Конфокальная томография двуцепочечной РНК и шаблон признание рецепторов в отрицательной смысл РНК вируса

Двуцепочечной РНК производится во время репликации РНК вируса могут быть признаны рецепторов признание шаблон побудить врожденный иммунный ответ. Для отрицательных смысл РНК-вирусов взаимодействие между низкоуровневых двуцепочечной ДНК и РРСС остается неясным. Мы разработали метод confocal микроскопии для визуализации Аренавирусы двуцепочечной ДНК и ПРР в отдельных клетках.

Двуцепочечные РНК (ds) выпускается в виде репликативной промежуточных во время РНК вируса. Признание малым интерферирующим РНК, принимающих шаблон признание рецепторов (ПРРС) как ретиноевой кислоты (RIG-я) как рецепторы (RLRs) рог-I и меланома дифференциация связанные белком 5 (MDA-5) приводит к индукции врожденный иммунный ответ. Формирования и внутриклеточного распределения двуцепочечной ДНК в положительных смысле РНК вируса также характеризуется микроскопии. Многие РНК-вирусов негативные чувства, включая некоторые аренавирусов, триггер врожденный иммунный ответ во время инфекции. Однако отрицательный смысл РНК-вирусов предполагалось производить низкий уровень двуцепочечной ДНК, что препятствует исследования изображений PRR распознавания вирусной РНК. Кроме того инфекции эксперименты с высоко патогенного аренавирусов должны выполняться в высокой сдерживания биобезопасности уровня удобства (BSL-4). Взаимодействие между вирусной РНК и неродным для высоко патогенного вируса РНК практически неизвестны из-за дополнительных технических проблем, которые исследователи должны сталкиваться в зал BSL-4. Недавно была признана моноклональных антител (МАБ) (клон 9D 5), первоначально использовались для обнаружения Пан энтеровирусного специально обнаружить двуцепочечной ДНК с более высокой чувствительности, чем традиционные J2 или K1 антител анти-двуцепочечной ДНК. Здесь, используя 9D 5 антитела, мы описываем confocal микроскопии протокол, который успешно используется для визуализации малым интерферирующим РНК, вирусных белков и PRR одновременно в отдельных клетках, инфицированных Аренавирусы. Протокол также подходит для изображений исследования двуцепочечной ДНК и распределения PRR в патогенные Аренавирусы инфицированных клеток в BSL4 зал.

Начальный шаг индукции врожденный иммунный ответ является признание принимающей двуцепочечные РНК (ds), модель распознавания рецепторов (ПРРС) как ретиноевой кислоты (RIG-я) как рецепторы (RLRs) рог-I и меланома дифференциация связанных белка 5 (MDA-5)¹. Для положительных смысл РНК-вирусов двуцепочечной ДНК может обычно легко обнаружить с помощью моноклональных антител (МАБ)²анти dsRNA J2 или K1. Взаимодействие между малым интерферирующим РНК и РРСС в положительных нить РНК-вирусов, таких как Пикорнавирусы, характеризуется с помощью конфокальной микроскопии³. Однако для отрицательных смысл РНК вируса, визуализации и характеристика PRR и dsRNA взаимодействия сдерживается отсутствием чувствительных антител к двуцепочечной ДНК. РНК флуоресцентной гибридизации in situ (рыба) был применен к визуализации вирусной РНК и РРСС⁴. Тем не менее рыба методология требует знания РНК последовательности целевого объекта и не могут быть совместимы с PRR совместно пятнать. Недавно, 9D 5 МАБ, которая первоначально была разработана для диагностики инфекции Пан энтеровирусов, было обнаружено более чувствительны, чем J2 МАБ и может легко обнаружить двуцепочечной ДНК в отрицательной смысле РНК вирус инфекции^5,6. Таким образом МАБ 9D 5 — Роман и полезным инструментом для изучения вирусной репликации и взаимодействие между ПРР и вирусной РНК для отрицательных смысл РНК вируса.

Аренавирусов представляют собой семейство одноцепочечной, отрицательные чувство РНК-вирусов, которые включают несколько человеческие патогены, например вирус Ласса (LASV), вирус Хунин (JUNV) и Мачупо вирус (MACV), которые вызывают тяжелые геморрагические лихорадки заболевания людей⁷. Клинические данные из тяжелых и смертельных случаев Аргентинская геморрагическая лихорадка, вызванных новый мир Аренавирусы JUNV выставку необычно высокий уровень сывороточного ИФН α^8,9. Мы показали, что патогенных аренавирусов NW (JUNV и MACV), но не патогенные Аренавирусы старого света, LASV, побудить типа я интерферон (ИФН) ответ в человека моноцитарных дендритных клеток¹⁰. Кроме того, RIG-I является одним из датчиков посредничество типа I ИФН ответ в JUNV-инфицированных клеток¹¹. Мы также обнаружили, что белок протеинкиназы R (PKR) рецептор, который традиционно известен для распознавания малым интерферирующим РНК, активируется в болезнетворные СВ Аренавирусы инфекции¹². Для более глубокого понимания механизма вирус специфических ИФН ответа во время Аренавирусы инфекции, мы стремились разработать протокол к визуализировать взаимодействие между вирусной РНК и цитоплазматических РРСС.

Инфекция эксперименты с патогенных JUNV, MACV и LASV должны быть выполнены в области биобезопасности уровня 4 (BSL-4) объектов. Таким образом помимо предположительно низкий уровень двуцепочечной ДНК, образованная в Аренавирусы инфекции, выполнения требований по биобезопасности является еще одной проблемой технику при выполнении визуализации исследования для этих высоко патогенные вирусы. Используя 9D 5 антитела и Candid1 # вакцинного штамма JUNV, конфокальная микроскопия-протокол на основе описанных в настоящем докладе, который успешно используется для визуализации малым интерферирующим РНК, вирусных белков и PRR одновременно в клетках, инфицированных Аренавирусы в BSL2 лаборатории. Протокол также подходит для визуализации внутриклеточного распределения двуцепочечной ДНК и PRR во время патогенных Аренавирусы инфекции в BSL4 зал.

1. Подготовка A549 клеток и JUNV инфекции

1. Семенной 2 x 10⁵ человеческих легких A549 клеток эпителия на поли D-Лизин (PDL) покрытием стекла coverslips в 12-ну пластины на 24 часа до инфекции.
2. Подготовить аликвоты 150 мл JUNV¹³ на умножение инфекции (МВД) 1.0 зубного налета, образуя блок в клетку, разбавленных в Дульбекко изменение орел СМИ среднего (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным (ФБС) 2% и 1% пенициллина и стрептомицина (P/S ).
3. Извлеките из клеточной культуры. Добавить вирус посевным материалом на каждом хорошо содержащие coverslip и проинкубируйте 1,5 ч при 37 ° C. Встряхните пластины каждые 15 мин.
4. Удалить вирус посевным материалом, добавляют 1 мл DMEM дополнена 5% FBS и 1% P/S. инкубировать пластины при 37 ° C для желаемого времени точки.

2. Фиксация и иммуноокрашивания

1. Аспирационная средств массовой информации. Промывайте ячейки, добавив 1 мл фосфатный буфер (PBS) дополнены кальция и магния в каждой скважине.
2. Удаление PBS. Добавить 1 мл метанола (метанола) предварительно охлажденным при-20 ° C и температуре-20 ° C или на сухой лед для 15 мин.
3. Удаление метанола.
4. Добавьте 1 mL PBS для каждой скважины, и мыть образцы на 4 ° C с плавное покачивание на 5 мин повторить мыть в общей сложности 4 раза.
5. Мыть на coverslips в 1 мл 0,2% t-octylphenoxypolyethoxyethanol 5 минут при температуре 4 ° C, с плавное покачивание фиксированные ячейки.
6. Добавьте 1 mL PBS для каждой скважины. Стирать образцы на 4 ° C за 5 мин с плавное покачивание. Повторите шаг стирки для в общей сложности 4 раза.
7. Чтобы обнаружить двуцепочечной ДНК и MDA5, Проинкубируйте образцы в 200 мл первичных антител, разбавленных в 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Разбавьте антитела анти dsRNA 9D 5 в разведении 1:2 и разбавления антитела анти MDA-5 на 1: 250. Проинкубируйте с плавное покачивание на 4 ° C на ночь.
8. Удаление первичных антител и мыть каждый хорошо с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежно покачиваясь на RT. повторить это мыть еще четыре раза.
9. Добавить 200 мл вторичных антител (1:2, 000 разрежения) разводят в 3% BSA и Инкубируйте на RT 1 h.
10. Удаление вторичных антител и мыть каждый хорошо с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежно покачиваясь на RT. повторить это мыть еще четыре раза.
11. Для обнаружения JUNV Нуклеопротеиды (NP) и RIG-я, добавляют 200 мл конъюгированных антител, разбавленных в 3% BSA. Разбавить конъюгированных анти JUNV NP (АГ-12) на 1:1,000 и Проинкубируйте образцы для 2 ч с плавное покачивание в рт. Разбавить конъюгированных антител анти-RIG-я на 1: 500 и Инкубируйте на 4 ° C на ночь с плавное покачивание.
12. Удаление конъюгированных антител и мыть каждый хорошо с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежно покачиваясь на RT. повторить это мыть еще четыре раза.
13. Counterstain coverslips с DAPI (1:1, 000) для 3 мин с плавное покачивание на RT.
14. Мыть coverslips 3 раза, каждый раз на 5 минут в 1 мл 0,5% т-octylphenoxypolyethoxyethanol с плавное покачивание на RT.
15. Мыть дважды в 1 мл PBS для 5 мин каждый раз с плавное покачивание на RT.
16. Мыть раз в 1 мл ddH₂O 1 мин на RT, слегка покачиваясь.
17. Coverslips крепление на стекло слайда с помощью установки средств массовой информации. Пусть лечения на ночь.
18. Печать слайдов с лаком и воздух сухой за 1 ч.
19. Изображение на Конфокальный микроскоп с 60 x / 1.42 числовая апертура масло погружения объектива с помощью же лазер выбросов для каждого образца.
20. При анализе данных, при необходимости, вносить коррективы для яркости и контрастности с помощью же линейной регулировки для всех образцов.

Этот протокол был применен для изучения распределения и colocalization между RLRs (RIG-I и MDA-5) и малым интерферирующим РНК в клетках, инфицированных JUNV. Как показано на рис.1 и рис.2, накопление двуцепочечной ДНК увеличивается с течением времени как вирусная инфекция прогрессирует. MDA-5 (рис. 1) и Рог-(рис. 2) сигналы были найдены colocalized с точечной структуры НП и двуцепочечной ДНК.

Рисунок 1: время курс двуцепочечной ДНК и JUNV NP формирования и распределения MDA-5. JUNV-инфицированных и макет инфицированные клетки A549 фиксировали, витражи и образы согласно протоколу на 24, 36 и 48 часов пост инфекции (ХПИ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: время курс двуцепочечной ДНК и JUNV NP формирования и распределения RIG-I. JUNV-инфицированных и макет инфицированные клетки A549 фиксировали, витражи и образы согласно протоколу на 24, 36 и 48 ХПИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для положительных смысл РНК-вирусов и вирусов dsDNA dsRNA легко обнаружены с антитела анти dsRNA J2 широко используется. Однако производить двуцепочечной ДНК на низком уровне или ниже обнаружения с помощью же антитела²считаются отрицательный смысл РНК-вирусов. Таким образом многие аспекты вирусной РНК и PRR взаимодействия во многом неясным для отрицательных смысл РНК-вирусов. Мы попытались пятно для двуцепочечной ДНК в Аренавирусы инфекции, используя антитела J2, но флуоресценции сигналы были не дифференцируема, по сравнению с макет инфекции. МАБ 9D 5, первоначально предназначенных для обнаружения Пан энтеровирусов, оказалась для двуцепочечной ДНК и более чувствительны, чем J2 антитела⁵. Это антитело успешно использовался для выявления вирусной РНК в течение отрицательной смысл РНК вируса, включая прототип Аренавирусы лимфоцитарный хориоменингит вирус^5,6,14. Соответственно мы использовали МАБ 9D 5 совместно пятно на наличие малым интерферирующим РНК, вирусный NP и неродным для более глубокого понимания их распределения и взаимодействия в отдельных клетках при Аренавирусы инфекции.

Существует несколько методов фиксации, которые могут использоваться для сохранения структуры клеток. Фиксация с метанола действует путем осаждения белков, тогда как параформальдегида и формалином сшивки белков. Метанола является более эффективным, чем альдегиды на сохранение нуклеиновых кислот в клетки и обеспечивает низкий фон иммуноокрашивания. Метанола также удаляет липиды из клеток и таким образом permeabilizes клеточных мембран на же время¹⁵. В этом протоколе клетки фиксируются с помощью ледяной метанола. Другие методы фиксации были также попытки, включая фиксации образцов с параформальдегида 4%, формалин, параформальдегид следуют метанола и метанола, следуют параформальдегида. Однако высокий базальный уровень неспецифичный пятнать наблюдалось в макет инфицированных клеток при использовании параформальдегида или формалина. Метод оптимального фиксации является фиксация с метанола при-20 ° C на чувствительность и специфичность результатов. Перед основное антитело пятная, образец блокирование с BSA 3%, 5% BSA и 10% или 5% козьего сыворотки, за 30 мин до 1 часа был испытан, но все завершилось неспецифической фон окраски. Наилучшие результаты были достигнуты без блокировки шаг и непосредственно с помощью 3% BSA в разбавления антитела. Важнейшие шаги в минимизации фон сигналы являются PBS и t-Octylphenoxypolyethoxyethanol смывки после фиксации. В то время как коммерчески доступных 9D 5, которое антитело разбавляется vender и готовы для прямого использования, 1:2 разбавления антитела с 3% BSA также работал хорошо. В случае, что сигналов двуцепочечной ДНК является слабой антитело может использоваться без разбавления.

Этот протокол может использоваться для изучения взаимодействия между малым интерферирующим РНК и РРСС Аренавирусы инфекции. Хотя эта методика была разработана в среде BSL-2, фиксация метанола, описываемые позволяет полный инактивирование Аренавирусы. Таким образом тот же протокол может применяться для исследования изображений для высоко патогенных аренавирусов (то есть, LASV, JUNV и MACV) в объекте BSL-4. Это также можно применять этот протокол исследования на других РНК вируса. Для достижения оптимальных результатов, может потребоваться изменение протокола.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мы хотели бы поблагодарить UTMB изображений основной зал и Максим Иванников помощи микроскопа.

Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения грант, RO1AI093445 и RO1AI129198 награждены SP, до UTMB приверженность Фонда P84373 для CH и T32 AI007526 ет.