Method Article
Описан метод на основе изображений, может использоваться для определения S-фазе и анализировать динамику клеточного цикла в C. elegans Гермафродит микрофлорой, используя тимидина аналоговые EdU. Этот метод требует не трансгенов и совместим с immunofluorescent окрашивание.
Анализ клеточного цикла в эукариот часто использует хромосома морфологии, выражения и/или локализации продуктов генов, необходимых для различных стадиях клеточного цикла, или включение Нуклеозидные аналоги. В S-фазе полимераз включают тимидина аналогов как EdU или BrdU в хромосомную ДНК, маркировка клетки для анализа. C. elegansнуклеозидов аналоговые EdU подается к червей в ходе регулярных культуры и совместим с immunofluorescent методами. Микрофлорой C. elegans является мощной модели системы для исследования сигнализацию путей, стволовые клетки, мейоз и клеточного цикла, потому что это прозрачная, генетически снисходительный, и meiotic профаза и клеточной дифференциации/гаметогенеза происходят в Ассамблея как линейно. Эти особенности делают EdU большой инструмент для изучения динамических аспектов mitotically Велоспорт клеток и развития микрофлорой. Этот протокол описывает успешно подготовить EdU бактерий, кормить их к одичал тип C. elegans гермафродитки, вскрыть гонад Гермафродит, краситель для включения EdU в ДНК, пятно с антител для обнаружения различных клеточного цикла и развития маркеров, изображение гонад и проанализировать результаты. Протокол описывает изменения в метод и анализа для измерения S-фазе индекс, M-фаза индекс, G2 продолжительность, продолжительность цикла клетки, скорость meiotic вступления и скорость прогрессирования meiotic профаза. Этот метод может быть адаптирована для изучения цикла клетки или клетки истории в других тканях, этапы, генетических стола и физиологических условиях.
В развития животных сотни, тысячи, миллионы, миллиарды или даже триллионы клеток подразделений обязаны сформировать взрослого организма. Клеточный цикл, набор событий, клеточном составе G1 (ГАП), S (синтез), G2 (ГАП), и M (митоз) определить ряд событий, которые выполняются каждое деление клеток. Клеточный цикл является динамичной и лучше всего ценится в режиме реального времени, которое может быть технически сложным. Методы, представленные в настоящем Протоколе позволяют сделать измерения этапов и сроков клеточного цикла из неподвижных изображений.
Маркировка с Нуклеозидные аналоги, такие как 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) или 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) является золотым стандартом для определения S-фазы в исследованиях динамики клеточного цикла в взрослого Caenorhabditis elegans (C. elegans) Гермафродит микрофлорой1,2,3,4,5. Эду и BrdU может использоваться в почти любой генетический фон, как они не полагаются на любом генетические конструкции. Визуализация BrdU требует суровых химической обработки подвергать антигена антитела анти BrdU окрашивание, которое часто является несовместимым с оценки других клеточных маркеров визуализированы пятнать совместно с дополнительные антитела. Напротив визуализации EdU происходит по химии нажмите мягкая условиях и таким образом совместим с антителом, совместно пятнать6,7.
Специфика метки ясно, поскольку ядер только учесть аналогов (5-ethynyl-2'-дезоксиуридина) тимидина ДНК в S-фазе. Визуализация занимает место в фиксированных тканей. EdU метка невидимым сама по себе вплоть до азид содержащих красителя или Флюорофор ковалентно реагирует с алкины в EdU медь катализируемого нажмите химия8. EdU маркировки может обеспечить немедленное информацию, на которой ядра находятся в S-фазе, с помощью короткого импульса маркировки. EdU может также обеспечить динамическую информацию, с помощью импульса Чейз или непрерывной маркировки; например в эксперименте пульс Чейз, метка разбавляется на каждое деление клеток или распространяются как nondividing клетки прогресс через развитие.
Гермафродит микрофлорой C. elegans является мощной модели системы для исследования сигнальные пути, стволовые клетки, мейоз и клеточного цикла. Взрослый микрофлорой является поляризованной конвейера с помощью стволовых клеток найдены на дистальном конце следуют вход и прогрессии через meiotic профаза, координироваться с этапами гаметогенеза более проксимально (рис. 1). В проксимальном конце ооциты Зрелые, являются овуляция и оплодотворенной и начать эмбриогенеза в матку9,10,11. ~ 20 клеток диаметр длинные районе дистального наконечника ячейка, которая включает в себя mitotically Велоспорт стволовых микрофлорой, клетки-предшественники и meiotic клетки в S-фазе, но не для ячейки в meiotic профаза, называют прародителем зоны2,4 , 9 , 12. клеточные мембраны обеспечивают неполного разделения между ядрами в дистальной микрофлорой, но прародитель зоны клетки претерпевают митотическая клеток, Велоспорт в основном самостоятельно. Средний митотический клеточный цикл продолжительность микрофлорой клетки-предшественники зоны в молодых взрослых гермафродитки составляет ~6.5 ч; G1 фазе краткие или отсутствует, и покоя не наблюдается1,2,13. Микрофлорой дифференцировки стволовых клеток происходит через по существу прямым дифференциации и таким образом не хватает транзит усилительных дивизий4. Во время дифференциации в стадии pachytene примерно 4 из 5 ядер не образуют яйцеклеток, но вместо этого проходят apoptosis, действуя как медсестра клетки, жертвуя их цитоплазматических содержимое для развивающихся ооцитов12,14 , 15.
В дополнение к маркировке клетки в S-фазе с аналогами нуклеозидов можно определить клетки митоз и мейоз, используя Пятнать антитела. Ядер в митозе иммунореактивных к анти фосфо гистонов H3 (Ser10) антитела (так называемый pH3)7,16. Ядра в мейоз иммунореактивных антитела анти его-3 (белок оси meiotic хромосома)17. Ядер в зоне прародитель может быть идентифицирован отсутствие HIM-3, наличие nucleoplasmic REC-818или наличие WAPL-119. Интенсивность WAPL-1 является высоким в соматической гонад, высокий в зоне прародителю и низкой во время ранних meiotic prophases19. Несколько клеточного цикла измерения возможны несколько вариантов в протоколе: я) определить ядер в S-фазе и измерения индекс S-фазе; II) M-фаза идентификации ядер и измерения индекс М-фаза; III) определяет, были ли ядер митотическая или meiotic S-фазе; IV) измерить продолжительность G2; V) измерить течении G2 + M + G1 фаз; VI) измерить скорость meiotic въезда; VII) оцените meiotic прогрессии.
Можно сделать несколько клеточного цикла измерений от лишь нескольких видов мокрой лабораторных экспериментов. Протокол ниже описывает 30 мин пульс маркировки кормления C. elegans взрослых гермафродитки с EdU помечены бактерии и совместной маркировки M-фаза клетки путем пятнать с анти pH3 антитела и прогениторных клеток зоны путем пятнать антитела анти WAPL-1. Анализы (шаг 8.3) требуются для дополнительных измерений, и только изменения в продолжительности EdU корма (шаг 2.5), тип антител занятых (шаг 5).
1. Подготовка EdU меченых бактерий
2. C. elegans кормления EdU
3. Вскрытие и фиксации C. elegans микрофлорой
Примечание: Этот протокол вскрытия, фиксации и Пятнать антитела в C. elegans Гермафродит микрофлорой почти идентична опубликован Жервез и Arur (2016)22, за исключением того, что 1 мл стеклянных трубок может быть центрифугировали ускорить Стиральная шаги и протяжные стекла, пипетка Пастера может использоваться для удаления жидкости из 1 мл стеклянных трубок более эффективно.
4. увлажняет Germlines
5. выявления антигенов антителами
6. Выполните EdU Click реакция обнаружить EdU
Примечание: Выполнение EdU нажмите реакция перед антитело пятная шаги (выполнить шаг 6 до шаг 5) — возможно, в зависимости от антитела используются7. Однако, нажмите реагенты могут мешать определенные антигены (например., РЭЦ-8 антитела чувствителен к фиксации и permeabilization). Порядок представления здесь дает яркий антитело пятная с РЭЦ-8, WAPL-1, HIM-3, pH3, флаг и CYE-1 антитела, которые используются, среди других.
7. Выведение ДНК и готовить слайды
8. конфокальная томография и анализ
Поскольку для включения EdU требуется синтез ДНК, можно сделать вывод что EdU меченых ядер претерпевает S-фазы во время окна времени EdU маркировки. Один может интерпретировать ядер что ярлык в 30 мин кормления с EdU, обозначаемый ядер в S-фазе бактерий во время вскрытия. Ядер, которые метки в больше непрерывной EdU кормления эксперимент может назвали рано в окне время и с левой S-фаза, или может помечены в конце части окна времени EdU. EdU сигнал локализует совместно с DAPI сигнала. В некоторых ядрах EdU сигнала охватывает всех хромосом, в то время как в других ядрах EdU сигнал локализуется на 1 – 2 ярких puncta (рис. 4). Эти puncta, скорее всего одну, которая реплицирует поздно в S-фазе13.
Здесь, были животных кормили с EdU непрерывно 30 мин и расчлененный, как описано выше и на рисунке 5. Одним из примеров успешного EdU окрашивание молодых взрослых животных и один пример неудачного окрашивания EdU в старых взрослого животного (см. ниже) показана на рисунке 4. EdU сигнал от 30 мин маркировки локализует примерно половину ядра в зоне Прародителя (определяется WAPL-1 антитела маркировки, но аппроксимированы DAPI морфология26,27,28). Индекс S-фазе, доля зоны прародителю, EdU позитивные, был ранее сообщалось на 57 ±5% и достигает 70% молодых людей в1,2,3. M-фаза индекс равен приблизительно 2-3%1,29. В непрерывное питание за 4 ч или более, все ядра в метке прародитель зоны с EdU и некоторые ядра, которые помечены в зоне прародителя с тех пор вступили meiotic профаза1.
Хотя техника работает последовательно в молодых взрослых животных одичал тип, значительная часть растяжением 5-дневных гермафродитки (даже те, которые содержат спермы) не ярлык в 30 мин EdU импульса (Рисунок 4E). Однако, с 4 h EdU, кормления, почти все эти животные метка. Спорадические неспособность метки в генетических женского животных с короткие импульсы EdU был также сообщил30. Могут существовать другие ситуации, которые приводят к спорадические неспособность к метке.
Можно рассчитать длительность клеточного цикла, выполняя несколько EdU маркировки эксперименты с pH3 маркировки в каждом. Продолжительность G2 оценивалась путем анализа % ядер в M-фазы (pH3 иммунореактивных), которые были EdU положительных во время курса (рис. 6). Этот подход дает средней и максимальной продолжительности G2 (рис. 3A). Медиана времени было интерполяцией, показывая приблизительное G2 продолжительностью 2,5 ч в молодых взрослых гермафродитки. Продолжительность G2 + M + G1 оценивалась от процент от всех прародитель зоны ядер (WAPL-1 иммунореактивных), которые были EdU позитивные (рис. 6). G2 + M + G1 метод обеспечивает максимальную продолжительность мера для комбинированных фаз (рис. 3B). 99-й процентиль времени было интерполяцией, показывающий приблизительную продолжительность G2 + M + G1 3.4 h в молодых взрослых гермафродитки. Данные из те же эксперименты были использованы для расчета ставки meiotic вход (ядер за час). Скорость является наклон линейной регрессии количество ядер, которые вступили мейоз (EdU положительные, отрицательные или HIM-3 положительный WAPL-1) с длительностью метке Эду (рис. 3 c). Значения для 1 день старых взрослых гермафродитки одичал типа приведены в таблице 2.
Рисунок 1: Схема C. elegans микрофлорой и клеточного цикла. (A) клеточного цикла клетки семенозачатка в молодых взрослых Гермафродит микрофлорой. Цифры указывают Приблизительный процент времени, затраченного в каждой стадии клеточного цикла. (Б) у нематоды Caenorhabditis elegans гермафродитки двух U-образных germlines (красный и синий). Сперматека показан желтым и матки с развивающихся эмбрионов показано в темно-серый. Оранжевый пунктирная линия указывает, где животных разделяются для выдавливания germlines. (C) диаграмма развернулось C. elegans микрофлорой. DAPI (синий) является ДНК красителем, который подчеркивает ядерный морфологии. В зоне дистального Прародителя (выделена красным, основанный на Пятнать антитела WAPL-1) содержит mitotically Велоспорт стволовые клетки, клетки-предшественники и клетки в meiotic S-фазе (WAPL-1 также этикетки ядер соматических Гонада). Клетки в S-фазе митотического и meiotic этикетка с 30 мин EdU пульс и указаны в зеленый. Две клетки в M-фазе этикетка с pH3 антитела и отображаются черным цветом. Дистального наконечника клеток (DTC) обеспечивает GLP-1/паз лигандом для сохранять судьбе стволовых клеток этих клеток. Как клетки мигрировать от MS DTC, они выйти из зоны прародителем и введите meiotic профаза. Желтые клетки являются спермы в сперматека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: диаграмма Венна классов ядер. Ядра сгруппированы по присутствия и отсутствия трех маркеров: WAPL-1 указывает зону клетки-предшественники (красный), EdU указывает S-фазе клетки (зеленый), а pH3 M-фаза клетки (синий). Типы клеток определяются как A-G. Обратите внимание, что в молодых взрослых гермафродитки одичал тип клетки типа F не найдены, и клетки метки не совместно с EdU и pH3 вне Прародителя (WAPL-1 положительное) зоны. Дистальной Гонада Диаграмма ниже показывает один пример A-E и G ядер. Для более подробной информации см. таблицу 1 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: графическое представление клеточного цикла продолжительность и скорость meiotic запись экспериментальных данных. (A) продолжительность G2 фазе интерполированный из pH3 и EdU совместно маркировки следующие разнообразны продолжительность EdU импульсов серые линии показывают 50th и 99-й процентили, используемых в интерполяции средней и максимальной длительности G2, обозначается стрелками. (B) ячейку G2, M или G1 фазе не включают EdU. Таким образом максимальная продолжительность фазы G2 + M + G1 может быть оценена путем измерения максимальной продолжительности EdU лейбл, который дает EdU отрицательные клетки. Продолжительность фазы G2 + M + G1 интерполирован Эду и РЭЦ-8 совместно маркировки, следуя разнообразны длительность импульсов EdU. Серая линия указывает 99th персентиль используется в интерполяции максимальная продолжительность G2 + M + G1, указано стрелкой. Это не возможно интерполировать Медиана продолжительности G2 + M + G1. (C) скорость meiotic вступления (в ядрах за h – см. таблицу 2) рассчитывается из наклон линии регрессии. Обратите внимание, что, поскольку y пересечение перехвата не равен нулю, регрессия необходимые для точного расчета ставки meiotic вход (C). . Планки погрешностей указать стандартное отклонение. Данные изменения и перепечатана с разрешения от Фокс et al. 2011 г.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: пример успешных и неудачных 30 мин EdU пятнать. Конфокальный микроскоп изображения 1 день старые (A-D) и 5-дневных (E-H) Гермафродит Гонада (не спермы истощены) после 30 мин EdU маркировки эксперимент. Пунктирная линия белая знаменует собой окончание прародитель зоны. Звездочка помечает положение дистального наконечника. Зеленые знаки, которые EdU пятнать визуализированное нажмите химии (A). Неудачной EdU маркировки приводит низкоуровневых фон окраски но не яркий EdU + ядер (E). Красные знаки WAPL-1 иммунофлюоресценции (B, F). Желтый цвет означает дублирование (C, G). Синие знаки DAPI окрашивание ДНК (D, H). Один стрелок указывают ядро с EdU окрашивание всей хроматина. Двойной стрелки указывают ядро с EdU puncta на только одной пары хромосом. Изображения были получены с 63 X цели. Шкалы бар = 10 мкм (D, H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: экспериментального процесса. Краткий обзор экспериментального протокола расти (A), EdU метки (B), вскрыть (C), пятно антитела (D), выполните клик реакция придают красителя Эду (E), выведение ДНК (F), изображения germlines (G), и количественно EdU помечены и антитела, окрашенных ядра (H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: пример успешного 4 h EdU пятнать. Конфокальный микроскоп образы 1 день старых взрослых Гермафродит Гонада после 4 ч EdU маркировки эксперимент. Пунктирная линия белая знаменует собой окончание прародитель зоны. Звездочка помечает положение дистального наконечника. Пурпурный знаменует pH3 иммунофлюоресценции (A, C). Зеленые знаки, которые EdU пятнать визуализированное нажмите химии (B, C). Иммунофлюоресценции красные знаки WAPL-1 (D). Желтый цвет обозначает совпадения Эду и WAPL-1 (E). Синие знаки DAPI окрашивание ДНК (F). Один стрелок указывают ядра совместно помечены Эду и pH3. Двойной стрелки знаменует pH3 + EdU ядро - редкое явление в 4 h EdU маркировки. Стрелки Марк EdU + WAPL-1 - ядер, которые ввели мейоз. Изображения были получены с 63 X цели. (F) отображается индикатор масштаба 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Метки: | pH3 | EdU * | WAPL-1 или REC-8 | ЕМУ-3 | |
Интерпретация: | Митоз | S-фазы * | Прародитель зона | Мейоз | |
Класс: | Комбинированные интерпретация: | ||||
A | ![]() | ![]() | ![]() | ![]() | в M-фаза в зоне прародителю, были в митотическая S-фазе ходе Эду метки (завершенных G2) |
B | ![]() | ![]() | ![]() | ![]() | в M-фаза в зоне прародителю, были не в S-фазе в ходе Эду этикетки |
C | ![]() | ![]() | ![]() | ![]() | в интерфазе, в зоне прародителю были в S-фазе в ходе Эду этикетки |
D | ![]() | ![]() | ![]() | ![]() | в интерфазе, в зоне прародителю были не в S-фазе в ходе Эду этикетки |
E | ![]() | ![]() | ![]() | ![]() | в мейоз были в meiotic S-фазе в ходе Эду метки (meiotic вход ядер) |
F | ![]() | ![]() | ![]() | ![]() | возвращение в митоз (найдены в некоторых мутантов) или meiotic дивизий (в сперматогенеза) |
G | ![]() | ![]() | ![]() | ![]() | в мейоз были не в S-фазе в ходе Эду этикетки |
Сумма общего pH3 положительный; все ячейки в M-фаза | Сумма общего EdU положительный; все клетки в S-фазе | Общая сумма WAPL-1 положительный; все ячейки в зоне прародителя | сумма общей положительной HIM-3; все ячейки в профазе meiotic |
Таблица 1: классы ядер. * Обратите внимание, что 30 мин и 4 h EdU эксперименты в интерпретации. В длительных экспериментов Эду, клетки вероятно продвинулись за пределы S-фазе. Смотрите введение и Шаг 8 для продолжительности EdU маркировки для соответствующих эксперимента.
Часть цикла клетки | Инструментализм | Расчет * | Значение ** |
Прародитель зоны ядер | все WAPL-1 (или REC-8) позитивные, HIM-3 отрицательных ядер | A + B + C + D | 231 ± 23 ядер |
S-фаза ядра | ядер EdU позитивные после 30 мин EdU label и позитивных WAPL-1 | A + C | 133 ± 20 ядер |
M-фаза ядра | pH3 и co-positive ядер WAPL-1 | A + B | 5.2 ± 2.3 ядер |
Индекс S-фазы | S-фаза ядра / прародитель зоны ядер | A + C / A + B + C + D | 57% клеточного цикла |
M-фаза индекс | M-фаза ядра / прародитель зоны ядер | A + B / A + B + C + D | 2% от клеточного цикла |
Meiotic запись клетки | Эду, помечены ядер в мейоз | E | в зависимости от продолжительности EdU лейбла |
Meiotic скорость записи | Meiotic вход ядер за h EdU лейбла | Склон на рисунке 4 C *** | 20.3 ядер на h |
Продолжительность G2 (медиана) | перехват 50% от Figure4A | 2.5 h | |
Продолжительность G2 (максимум) | перехват 99% от рисунок 4A | 3.5 ч | |
Продолжительность G2 + M + G1 (максимум) | перехват 99% от рисунок 4B | 3.5 ч | |
Продолжительность цикла клетки (медиана) | Средний срок G2 / G2-индекс *** | 6,5 ч | |
Продолжительность цикла клетки (максимум) | Максимальная продолжительность G2 / G2-индекс *** | 8.1 h |
Таблица 2: клеточного цикла расчетов. * Буквы представляют классы ядер, определены в таблице 1 и на рисунке 3. Расчеты, изменяются от Fox и др. 2011 г.1. ** Значения (± стандартное отклонение) одичал тип гермафродитки поднят при 20 ° C, в возрасте 24 h пост середине L4 сцену. Обратите внимание, что, поскольку y пересечение перехвата не равен нулю, регрессия необходимые для точного расчета ставки meiotic записи. G2-индекс определяется путем вычитания S-фазе индекс, индекс M-фаза и приблизительное G1-индекс (2%) от 100%, как описано в Fox et al. 20111.
Подготовка EdU меченых бактерий (шаг 1) имеет решающее значение для настоящего Протокола и первой точкой для устранения неполадок. Молодых взрослых гермафродитки одичал тип метки очень надежно в 4 h EdU пульс, что делает этот элемент полезным для каждого нового пакета EdU меченых бактерий. Кроме того нетронутыми EdU меченых бактерии, которые входят ЖКТ (в старых животных или определенных глотки/дробилка дефектных мутантов) будет ярлык с клик-химия и появляются как яркий продолговатые puncta в кишечнике. Альтернативный метод для маркировки гермафродитки использует «замочить» в высокой концентрации (1 мм) EdU3. Эта техника голодает животных на время маркировки, но предоставляет полезный способ обойти делая EdU меченых бактерий при устранении неполадок фиксации и нажмите химии. Если эксперимент EdU «замочить» успешно пока канал EdU нет, затем подготовьте свежие EdU меченых бактерий. Для достижения достаточной плотности бактериальных, обеспечивая при этом высокое содержание Эду, один может потребоваться настроить концентрации Эду и тимидина.
Главное ограничение этого метода для маркировки S-фазы находится в необходимости кормить бактерий, EdU меченых животных. Животные, которые не могут прокормить (вследствие генотип или стадии) не могут быть помечены с этой техникой. Тем не менее Нуклеозидные аналоги в настоящее время единственным методом для выявления S-фаза ядра в C. elegans микрофлорой, и их использование не требует, что любой трансгенов присутствовать в животных. Кроме того после включения, EdU остается в ядрах даже как они выхода S-фаза, прохождения клеточного цикла, разделить или дифференцировать. Сигнал, ослабляет наполовину с каждое деление клеток. Это делает EdU идеально подходит для отслеживания истории клетки даже через несколько клеточных делений.
Стабильность EdU делает пульс Чейз эксперименты простой; просто промойте избыток EdU бактерий от животных после завершения требуемой продолжительности импульса и передаче животных немеченого бактерий. EdU остается в ДНК и остается видимым даже после нескольких клеточных делений. Однако эксперименты ограничены в один тип S-фаза метки (один импульс EdU). Совместной маркировки с EdU и BrdU возможен в mammalian клетках31 , но не было сообщено в C. elegans. Совместной маркировки IdU и CldU используется в млекопитающих32 , но также не было сообщено в C. elegans.
Основными преимуществами EdU маркировки, что метод требует не трансгенов, EdU можно скармливать C. elegans во время регулярных культуры, химия совместим с immunofluorescent методами и EdU сохраняется в ДНК в течение длительного времени после кормления остановлена. Эти особенности делают EdU большой инструмент для изучения многих аспектов динамики зародышевых клеток и клеточного цикла.
Зародышевых клеток и клеточного цикла анализа динамики с EdU может применяться целый ряд вопросов. Всего лишь несколько примеров дальнейшего применения этого метода: как изменить динамику клеточного цикла в животных с мутациями гена клеточного цикла? Как физиологических условиях влияет на клеточный цикл в стволовые клетки, скорость зародышевых клеток вступления в профазе meiotic и скорость прогрессирования зародышевых клеток через meiotic профаза? Как меняется клеточного цикла в ходе развития личинок? Как крупных срывов сигнальный путь влияет на клеточный цикл, в дополнение к изменениям в судьбе ячейки (например, внематочная распространения)? Эта система может быть изменен для изучения, что клетки делают во многих различных условиях.
Авторы не имеют ничего сообщать.
Мы благодарны E. coli фондовый центр для MG1693; Wormbase; Центр генетики Caenorhabditis , который финансируется за счет национальных институтов из здравоохранения управление исследовательской инфраструктуры программы (P40OD010440) для штаммов; Zach Pincus статистические консультации; Айпин Фэн реагентов; Люк Шнайдер, Андреа шарф, Sandeep Кумар и Джон Brenner для обучения, консультаций, поддержки и полезной дискуссии; и Корнфельд и Schedl лаборатории для обратной связи на этой рукописи. Эта работа частично поддержали национальные институты здравоохранения [R01 AG02656106A1 к KK, R01 GM100756 к TS] и Национальный научный фонд лектор стипендий [DGE-1143954 и DGE-1745038 с ЗК]. Национальные институты здравоохранения ни Национальный научный фонд имел какую-либо роль в конструкции изучения, сбора, анализа и интерпретации данных, ни в письменной форме рукописи.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
petri dishes | 60 mm diameter | ||
Long glass Pasteur pipettes | |||
1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
Tips | |||
Serological pipettes | |||
500 mL Erlenmyer flask | |||
Aluminum foil | |||
25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
Borosilicate glass tubes 1ml | |||
glass slides | |||
no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
37 °C Shaker incubator | |||
Tabletop Centrifuge | |||
Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
Mini Centrifuge | |||
20 °C incubator | |||
4 °C refrigerator | |||
-20 °C freezer | |||
Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены