración es a menudo ambigua y superficial⁹. Análisis cuidadoso del tejido secciones utilizando el tamaño de buque, lesión y la luz de parámetros morfológicos y la cuantificación de los índices de estabilidad de la lesión proporciona una comprensión más precisa del efecto de un experimento.

Finalmente, estudios de histopatología humana han sugerido que la composición celular es un mejor predictor de la ruptura que el tamaño de la lesión, con pobres de lesiones en células de músculo liso (SMC) y ricos en macrófagos, siendo más susceptibles a la ruptura^{10, 11}. Estas observaciones se basaron en coloración para marcadores clásicamente utilizados para la identificación de la célula (es decir, ACTA2 para SMC o LGALS3 CD68 de macrófagos). Sin embargo, la expresión de estos marcadores no está estrictamente restringida a un solo tipo de células en las lesiones ateroscleróticas debido a la plasticidad de los linajes múltiples incluyendo SMC, células endoteliales y células mieloides¹². En particular, la identificación inequívoca del SMC en la lesión aterosclerótica fue prácticamente imposible hasta la última década debido a la característica de estas células para dedifferentiate y reprimir sus genes marcador de linaje específico (un proceso denominado fenotípica de la conmutación) en¹³de los vasos lesionados o enfermos. Esta limitación en la identificación de SMC ha sido burlada por el desarrollo del linaje seguimiento^{7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24}. se compone de etiquetado permanentemente SMC y sus crías para seguir su destino y evolución fenotípica durante la progresión de aterosclerosis mediante la combinación de la expresión del recombinase de Cre impulsado por promotores específicos de SMC (es decir, Myh11^{7,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24},^25,de Acta2²⁶ y SM22α^14,16) y la activación de Reporteros (p. ej., proteínas fluorescentes, β-galactosidasa) [revisado en Bentzon y Majesky 2018²⁷]. En uno de los primeros estudios con seguimiento de linaje SMC fuera de ajuste de la embriogénesis, Speer et al.¹⁴ proporcionó evidencia que SMC puede modular su fenotipo y transdifferentiate en condrogénica de células durante la calcificación vascular mediante el uso de un modelo de seguimiento de linaje SM22α Cre R26R LacZ. Aunque estos estudios fue pionero en seguimiento del linaje SMC, que estaban parcialmente equívocos en que cualquier dado SMC no expresando su SM22α en el ajuste de la enfermedad sería marcado por el reportero. Esta limitación ha sido soslayada por el desarrollo y uso del tamoxifeno-inducible Cre ERT/LoxP que permite un control temporal de etiquetado de la célula. Celular se produce exclusivamente durante el parto de tamoxifeno y se limita a la célula expresando células específicas del tipo promotor conducir expresión Cre ERT en el momento de la exposición a tamoxifeno, evitando el trazado alternativo de tipos de células activando Cre en el ajuste de la progresión de la enfermedad. Seguimiento del linaje de SMC en la aterosclerosis, el tamoxifeno-inducible Myh11- Cre/ERT2 transgen asociado a reporteros fluorescentes (eYFP^7,15,del^{17,18 , 21}, mTmG^19,25, confeti^20,22,23 estudios de expansión clonal) ha demostrado una notable eficacia y especificidad en las SMC y ha utilizado para destino mapa SMC las poblaciones en las lesiones ateroscleróticas en estudios recientes. Lo importante, estos estudios revelaron que: 1) 80% de SMC dentro avanzado hacer lesiones ateroscleróticas no expresa ningún convencionales marcadores SMC (ACTA2, MYH11) utilizados en análisis immunohistological y por lo tanto habría sido identificado erróneamente sin seguimiento del linaje ¹⁷; 2) subconjuntos de SMC expresan marcadores alternativos tipos de células incluyendo marcadores de macrófagos o de células madre mesenquimales marcadores^16,17,19; y 3) SMC invertir y rellenar la lesión aterosclerótica por expansión oligoclonal y clones SMC mantienen plasticidad a la transición a poblaciones fenotípicamente diferentes^20,23. Para resumir, ahora está claro que las células musculares lisas presentan una notable diversidad fenotípica en las lesiones ateroscleróticas y pueden tener papeles beneficiosos o perjudiciales sobre la patogénesis de la lesión según la naturaleza de sus transiciones fenotípicas. Estos descubrimientos representan una nueva vía terapéutica notable para dirigidos a los SMC atero-promover fenotípica las transiciones en la última etapa de aterosclerosis.

En este documento, proponemos un protocolo estandarizado para el análisis de fase las lesiones ateroscleróticas murinas como métodos sistemáticos para la disección de animales, inclusión, seccionamiento, tinción y cuantificación de las lesiones de la arteria braquiocéfala. Para determinar el efecto de inhibición de la interleucina-1β en destino SMC y fenotipo, utilizamos el linaje SMC ApoE^{- / -} ratones alimentados con una dieta occidental para 18 semanas antes de recibir inyecciones semanales de un anticuerpo anti-IL1β o emparejado de isotipo IgG control de seguimiento.

Cría, manejo y procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Virginia y el Comité de uso y cuidado de los animales institucional Universidad de Pittsburgh.

1. generación de SMC linaje seguimiento ratones

1. Raza Myh11- Cre/ERT2 machos²⁸ (Jackson Laboratory; #019079) con hembras de EYFP R26R (Jackson Laboratory; 006148 #) para obtener Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R EYFP^{+ +} machos.
2. Raza la Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R EYFP^{+ +} varones con ApoE^{- / -} ratones hembra (Jackson laboratory; #002052). Cruza de la progenie y seleccione por genotipificación Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R EYFP^{+ +} ApoE^{- / -} hombre y R26R EYFP^{+ +} ApoE^{- / -} ratones femeninos como criadores finales. Clip de cola y realizar genotipado en hermanos de camada. Todos los ratones masculinos deben ser Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R EYFP^{+ +} ApoE^{- / -} y pueden utilizarse como ratones experimentales (figura 1A).
   Nota: Protocolos de genotipado pueden encontrarse en el sitio web del laboratorio de Jackson. El transgén Cre/ERT2 de Myh11 está situado en el cromosoma Y, que el uso de las hembras. Pueden utilizarse otros sistemas de rastreo de linaje, pero este sistema es hasta la fecha la estrategia de seguimiento más fiable de linaje al mapa destino SMC en la aterosclerosis.

2. músculo liso células linaje-calco ratón dieta y tratamientos

1. Tener hombre Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R EYFP^{+ +} ApoE^{- / -} ratones reciben una serie de inyecciones de 1 mg tamoxifeno de seis a ocho semanas de edad para etiquetar permanentemente Myh11⁺ SMC con YFP y seguir su destino (figura 1 A).
   1. Caliente el aceite de cacahuete a 55 ° C.
   2. Añadir tamoxifeno en precalentado aceite de maní para preparar una solución 10 mg/ml e incubar a 55 ° C hasta disolución completa del tamoxifeno.
   3. Realizar una inyección intraperitoneal con 0,1 mL de solución de tamoxifeno de 10 mg/mL para una serie de diez inyecciones durante dos semanas.
      Nota: El tamoxifeno es un biológico y debe manipularse con cuidado.
2. Cinco a siete días después de la última inyección con tamoxifeno, substituya dieta chow con dieta alta en grasas (p. ej., dieta occidental 42% kcal de grasa; colesterol total 0.2%) para una duración de 18 semanas para permitir el desarrollo de lesiones ateroscleróticas avanzadas, que constantemente se desarrolla en múltiples lechos vasculares incluyendo el arco aórtico, arteria braquiocéfala y raíz aórtica, la aorta abdominal.
3. En 18 semanas de dieta alta en grasas de alimentación, iniciar intervención terapéutica para la duración deseada (figura 1B).
   Nota: Como ejemplo, se realizaron inyecciones intraperitoneales semanales con un anticuerpo anti-IL1β o un comparable de isotipo IgG del control entre 18 y 26 semanas de dieta alta en grasas.
4. Retire el alimento a los ratones rápidos de 8 a 16 h antes de la cosecha para realizar lecturas precisas de triglicéridos y colesterol del plasma del tejido.

3. cosecha de la arteria braquiocéfala (BCA)

1. Eutanasia animal debe seguir las normas y requisitos de cuidado Animal y el Comité uso (ACUC). Eutanasia a los ratones experimentales por CO₂ asfixia durante aproximadamente 5 minutos y verificar muerte pizca del dedo del pie.
2. Peso del ratón y recoger la sangre.
   1. Peso del ratón
   2. Rociar el lado ventral del ratón con el 70% etanol
   3. Realizar punción cardiaca mediante la inserción de una aguja de 25G conectada a una jeringa de 1 mL en el ventrículo del lado izquierdo de la cavidad torácica. 0.1 a 1 mL de sangre se puede recoger.
   4. Transferir la sangre a un tubo de vacío con EDTA mediante lavado de la jeringa y coloque el tubo en un eje de balancín o rotador durante 10-15 minutos.
   5. Transferencia de sangre a un tubo de 1.5 mL y centrifugar durante 10 minutos 250 x g a 4 ° C. Con cuidado retirar la fase superior del plasma con una pipeta y consejos adecuados y transferir a un tubo nuevo. Almacenar a-20 ° C antes de medir el colesterol y los triglicéridos.
      Nota: la sangre puede utilizarse para estudios adicionales, incluyendo recuentos de células sanguíneas y otros componentes de la sangre incluyendo citoquinas o células inmunitarias perfilado.
3. Hacer una incisión de aproximadamente 2 cm de la piel en la parte central del abdomen utilizando tijeras y tirar la piel para dejar al descubierto la cavidad abdominal. Cortar el peritoneo hasta el esternón sin dañar los tejidos. Hacer dos cortes en la línea axilar media del tórax, teniendo cuidado de no dañar el corazón y los pulmones.
4. Levantar el esternón con las pinzas y cortar el diafragma para exponer parcialmente el corazón. Si el corazón no es fácilmente accesible, recorte la caja torácica bastante para llegar a la aurícula derecha.
5. Perfusión del ratón con un sistema de perfusión por gravedad (figura 2A). Instale el sistema de perfusión de gravedad tal que la presión del líquido de perfusión es equivalente a la presión media de sangre murina (figura 2B). Este sistema permite consistencia en perfusión y ambos mantiene el buque morfología y rubores glóbulos rojos.
   Nota: Como referencia, ratones C57Bl6 tienen una presión arterial fisiológica entre 120 mmHg (presión arterial sistólica promedio) y 70 mmHg (presión arterial diastólica promedio)^29,30. Presión sistólica y diastólica promedio puede variar con el fondo genético del ratón.
   1. Conecte un 23 o 25G mariposa aguja para el sistema de perfusión por gravedad y ejecutar con tampón fosfato salino (PBS) a través de la aguja para expeler el aire de los tubos. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo y fije la aguja en el lugar. Usando las tijeras de iris, haga una pequeña incisión (< 2 mm) en la aurícula derecha o en la aorta ascendente.
   2. Perfusión con 5 mL de PBS, luego 10 mL de solución al 4% paraformaldehido (PFA), a continuación 5 mL de PBS. Utilizar solución PFA de PBS y 4% a temperatura ambiente.
   3. Recoja los tejidos de interés (por ejemplo, hígado, pulmón, bazo) y colóquelos en la solución PFA 4%.
6. Exponer el BCA
   1. Limpie el área del cuello eliminando la piel y las glándulas salivales.
   2. Realizar un corte hacia abajo de la línea media del esternón a través del manubrio con unas tijeras. Tenga cuidado de que las tijeras alojarán cerca de la parte posterior del esternón para no dañar la vasculatura situada muy por debajo del esternón. Tirar de ambos lados de la caja torácica con pinzas para abrir completamente la cavidad torácica. Carótidas deben ser parcialmente visibles.
   3. Limpiar tirando de los músculos y del tejido conectivo y eliminación de la grasa con una pinza fina hasta la carótida derecha, la arteria braquiocéfala, la bifurcación de la subclavia y el arco aórtico se limpien y aislados de los circundantes del tejido conectivo y grasa (figura 2C).
7. Quitar el BCA
   1. Con unas pinzas, agarre la carótida derecha por debajo de su bifurcación y hacer un corte inicial sobre el fórceps (figura 2D).
   2. Todavía con la carótida, hacer un segundo corte a través de la arteria subclavia. Los dos cortes finales son a través del arco aórtico, a ambos lados de la arteria braquiocéfala (figura 2D).
   3. Recoger otros tejidos vasculares de interés (p. ej., aorta abdominal, parte superior del corazón que contiene la raíz aórtica).
   4. Coloque el BCA y otros tejidos en la solución PFA 4% durante la noche a temperatura ambiente.
      Nota: El tiempo de fijación debe mantenerse constante durante todo el estudio.

4. tejido transformación y seccionamiento

1. Quitar el tejido del 4% PFA y en una cinta de tejido marcado (figura 3A). Use almohadillas de espuma en el cassette para el tejido conservan su orientación y permanece en el cartucho por el paso de proceso (figura 3B). Cierre los cassettes y sumerja en etanol al 70% hasta el procesamiento (24 a 72 h) de tejidos.
   1. Proceso BCA y otros tejidos recogieron para histológica e inmunofluorescentes de tinción como se indica a continuación (ejemplo de procedimiento de rutina durante la noche utiliza un procesador con penetración vacío): 10% neutro tamponada de formalina durante 30 min a temperatura ambiente (2 x), 75% etanol de 60 minutos a 30 ° C (1 x), etanol al 90% durante 60 min a 30 ° C (1 x), etanol al 95% durante 60 min a 30 ° C (1 x), etanol al 100% durante 60 min a 30 ° C (x 3), xileno durante 60 min a 30 ° C (x 3) y cera de parafina durante 80 minutos a 62 ° C (x 3).
2. Embed BCA verticalmente, con el arco aórtico más cercano a la cara del bloque (figura 3C).
3. Cortar el bloque de parafina en un micrótomo rotatorio (10 μm de espesor) hasta alcanzar el tejido embebido.
4. Una vez que el tejido esté visible, examinar una sección bajo un microscopio para determinar la posición. Si el arco aórtico es aún visible, quitar hasta diez 10 μm secciones a la vez, examinar una sección en cada intervalo.
5. Cuando el arco aórtico ha sido seccionado a través de la arteria braquiocéfala es visible, ajustar la orientación del bloque a la posición del tejido totalmente perpendicular a la cuchilla de micrótomo.
6. Corte el BCA en un espesor de sección de 10 μm. En ese momento, todas las secciones se recogen en serie con tres secciones por diapositiva. Recoger hasta llegar a la bifurcación de la subclavia (figura 3D).
   Nota: Es importante cortar el BCA con un espesor de sección de 10 μm para la adquisición de la imagen confocal posterior z-stack y célula contando. Este espesor permite la evaluación rigurosa y no cofinaciación de la asociación entre un núcleo único y citoplasmática o membrana coloración aunque la profundidad de la sección transversal.

5. inmunofluorescente de tinción

Nota: Una caracterización completa de las lesiones ateroscleróticas incluye evaluación de parámetros morfológicos y los índices de placa estabilidad o inestabilidad y composición celular que no sea el objetivo del presente Protocolo. Morfología de la lesión, el contenido de colágeno y intraplaque hemorragia pueden ser analizadas por Movat^7,17, rojo Picrosirio ^7,31, Ter119 tinción ^7,18, respectivamente. Aquí, describimos el protocolo para el análisis de la composición celular de las lesiones.

1. Incubar los portaobjetos en las siguientes soluciones a temperatura ambiente bajo una campana química: xileno para 5 minutos (2 x), etanol al 100% durante 5 minutos (2 x), etanol al 95% durante 5 minutos (2 x), etanol 70% durante 5 minutos (2 x) y H2O desionizada (diH₂O) durante 5 minutos (2 x).
2. Incube los portaobjetos en solución de recuperación de antígenos según instrucciones del fabricante.
   1. Con ácido cítrico basado solución Desenmascarando al antígeno (véase Tabla de materiales), diluir 3 mL de solución en 320 mL de diH₂O. lugar de las diapositivas en una tinción depósito y relleno en la parte superior con la solución de recuperación de antígeno preparado.
   2. Llene cualquier ranuras vacías en la parrilla con diapositivas en blanco para asegurar incluso la calefacción. Cubrir el recipiente con una tapa para permitir la solución de recuperación de antígeno a hervir sin evaporación.
   3. Calentar los portaobjetos en un horno de microondas por 20 min a aproximadamente 675-700 vatios. Revise las diapositivas regularmente y reemplazar evaporado líquido con diH₂O que las secciones permanecen sumergieron en solución desenmascarar en todo momento.
   4. Permita que el portaobjetos se enfríen en la solución por 1 h a temperatura ambiente.
3. Disolver 6 g de gelatina de piel de pescado (FSG) en 1 L de PBS. PBS/FSG se utiliza como buffer de lavado. Preparar una solución de bloqueo de suero normal de 10% en PBS/FSG.
   Nota: La gelatina de piel de pescado se utiliza en la preparación de la solución amortiguadora de bloqueo. FSG no contiene proteínas de suero que pueden cruz-reaccionar con los anticuerpos mamíferos, minimizando el ruido de fondo. Sin embargo, otra opción bloqueo debe preferir con sistemas de detección de biotina como FSG contiene biotina endógena. El tipo de suero normal utilizado se basa en el anticuerpo secundario utilizado. Cuando se utilizan anticuerpos secundarios burro, suero normal equino debe seleccionarse para bloqueo y anticuerpo diluciones.
4. Incube los portaobjetos en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Secciones de tejido de círculo con un lápiz hidrofóbico. Cubrir las secciones con el amortiguador de bloqueo suero normal FSG de PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Preparar la solución primaria del anticuerpo en el suero normal FSG de PBS durante este paso mientras que los tejidos están bloqueando.
5. Incubar con anticuerpos primarios diluidos en suero de PBS/FSG/normal durante la noche a 4 ° C en una cámara de humedad. Una sección por diapositiva debe ser incubada con una mezcla de anticuerpos de IgG control en la misma concentración como los anticuerpos primarios para control de especificidad del anticuerpo primario.
6. Lavar los portaobjetos así a temperatura ambiente: PBS/FSG durante 5 minutos (3 x), entonces PBS durante 5 minutos (1 x).
7. Incubar con anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo (véase Tabla de materiales) y diamidino-2-phenylindole (DAPI) núcleo contratinción diluido en suero normal FSG de PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Proteja los portaobjetos de la luz.
8. Lavar portaobjetos como se describe en el paso 5.6.
9. Montaje de diapositivas, utilizando los medios de montaje adecuados para fluorescencia (véase Tabla de materiales).

6. confocal microscopio

Nota: El uso de un microscopio confocal y la adquisición de z-stack es fundamental para contar los unicelulares.

1. Definir los parámetros de adquisición a ser utilizados durante todo el estudio: imagen resolución (1024 x 1024 o 2048 x 2048 pixeles); Camino óptico y el número de canales, que son una función de la combinación de anticuerpos secundarios seleccionados; velocidad de escaneado (recomendado velocidad de escaneado: 7-8); y canal de interferencia diferencial (DIC) de contraste.
2. Mediante secciones teñidas con el control de IgG y anticuerpos primarios, establecer la sensibilidad del detector, energía del laser y offset para cada canal individual. El control de IgG se utiliza para reducir al mínimo la señal de fondo.
3. Configurar las posiciones superiores e inferiores para la adquisición de z-stack. Predeterminar el espesor y el número de pilas para adquirir. Estos parámetros deben permanecer constantes durante todo el estudio.
   Nota: Se recomiendan de 8 a 10 pilas de 1 μm de grosor. Permanecer constante en el número de pilas de imágenes durante todo el estudio.
4. Imagen tejido las secciones manchadas con anticuerpos primarios y control de IgG por todos los canales incluyendo DIC.
5. Por lo menos una imagen con una barra de escala para la calibración de la imagen durante la cuenta de célula de la etiqueta.

7. célula contando

1. Instalar y abrir ImageJ. Si es necesario descargar Plugins en la sección Descargar > entrada y salida del ImageJ web para abrir el archivo de imagen generada dependiendo del formato de las imágenes generadas por el microscopio confocal.
2. Abra el archivo de imagen en ImageJ.
3. Calibrar la imagen con una escala de referencia bar usando la imagen generada en 6.6.
4. Delimitar la región de interés en que célula contando será realizada utilizando el canal DIC (figura 4).
   Nota: Una región puede ser delineada en un momento. Dependiendo de las preguntas experimentales, única célula contando se puede realizar en el área entera (véase 7.3.1) o en una sublocalización de la lesión. Por ejemplo, investigación de la zona de la cubierta fibrosa (ver 7.3.2) es particularmente relevante ya que su composición celular es un importante indicador de la propensión de la lesión a la ruptura.
   1. Delimitar la zona de la lesión siguiendo la frontera de lumen (figura 4A, flechas blancas) y la lámina elástico interna (figura 4A, flechas amarillas) visible en la imagen del Cid.
   2. Para el análisis de la zona de la cubierta fibrosa, determinar la frontera distante de 30 μm de la luz y trazar la frontera ( figura 4B-D).
      Nota: El área de la cubierta fibrosa clásica se define como la región enriquecida en ACTA2 + células y colágeno apoyo del lumen (figura 4B). El enriquecimiento en ACTA2 + células y colágeno desempeña un papel fundamental en la estabilidad de la lesión. Estudios anteriores han determinado que el área cubierta fibrosa rica ACTA2 + celular promedio un espesor de 30 μm desde el lumen en SMC-linaje rastreo ApoE^{- / -} ratones alimentaron con una dieta de alto contenido de grasa de 18 a 26 semanas (figura 4C). Así, cuidada caracterización de los efectos de la manipulación genética o tratamiento farmacológico en la composición celular de la zona de cubierta fibrosa es muy relevante.
5. Abra el panel de Herramientas de canales (imagen > Color > herramientas del canal) y manchas de pseudo-color los diferentes canales (figura 5A, cuadro 1).
6. Combinar los canales de color (imagen > Color > combinar colores) (figura 5A; cuadro 2). Todos los canales deben ser visibles en la misma imagen (figura 5B). Activar y desactivar los canales de color individuales mediante el panel de Herramientas de canal (figura 5A, cuadro 1).
7. Configurar la herramienta recuento.
   1. Haga clic en el icono de cuenta en la barra de herramientas (figura 5C; cuadro 1) y seleccione Herramienta de múltiples puntos.
   2. Haga doble clic en el mismo icono para abrir el panel de Punto de herramienta (figura 5C; cuadro 2).
   3. Seleccione el tipo y tamaño de los elementos para contar las células.
   4. Compruebe Mostrar todo.
8. Abra el canal DAPI sólo en el panel de Herramientas de canal y seleccione el canal de contador 0 (figura 5C; cuadro 3). Haga clic en núcleos individuales que serán etiquetados (e.g., amarillo puntos en la figura 5C, D). Desplazamiento z-pilas para contar todos los núcleos teñidos en la región de interés. El número de eventos se indica a continuación el canal de contador en el panel de la Herramienta de punto (figura 5C; cuadro 4).
9. Encender otro canal tinción (por ejemplo, tinción de eYFP). Seleccione el canal del contador 1. Haga clic en celdas en el cual hay una colocalización entre DAPI y la coloración. Para la tinción citoplásmica, seleccionadas células con tinción rodea el núcleo en la profundidad del núcleo (ver varias pilas de z).
10. Repetir modificando la coloración combinaciones y selección de nuevos canales de contador para contar las poblaciones celulares de interés. El color de cada punto representa una población de células diferentes(figura 5). Resultados se pueden expresar como el número de células al número total de DAPI o número de células al área de la región.

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} ratones fueron inyectados con tamoxifeno entre seis y ocho semanas de edad antes de ser alimentados con una dieta alta en grasas. En 18 semanas de dieta alta en grasas de alimentación, dos grupos de ocho ratones trataron semanalmente con un anticuerpo monoclonal anti-IL-1β de ratón o un comparable de isotipo IgG del control en 10 mg/kg durante 8 semanas (figura 1)⁷. Ratones fueron sacrificados y perfunde con una solución de PBS PFA 4%. Las arterias braquiocefálicas fueron disecadas, procesadas y secciona como se describió anteriormente (figura 2 y figura 3).

Después de la tinción inmunofluorescente con anticuerpos contra el linaje seguimiento reportero (YFP) y marcadores fenotípicos (ACTA2, LGALS3, RUNX2), un espesor de 8-10 μm del BCA secciones transversales fue fotografiada usando un microscopio confocal. Se adquirieron imágenes de cada coloración individual, DAPI (tinción nuclear) y CID. Delimitación de regiones de interés para la célula contando (lesión, cubierta fibrosa) se realizó mediante imágenes DIC (figura 4). Sola celda de conteo determinar la abundancia de poblaciones derivadas de SMC se realizó mediante ImageJ (figura 5).

Presentamos dos representante de coloración inmunofluorescente y contando solo evaluar el efecto de la inhibición de IL-1β en composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas. En primer lugar, la coloración se realizó para el reportero de seguimiento del linaje SMC YFP, el marcador SMC ACTA2 y marcador macrófago LGALS3 en cortes transversales en dos lugares diferentes del BCA (480 μm y 780 desde el arco aórtico) (figura 6). Se realizaron análisis cuenta de célula en la región de la cubierta fibrosa de estas sección y se encontraron notables diferencias en la composición celular de la zona de la cubierta fibrosa entre los ratones tratados con el anticuerpo anti-IL-1β y ratones trataron con el isotipo IgG control comparable (figura 6A). Inhibición de la IL-1β se asoció con una disminución de YFP + SMC y un aumento en células LGALS3 + (figura 6B). Con respecto a los fenotipos de las poblaciones de SMC, se observó una disminución en el número de YFP + ACTA2 + SMC, mientras que el número relativo de macrófagos derivados de SMC (YFP + LGALS3 +) aumentó significativamente en ambas localidades de BCA (figura 6C).

Finalmente, investigamos el efecto de la inhibición de IL-1β en la transición fenotípica de SMC en condrogénica de células. Esta transición fenotípica es un conductor importante de la calcificación vascular, característica importante de aterosclerosis de la última etapa^14,32,33. Cortes transversales BCA fueron manchadas para el reportero de seguimiento del linaje SMC YFP, el marcador osteochondrogenic RUNX2 y el marcador de macrófagos LGALS3 (figura 7A). La abundancia y el origen de las células de RUNX2 + condrogénica fueron caracterizados dentro de la zona de lesión en los dos grupos experimentales. Encontramos que la inhibición de IL-1β no impacto el número total de células de RUNX2 + dentro de la lesión, ni la proporción de derivados de SMC (YFP + RUNX2 +) y derivados de macrófago (YFP-LGALS3 + RUNX2 +) condrogénica de células (figura 7B).

Figura 1 : Estudios de intervención en el músculo liso de la célula ratones de seguimiento linaje. (A) representación esquemática de la Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} tamoxifeno-inducible SMC linaje específico trazado modelo de ratón. Tratamiento con tamoxifeno induce la recombinación del locus R26R YFP y la supresión de un codón de parada y la permanente expresión de YFP por SMC. (B) esquema de intervención de estudios en que Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} ratones alimentaron con una dieta occidental para 18 semanas fueron inyectadas semanalmente con el anticuerpo de la IL-1β o un anticuerpo de control emparejado de isotipo IgG en una concentración de 10 mg / kg durante 8 semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Disección de la arteria braquiocéfala. (A) esquema de un sistema de perfusión de gravedad. El sistema está configurado en una altura precisa que permite la perfusión a presión cerca de la presión arterial sistólica media en ratones. La presión varía ligeramente con la altura de volumen como líquido se utiliza durante la perfusión entre la altura h₁ y h₂. (B) la ecuación para el cálculo de la presión de los fluidos estáticos y determinación de la altura para llegar a una presión de perfusión igual a la C57Bl6 ratón media presión arterial sistólica. Fotos (C) de la aorta proximal y arterias ramificadas en ratón C57Bl6 alimentados con una dieta chow (foto izquierda) y Apoe^{- / -} ratón alimentan con una dieta alta en grasas durante 26 semanas (foto derecha). El asterisco indica la presencia de lesiones ateroscleróticas. (D) esquema de la aorta proximal y la ramificación de las arterias. Flechas rojas representan los cortes para el aislamiento de la carótida derecha y la arteria braquiocéfala aislamiento y números indican el orden de los cortes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Procesamiento de tejido, incrustar y seccionamiento. (A) fotografía de un cassette empotrable con tejido BCA. El BCA es colocado en una almohadilla de espuma. (B) Zoom-in del BCA en la almohadilla de espuma. El BCA está orientado con el arco aórtico cerca de la parte de la etiqueta de la cinta y la carótida alisados verticalmente. Barra de escala: 1 cm. (C) esquema de parafina bloque después de la fijación de la arteria braquiocéfala. (D) esquema de serie diapositivas con las secciones seriales de 10 μm de espesor con indicación de la distancia del arco aórtico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Delimitación de la lesión aterosclerótica y el área de la cubierta fibrosa. (A) microfotografías representativas de DIC imagen de lesión aterosclerótica en la arteria braquiocéfala cortes transversales de Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -}. El luminal y los bordes de la lámina elástico interna se localizan por blanco y amarillo flechas, respectivamente (panel izquierdo). El área está delimitada por una barra de escala de la línea discontinua (panel derecho): 100 μm. (B) microfotografías representativas de DIC y ACTA2 tinción. Flechas de doble cabeza muestran el espesor de la ACTA2 coloración dentro del área de apoyo a la luz de la definición de la zona de la cubierta fibrosa. (C) cuantificación de subluminal ACTA2⁺ grueso de Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe^{- / -} alimentados con una dieta alta en grasas durante semanas 18, 21 y 26. Con esta cepa de ratones, la cubierta fibrosa tiene un espesor medio de 25-30 μm en lesiones ateroscleróticas avance. Los resultados se expresan como media ± SEM. delineación (D) de un área fija de cubierta fibrosa gruesa de 30 μm para el recuento de célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Célula contando con ImageJ. Capturas de pantalla que ilustra los pasos clave sola célula contando con ImageJ en imágenes obtenidas por microscopia confocal. Canal (A) cada coloración individual y z-stack individual son accesibles desplazándose c: y z: barras en la parte inferior de la imagen. Canales de tinción son pseudo colores mediante el panel de canal (1) canales de tinción (YFP LGALS3 ACTA2, DAPI para tinción nuclear y DIC) se combinan con el panel de canales de mezcla (2). (B) resultados de canal de fusión YFP LGALS3, ACTA2, DAPI, y CID. (C) núcleo cuenta basado en la coloración de DAPI usando el icono de cuenta (1) y el panel de la herramienta de punto (2). Se utiliza un canal de contador diferentes para cada población celular (3). El número de eventos contados se indica a continuación el canal de contador (4). Rectángulo blanco: región ampliada a la derecha. Imagen representativa (D) sola célula contando dentro del área de la cubierta fibrosa (línea punteada) para varias poblaciones de la célula incluyendo DAPI (puntos amarillos), células YFP⁺ (magentas puntos), LGALS3 YFP^–+ las células (cian puntos), YFP⁺LGALS3⁺ las células (puntos naranja), YFP⁺ACTA2⁺ las células (puntos verdes) y ACTA2 YFP^–+ las células (puntos azul oscuros). Rectángulo blanco: región ampliada a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Caracterización de los efectos de la inhibición de IL-1β en la composición celular de la zona de la cubierta fibrosa en dos localizaciones distintas de BCA del linaje SMC rastreo Apoe-/-ratones de. BCA (A) cortes en 480 μm y 780 transversales desde el arco aórtico de ratones tratados con el anticuerpo de la IL-1β o el control de IgG como se muestra en la figura 1 fueron manchadas para YFP, LGALS3, y DAPI (tinción nuclear) y la sección era reflejada por DIC. Combinaron a canales inmunofluorescentes (paneles de la derecha inferior). Las líneas discontinuas de delinean las regiones de la cubierta fibrosa. Barras de escala: 100 μm. (B) célula contando revela que la inhibición de IL-1β se asocia con una disminución significativa en células YFP⁺ y un aumento en LGALS3⁺ de las células dentro del área de la cubierta fibrosa. Población, una disminución de YFP⁺ACTA2⁺ y un aumento en YFP⁺LGALS3⁺ C) dentro de YFP⁺ de la célula se observan poblaciones. Los resultados se expresan como media ± SEM. estadístico análisis: desapareado t-prueba múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Efecto de la inhibición de la IL-1β en el número de RUNX2 + condrogénica de células con lesiones ateroscleróticas avanzadas. BCA A) las secciones transversales se tiñen de YFP, LGALS3, RUNX2 y DAPI (tinción nuclear), y todos los canales se fusionaron (paneles inferiores). Las líneas discontinuas de delinean la zona de lesión. Barras de escala: 100 μm. B) unicelular cuenta muestra que la inhibición de la IL-1β no afecta el número total de RUNX2⁺ de las células dentro de la lesión ni la proporción de RUNX2⁺ con células de origen SMC (YFP⁺RUNX2⁺; YFP⁺LGALS3⁺RUNX2⁺) y origen mieloide (LGALS3 YFP^–+RUNX2⁺). Los resultados se expresan como media estadística SEM. Análisis: desapareado t-prueba múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A pesar de décadas de investigación y los avances técnicos en el estudio de la aterosclerosis, el campo tiene una historia decepcionante de traducir los resultados científicos en terapias clínicas^34,35. Este fenómeno puede explicarse en parte por las discrepancias en los modelos animales, diseños experimentales y análisis de la lesión. Adjunto, describimos un gasoducto experimental que se utilizó para analizar la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas usando linaje seguimiento ratones⁷. Este método permite una investigación meticulosa de asignación de destino celular y fenotipo, que son parámetros clave controlados por mecanismos potenciales en jugar en las lesiones ateroscleróticas avanzadas.

El modelo de ratón de seguimiento SMC-linaje es una poderosa herramienta para realizar un seguimiento preciso del destino y modulaciones fenotípicas de este linaje y su contribución a la patogenia de la aterosclerosis. El sistema Cre-loxP tamoxifen-inducible permite etiquetado de SMC vascular maduro expresando MYH11 antes de la iniciación de la aterosclerosis. Convincente evidencia de uso de este sistema ha demostrado que las placas ateroscleróticas son altamente plásticas y SMC vascular puede experimentar conmutación fenotípica, perdiendo su fenotipo contráctil y marcadores específicos de la SMC, proliferación, migración e incluso transdifferentiating en macrófagos como células^17,18. En el presente Protocolo, mostramos cómo rastreo de linaje detección y coloración inmunofluorescente para marcadores de interés puede integrarse para determinar precisamente la transición fenotípica realizada por SMC y su frecuencia relativa entre otras poblaciones de SMC.

Esta metodología es altamente complementaria con otros ensayos realizados con frecuencia en el campo. En primer lugar, evaluación de carga de la lesión aterosclerótica por cara en preparaciones aórtica combinada con lípidos tinción Sudán IV es ampliamente utilizado debido a su comodidad y rapidez. Sin embargo, se trata de una medida inadecuada de principales parámetros morfológicos como el tamaño de la lesión, tamaño del lumen y remodelación del buque. Coloración de la cara en aórtica preparación por Sudán IV para visualizar la deposición de lípidos puede ser utilizada para cuantificar el área relativa dentro de la aorta, pero puede proporcionar inconsistente la coloración de las lesiones, como sólo el componente lípido neutral se visualiza mientras regiones ocupadas por otros componentes, como la matriz extracelular, son generalmente olvidadas⁸. Por otra parte, cara en coloración es incapaz de informar sobre la morfología de la lesión y no puede distinguir entre lesiones avanzadas y vetas de grasa. Morfología del vaso es un parámetro importante de evaluar riesgo etapa y ruptura de aterosclerosis, incluyendo lesión tamaño, diámetro de lumen, buque remodelación^7,36,37. Estos análisis requieren la conservación de la morfología de los vasos para la cuantificación adecuada. Lo importante, protocolos para la investigación de parámetros morfológicos se traslapan grandemente con el protocolo detallado aquí. En particular, se basan en el uso de un sistema impulsado por la gravedad de la perfusión vascular de PBS y perfusión fijador proporcionar una mayor consistencia en la presión aplicada. El sistema impulsado por gravedad infiltración garantiza una velocidad de flujo constante y una presión entre cada ratón independiente y evita la inconsistencia de la perfusión basados en la fuerza manual entre experimentos independientes o investigadores. El sistema de perfusión por gravedad se debe establecer para inducir la perfusión a presión cerca de la media presión murina (70-120 mmHg). En segundo lugar, nos proporciona un método estandarizado y sistemático de incrustación y seccionamiento para la arteria braquiocéfala. Definiendo el sitio de inicio de seccionamiento y cuantificar el área de la lesión en varias ubicaciones a lo largo de la arteria braquiocéfala, podemos limitar la variación aleatoria que viene con muestreo limitado.

Citometría de flujo es una técnica altamente complementaria con coloración inmunofluorescente junto con la cuenta de célula que ha sido ampliamente utilizada en la cuantificación de poblaciones celulares en las lesiones ateroscleróticas³⁸. Consiste en la digestión de la aorta de ratón y etiquetado de las células liberadas con anticuerpos fluorescentes. Citometría de flujo ofrece un análisis cuantitativo de las poblaciones celulares presentes en la aorta. Sin embargo, como todas las tecnologías, citometría de flujo tiene limitaciones. A pesar de la ventaja distinta de caber una gran variedad de marcadores simultáneos, hay una completa pérdida de resolución espacial, y llega a ser confuso si una población celular se enriquece en el casquillo fibroso o el núcleo necrótico. Además, hay un riesgo de efecto de dilución como citometría de flujo requiere un gran número de células y a menudo no se centra sólo en las áreas ateroscleróticas. Por esta razón, la inmunofluorescencia y la citometría de flujo pueden utilizarse de manera complementaria para permitir alta de perfiles dimensiones y localización de la lesión.

Por último, el protocolo se centra en la cuantificación de las poblaciones de SMC en BCA avanzada lesión usando las secciones fijadas en paraformaldehido y parafina-encajados del tejido. Sin embargo, este protocolo puede utilizarse para investigar otras camas vasculares incluyendo la raíz aórtica o la aorta abdominal, dos territorios vasculares sujetas a desarrollo de ateroesclerosis. Procesamiento sistemático y seccionamiento de la raíz aórtica han sido bien descrita^8,39. La ateroesclerosis se desarrolla en diferentes lugares y esa manipulación genética o la intervención terapéutica no homogénea puede afectar estos sitios²¹, es importante investigar tantas camas vasculares como sea posible llegar a conclusiones precisas. Tinción inmunofluorescente y unicelular cuenta también se pueden realizar utilizando las secciones congeladas. Esto puede ser necesario debido a la incompatibilidad de los anticuerpos con secciones de la parafina. Aunque el animal perfusión e incrustación de tejido se diferencian de este protocolo, los investigadores pueden seguir el resto de los procedimientos experimentales descritos aquí.

En conclusión, las técnicas describen aquí esbozo un enfoque sistemático para el análisis de poblaciones de células de la lesión y fenotipos en la última etapa de aterosclerosis murino. Este protocolo puede servir como plantilla para investigar poblaciones de lesión por coloración inmunofluorescente en todo tipo de diseño experimental de aterosclerosis precoz y tardía, así como estudios de prevención e intervención.

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos el centro de la proyección de imagen biológica (apoyado por NIH 1S10OD019973-01) en la Universidad de Pittsburgh por su asistencia. Este trabajo fue apoyado por es apoyado por científicos concesión de desarrollo 15SDG25860021 de la American Heart Association a D.G. R.A.B. fue apoyado por los NIH grant HL136188 F30.