Анализ клеточного цикла в C. elegans микрофлорой с EdU аналог тимидина

Описан метод на основе изображений, может использоваться для определения S-фазе и анализировать динамику клеточного цикла в C. elegans Гермафродит микрофлорой, используя тимидина аналоговые EdU. Этот метод требует не трансгенов и совместим с immunofluorescent окрашивание.

Анализ клеточного цикла в эукариот часто использует хромосома морфологии, выражения и/или локализации продуктов генов, необходимых для различных стадиях клеточного цикла, или включение Нуклеозидные аналоги. В S-фазе полимераз включают тимидина аналогов как EdU или BrdU в хромосомную ДНК, маркировка клетки для анализа. C. elegansнуклеозидов аналоговые EdU подается к червей в ходе регулярных культуры и совместим с immunofluorescent методами. Микрофлорой C. elegans является мощной модели системы для исследования сигнализацию путей, стволовые клетки, мейоз и клеточного цикла, потому что это прозрачная, генетически снисходительный, и meiotic профаза и клеточной дифференциации/гаметогенеза происходят в Ассамблея как линейно. Эти особенности делают EdU большой инструмент для изучения динамических аспектов mitotically Велоспорт клеток и развития микрофлорой. Этот протокол описывает успешно подготовить EdU бактерий, кормить их к одичал тип C. elegans гермафродитки, вскрыть гонад Гермафродит, краситель для включения EdU в ДНК, пятно с антител для обнаружения различных клеточного цикла и развития маркеров, изображение гонад и проанализировать результаты. Протокол описывает изменения в метод и анализа для измерения S-фазе индекс, M-фаза индекс, G2 продолжительность, продолжительность цикла клетки, скорость meiotic вступления и скорость прогрессирования meiotic профаза. Этот метод может быть адаптирована для изучения цикла клетки или клетки истории в других тканях, этапы, генетических стола и физиологических условиях.

В развития животных сотни, тысячи, миллионы, миллиарды или даже триллионы клеток подразделений обязаны сформировать взрослого организма. Клеточный цикл, набор событий, клеточном составе G1 (ГАП), S (синтез), G2 (ГАП), и M (митоз) определить ряд событий, которые выполняются каждое деление клеток. Клеточный цикл является динамичной и лучше всего ценится в режиме реального времени, которое может быть технически сложным. Методы, представленные в настоящем Протоколе позволяют сделать измерения этапов и сроков клеточного цикла из неподвижных изображений.

Маркировка с Нуклеозидные аналоги, такие как 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) или 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) является золотым стандартом для определения S-фазы в исследованиях динамики клеточного цикла в взрослого Caenorhabditis elegans (C. elegans) Гермафродит микрофлорой^1,2,3,4,5. Эду и BrdU может использоваться в почти любой генетический фон, как они не полагаются на любом генетические конструкции. Визуализация BrdU требует суровых химической обработки подвергать антигена антитела анти BrdU окрашивание, которое часто является несовместимым с оценки других клеточных маркеров визуализированы пятнать совместно с дополнительные антитела. Напротив визуализации EdU происходит по химии нажмите мягкая условиях и таким образом совместим с антителом, совместно пятнать^6,7.

Специфика метки ясно, поскольку ядер только учесть аналогов (5-ethynyl-2'-дезоксиуридина) тимидина ДНК в S-фазе. Визуализация занимает место в фиксированных тканей. EdU метка невидимым сама по себе вплоть до азид содержащих красителя или Флюорофор ковалентно реагирует с алкины в EdU медь катализируемого нажмите химия⁸. EdU маркировки может обеспечить немедленное информацию, на которой ядра находятся в S-фазе, с помощью короткого импульса маркировки. EdU может также обеспечить динамическую информацию, с помощью импульса Чейз или непрерывной маркировки; например в эксперименте пульс Чейз, метка разбавляется на каждое деление клеток или распространяются как nondividing клетки прогресс через развитие.

Гермафродит микрофлорой C. elegans является мощной модели системы для исследования сигнальные пути, стволовые клетки, мейоз и клеточного цикла. Взрослый микрофлорой является поляризованной конвейера с помощью стволовых клеток найдены на дистальном конце следуют вход и прогрессии через meiotic профаза, координироваться с этапами гаметогенеза более проксимально (рис. 1). В проксимальном конце ооциты Зрелые, являются овуляция и оплодотворенной и начать эмбриогенеза в матку^9,10,11. ~ 20 клеток диаметр длинные районе дистального наконечника ячейка, которая включает в себя mitotically Велоспорт стволовых микрофлорой, клетки-предшественники и meiotic клетки в S-фазе, но не для ячейки в meiotic профаза, называют прародителем зоны^{2,4 , 9 , 12}. клеточные мембраны обеспечивают неполного разделения между ядрами в дистальной микрофлорой, но прародитель зоны клетки претерпевают митотическая клеток, Велоспорт в основном самостоятельно. Средний митотический клеточный цикл продолжительность микрофлорой клетки-предшественники зоны в молодых взрослых гермафродитки составляет ~6.5 ч; G1 фазе краткие или отсутствует, и покоя не наблюдается^1,2,13. Микрофлорой дифференцировки стволовых клеток происходит через по существу прямым дифференциации и таким образом не хватает транзит усилительных дивизий⁴. Во время дифференциации в стадии pachytene примерно 4 из 5 ядер не образуют яйцеклеток, но вместо этого проходят apoptosis, действуя как медсестра клетки, жертвуя их цитоплазматических содержимое для развивающихся ооцитов^{12,14 , 15}.

В дополнение к маркировке клетки в S-фазе с аналогами нуклеозидов можно определить клетки митоз и мейоз, используя Пятнать антитела. Ядер в митозе иммунореактивных к анти фосфо гистонов H3 (Ser10) антитела (так называемый pH3)^7,16. Ядра в мейоз иммунореактивных антитела анти его-3 (белок оси meiotic хромосома)¹⁷. Ядер в зоне прародитель может быть идентифицирован отсутствие HIM-3, наличие nucleoplasmic REC-8¹⁸или наличие WAPL-1¹⁹. Интенсивность WAPL-1 является высоким в соматической гонад, высокий в зоне прародителю и низкой во время ранних meiotic prophases¹⁹. Несколько клеточного цикла измерения возможны несколько вариантов в протоколе: я) определить ядер в S-фазе и измерения индекс S-фазе; II) M-фаза идентификации ядер и измерения индекс М-фаза; III) определяет, были ли ядер митотическая или meiotic S-фазе; IV) измерить продолжительность G2; V) измерить течении G2 + M + G1 фаз; VI) измерить скорость meiotic въезда; VII) оцените meiotic прогрессии.

Можно сделать несколько клеточного цикла измерений от лишь нескольких видов мокрой лабораторных экспериментов. Протокол ниже описывает 30 мин пульс маркировки кормления C. elegans взрослых гермафродитки с EdU помечены бактерии и совместной маркировки M-фаза клетки путем пятнать с анти pH3 антитела и прогениторных клеток зоны путем пятнать антитела анти WAPL-1. Анализы (шаг 8.3) требуются для дополнительных измерений, и только изменения в продолжительности EdU корма (шаг 2.5), тип антител занятых (шаг 5).

1. Подготовка EdU меченых бактерий

1. Растут стартовые культуры MG1693. Кишечная палочка MG1693 (E. coli) несет мутации в thyA.
   1. Полоса, E. coli MG1693 из замороженных глицерин запаса на 120 мм lysogeny бульон (LB) агар Петри. Культура при 37 ° C в одночасье.
   2. Прививок от двух отдельных E. coli MG1693 колонии на два дублировать 4 мл трубки жидкий LB. культуры при 37 ° C для ~ 16 h.
      Примечание: MG1693 растет штрафом в LB без дополнения с тимин или тимидина.
2. Растут MG1693 E. coli в минимальной СМИ с EdU.
   1. Автоклав 500 мл Конические колбы.
   2. Использование стерильных добавить 5 мл 20% глюкозы, 50 мкл 10 мг/мл тиамина, 120 мкл тимидина 5 мм, 100 мкл 1 М MgSO₄, 200 мкл 10 мм EdU, 100 мл буфера M9 и 4 мл свежезаваренным выращенных на ночь MG1693 культуры.
      Примечание: Конечная концентрация EdU-20 мкм в этой культуры^1,7. Эта концентрация приводит к ДНК повреждения и клеточного цикла ареста, если наносится непосредственно на mammalian клеток в культуре²⁰. Однако лишь незначительная часть этой EdU включена в E. coli и таким образом доступны для C. elegans. Существует никаких доказательств арест клеточного цикла и никаких изменений в размер прародитель зоны или M-фаза индекса после лечения молодых взрослых гермафродитки EdU.
   3. Культура на ночь, но не более 24 ч при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин.
3. Концентрат EdU меченых E. coli и применить к M9 агар Петри.
   1. Предварительно прохладный настольной центрифуги до 4 ° C.
   2. Использование стерильных для передачи культуры в 2 – 4 стерильные 50 мл конические трубы.
   3. Центрифуга культур на 3000 x g при 4 ° C на 30 мин в Пелле EdU меченых E. coli.
      Примечание: Распоряжаться EdU содержащих супернатант согласно местным и институциональных руководящих принципов.
   4. Ресуспензируйте окатышей с 4 мл свежего M9. Используйте наконечник пипетки 1 мл стерильного раствора или 5 мл стерильной Серологические Пипетки. Resuspending гранулы может занять несколько минут.
   5. Использовать же пипетки для применения и распространения ~ 8 капель ресуспензированы EdU меченых E. coli MG1693 в центре комнатной температуре 60 мм M9 агар Петри. Один пакет дает ~ 16 блюда.
   6. Разрешить блюда высохнуть в течение нескольких часов или на ночь при комнатной температуре, а затем уплотнение каждое блюдо с полосой лаборатории фильма. Блюда могут быть сохранены на 15 ° C ~ 2 недели и 4 ° C ~ 2 месяцев. Используйте той же партии EdU блюда для каждого набора экспериментов.

2. C. elegans кормления EdU

1. Синхронизируйте населения, приурочен яйцо лежал, щелочной гипохлорита лечения последующим штриховки в S-средний с холестерина, или выбирая соответствующий этап²¹. Расти животных желаемый этап (здесь, 24 h пост L4) на средний рост нематода семенами с E. coli ОР50 при 20 ° C.
   Примечание: Подготовьте 50 – 100 животных каждого эксперимента, некоторые не могут вскрыть хорошо, а другие будут утрачены в процессе стирки и передачи.
2. Разрешить EdU блюда нагреть до 20 ° C (или температуры, необходимой для эксперимента).
3. Мыть животных от NGM блюда с использованием M9 или фосфат амортизированное saline (PBS) в 1,5 мл трубку. Разрешить животных урегулировать кратко тяжести или краткий спина в microcentrifuge.
4. Удалить супернатант и мыть животных 1 – 2 раза с ~ 1 мл M9 или PBS. Удалите супернатант.
5. Для переноса животных в крошечной капле M9 или PBS на центр EdU газон используйте стеклянные пипетки Пастера. Подождите несколько минут для жидкости впитаться, затем Инкубируйте на 20 ° C за 30 минут (для прямого измерения S-фаза) или больше (для измерения История S-фазы), при необходимости.
   Примечание: Сигнал EdU обнаруживаемая в ядрах микрофлорой после всего лишь 15 минут EdU кормления¹.
6. Смывают червей EdU блюдо с ~ 2 мл M9 или PBS в бокал, рассекает блюдо.

3. Вскрытие и фиксации C. elegans микрофлорой

Примечание: Этот протокол вскрытия, фиксации и Пятнать антитела в C. elegans Гермафродит микрофлорой почти идентична опубликован Жервез и Arur (2016)²², за исключением того, что 1 мл стеклянных трубок может быть центрифугировали ускорить Стиральная шаги и протяжные стекла, пипетка Пастера может использоваться для удаления жидкости из 1 мл стеклянных трубок более эффективно.

1. Вымойте и вскрыть germlines C. elegans .
   1. Разрешить животных поселиться в нижней части рассечения блюдо, вихрем собирать животных в центре и использовать длинный пипетка Пастера для удаления PBS. Вымыть 1 – 2 раза с ~ 2 мл ФСБ.
   2. Добавьте 2 мл PBS и 4 мкл левамизол 100 мм для фиксации животных. Вихрем блюдо снова, чтобы собирать животных в центре блюдо.
      Примечание: Иммобилизация может занять от нескольких секунд и через несколько минут. Полное обездвиживание не является необходимым для успешного рассечение. Некоторые люди имеют лучше успеха, когда вскрывали неполно иммобилизованных животных.
   3. Вскрыть животных с парой 25 g 5/8" Игл путем разрезания на голову (приблизительно между двумя лампочками глотки) или хвост. Заботиться, чтобы не сократить цикл микрофлорой. Кишечника микрофлорой следует «поп» полости тела из-за внутреннего давления, а остаются присоединенными. Этот протокол похож на ранее опубликованные Жервез и Arur (2016)²².
      Примечание: Держать рассечение время до ~ 5 мин, конечно не более 15 минут дольше рассечение раз может привести к потере антитело пятная сигнала (Sudhir Наяк, личного общения) и голода в PBS может повлиять на физиологии животных. Умение анализировать, быстро и точно может занять некоторое практике.
   4. При необходимости, вихрем собирать расчлененных животных в центре и использовать длинный пипетка Пастера, чтобы удалить столько PBS как можно скорее.
2. Исправить и обезвоживания тканей
   1. Добавьте 2 мл 3% параформальдегида (PFA) в растворе PBS. Обложка блюдо слабо с Лаборатория кино и магазин на лавочке или в ящике 10 мин.
      Примечание: Оттепель PFA решение в 37 ° C воды ванна и затем охладить до комнатной температуры перед рассекает germlines.
      Предупреждение: PFA решение умеренно токсичен и вероятный канцероген и систему или тератогеном. Паров, испуская от параформальдегида решения являются легковоспламеняющимися. Надевайте перчатки нитриловые. Разбавляют PFA от 16% до 3% в химической зонта. При работе вне Зонта, держите все контейнеры покрыты.
   2. Передать гонады тщательно центрифуги чистой 5 мл стеклянной трубки.
   3. Добавить ~ 3 мл PBSTw (PBS с 0.1% Tween-20) на блюдо, который содержал гонады помочь получить оставшиеся гонад и разбавить раствор PFA.
   4. Спин вниз в клинических центрифуги на 870 x g ~ 1 мин младшего или мелкие животные требуют больше спина раз чем старые или больше животных.
   5. С помощью пипетки длинный стекла, супернатанта передать нежелательных материалов стакан для возможного отказа в нежелательных материалов бутылку в химические вытяжки.
   6. Добавить 2 мл полноценного метанола, предварительно охлажденным до-20 ° C. Обложка пластиковых пробирок плотно пленкой лаборатории.
      Примечание: Использование метанола свежие высококачественные «gold label» имеет важное значение для правильной морфологии с определенных антител.
      Предупреждение: Метанола легковоспламеняющиеся жидкости и пара, что токсичные при проглатывании, вдыхании или разрешено контакт кожи. Надевайте перчатки и надлежащие средства личной защиты. Используйте морозильник, подходит для небольших объемов огнеопасно.
   7. Хранить в морозильной камере-20 ° C за 1 ч, даже на ночь или даже несколько месяцев.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

4. увлажняет Germlines

1. Заполните стекло пластиковых пробирок для топ с PBSTw развести метанола и увлажняет гонад. Спин вниз в клинических центрифуги на 870 x g ~ 1 мин.
2. С помощью длинные стеклянные пипетки Пастера, супернатанта передать нежелательных материалов стакан для возможного отказа в нежелательных материалов бутылку в химические вытяжки.
3. Вымойте гонад, 3 раза с помощью ~ 5 мл PBSTw, спиннинг вниз в клинических центрифуги на 870 x g ~ 1 мин каждый раз. Удалите супернатант.
4. Промойте небольшой 1 мл трубки боросиликатное стекло и длинные стеклянные пипетки Пастера с PBSTw.
5. Добавить ~ 700 мкл PBSTw и использовать длинный стеклянной пипетки Пастера передать небольшой трубки гонад. Используйте несколько дополнительных капель PBSTw чтобы убедиться, что передаются все-гонады.
6. Спин вниз в клинических центрифуги на 870 x g ~ 1 мин с помощью протяжные длинные стеклянные пипетки Пастера, удалить как можно больше жидкости не нарушая гонад. Оставьте не более чем 50 мкл.
   Примечание: Если обнаружение антител не является необходимым, перейдите к шагу 6.

5. выявления антигенов антителами

1. Разбавьте первичных антител в сыворотке 30% в PBS. В настоящем примере антитела анти WAPL-1 является разреженных стоматологов и антитела анти pH3, разбавленных 1: 500. Центрифуга свежей талой сыворотка для 10 мин в отцентрифугировать на 20000 x g при 4 ° C для удаления твердых частиц. Используйте супернатанта, который может храниться при температуре 4 ° C на несколько дней. Используйте соответствующие сыворотки для соответствия организм хозяина вторичных антител (здесь используется козьего сыворотки). Необязательный шаг блокировки могут быть добавлены до введения первичных антител.
2. Применить 100 мкл разбавленного первичного антитела к каждой небольшой стеклянной трубки. Инкубации при комнатной температуре в течение 4 ч.
   Примечание: Время инкубации зависят от антител. Для некоторых антител 2 ч при комнатной температуре является достаточным. Длиннее инкубаций (например., ночь) возможны, но может увеличить фон.
3. Заполните трубы Топ с PBSTw и спин вниз в клинических центрифуги на 870 x g ~ 1 мин.
4. Вымойте гонад, 3 раза с использованием ~ 1 мл PBSTw. инкубировать ~ 5 мин в мыть, чтобы избыток основное антитело для диффундируют в мыть. С помощью протяжные долго стеклянные пипетки Пастера, удалить как можно больше жидкости не нарушая гонад. Оставьте не более чем 50 мкл.
5. Разбавленных вторичных антител в 30% козьего сыворотки в PBS. В настоящем примере каждый коза анти кролик-594 и коза анти мышь-647 разводят в 1: 400.
   Примечание: Выберите вторичные антитела тщательно, чтобы убедиться, что краски отличаются от красителя в комплект EdU. В настоящем примере EdU комплект содержит 488 нм возбуждения красителя.
6. Применить 100 мкл разбавленного вторичные антитела к каждой небольшой стеклянной трубки. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре 2 ч.
   Примечание: Время инкубации зависят от антител. Для некоторых вторичных антител 1 ч при комнатной температуре является достаточным. Длиннее инкубаций (например., ночь) возможны, но может увеличить фон.
7. Вымойте гонад, 3 раза с использованием ~ 1 мл PBSTw. инкубировать ~ 5 мин в мыть, чтобы избыток вторичные антитела к диффундируют в мыть. С помощью протяжные долго стеклянные пипетки Пастера, удалить как можно больше жидкости не нарушая гонад. Оставьте не более чем 50 мкл.
   Примечание: Гонад могут храниться в 100 мкл PBS после этого шага, при необходимости, хотя это может уменьшить сигнал. Удалите перед PBS.

6. Выполните EdU Click реакция обнаружить EdU

Примечание: Выполнение EdU нажмите реакция перед антитело пятная шаги (выполнить шаг 6 до шаг 5) — возможно, в зависимости от антитела используются⁷. Однако, нажмите реагенты могут мешать определенные антигены (например., РЭЦ-8 антитела чувствителен к фиксации и permeabilization). Порядок представления здесь дает яркий антитело пятная с РЭЦ-8, WAPL-1, HIM-3, pH3, флаг и CYE-1 антитела, которые используются, среди других.

1. Подготовьте нажмите EdU коктейль⁸ свежие, добавив следующее к чистой 1,5 мл. Порядок добавления имеет важное значение. Защищать от света и поддерживать все реагенты на льду. Этот рецепт дает достаточно для одного образца (100 мкл); Умножьте рецепт, как требуется.
   1. Добавьте 2 мл сверхчистой воды в буфер присадок. Это делает 10 x буфер добавка, которая должна быть разбавлен до 1 x непосредственно перед использованием.
   2. Добавьте 8,5 мкл буфера 10 x 76,5 мкл ультрачистая вода. Хорошо перемешайте.
   3. Добавьте 4 мкл, 100 мм CuSO₄ (могут быть помечены как компонент E). Хорошо перемешайте.
   4. Добавьте 0,25 мкл 488 нм красителя азид. Его необходимо разморозить при комнатной температуре, как его растворителя, диметилсульфоксида, твердые при 4 ° C. Хорошо перемешайте и защищать от света.
   5. Mix 9 мкл ультрачистая вода с 1 мкл буфера добавка в крышку трубки. Накапайте из крышки добавить оставшиеся коктейль, и смешайте хорошо закупорить вверх и вниз.
2. Выполните EdU нажмите реакции.
   1. Добавьте ~ 100 мкл нажмите EdU коктейль гонады в маленькую трубку. Крышка с Лаборатория кино и Инкубируйте 30-60 мин при комнатной температуре.
   2. После промойте 100 мкл буфера реакции промывки.
   3. Вымойте гонад, 4 раза с использованием ~ 1 мл PBSTw. инкубировать ~ 15 мин в мыть, чтобы разрешить превышение EdU коктейль компонентов диффундируют в мыть. С помощью протяжные долго стеклянные пипетки Пастера, удалить как можно больше жидкости не нарушая гонад. Оставьте не более чем 50 мкл.

7. Выведение ДНК и готовить слайды

1. Добавьте 1 каплю (~ 25 мкл) antifade монтажа среды с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, используемых для визуализации ДНК) к гонад. Подождите несколько минут, поэтому его можно урегулировать и смешать с гонад.
   Примечание: Попеременно, 1:1,000 разбавление DAPI (от 0,1 мг/мл бульона) в PBS могут применяться за 5 мин, следуют 20 мкл 1,4-diazabicyclo [2.2.2] октановое число (DABCO) в 90% глицерина, или другой antifade монтажа средних.
2. Подготовьте площадку агарозы большой 2,5% на стандартный стекло микроскопа.
3. Использовать новый чистый пыли долго стекло пипетка Пастера передать агарозы pad гонад. Держите все жидкости и гонады в узкой нижней части пипетки для сведения к минимуму потерь гонад.
   Примечание: Гонад застрял в небольшой стеклянной трубки или в длинные стекла пипетка Пастера может быть «спасен» полоскания с PBSTw, сбор жидкости в блюдо рассечения и выбора отдельных животных на слайд с ресниц.
4. Используйте для ресниц (или цикла тонких волос), приклеены к зубочистку, чтобы распределить гонады агарозы pad и удалить частицы пыли.
5. Применение coverslip прямоугольные стекла. Ниже, медленно, с одной стороны, чтобы избежать воздушных пузырей. Использование ткани для удаления избыточного решения, таким образом предотвращая coverslip свободно передвигаться.
   Примечание: Выберите coverslips, которые соответствуют к Микроскоп, который будет использоваться. #1 и #1.5 coverslips работают хорошо.
6. Разрешить слайды урегулировать и сухой слегка на ночь при комнатной температуре или 4 ° C. Это позволяет слегка придавить гонад. Слайды должны храниться при 4 ° C.
7. Дополнительно: Уплотнение края слайд с ногтей, или другой слайд герметика. Герметизация углы во-первых, то стороны, предотвращает coverslip от ветра.

8. конфокальная томография и анализ

1. Изображения дистальной Гонада с вращающийся диск Конфокальный микроскоп флуоресцентные оснащены источник света высокой энергии, план apochromatic целями и высокую эффективность камеры микроскопа. Захват изображения с 1 мкм или более жесткие интервалы между z стеки. Принять к сведению лазерной энергии, чувствительность и воздействия времени для всех каналов.
   1. Использовать следующее: 405 нм лазер линии возбуждения с 485 Нм (W60) фильтра выбросов для DAPI, 488 нм лазер линии возбуждения с 527 Нм (W55) фильтра выбросов для EdU, 561 Нм лазер линии возбуждения с 615 Нм (W70) выбросов фильтр для WAPL-1 и 640 Нм лазер линии excita ции с фильтром 705 Нм (W90) выбросов для pH3.
      Примечание: Интенсивности сигнала и фон будет отличаться. Аналогичным образом будет меняться раз необходимые воздействия, возможно до 10 раз.
2. Используйте счетчик соматических клеток плагин²³ в Фиджи^24,25 вручную рассчитывать каждое ядро. Этикетке каждого индивидуального ядро согласно присутствие и отсутствие pH3, EdU и WAPL-1. Используйте классы ядер, описанных в таблице 1 и на рисунке 2, как они будут способствовать все расчеты, изложенные ниже.
   Примечание: Опытные экспериментаторы точно может рассчитывать все ядра в 3D изображения без двойного учета или пропавших без вести любые ядрами. Поочередно один может рассчитывать каждый ядро в каждой плоскости z, и знаки в клеток R сценарий³ может использоваться для удаления умножить подсчитано ядер.
3. Расчет числа клеток и частоты выше считается в зависимости от типа клеточного цикла измерения необходимы. Типы ядер определены в таблице 1 и на рисунке 2. Расчеты приведены в таблице 2.
   1. (Вариант я) Чтобы определить ядер в S-фазе, кормите животных EdU за 30 мин. S-фаза ядра являются любые ядра, отображение метки EdU. Для вычисления, Возьмите сумма A и C ядер, см. таблицу 1 и рис.
      Примечание: В 30 мин EdU импульса в взрослых гермафродитки одичал тип, все EdU помечены ядра совместно Приклеенные этикетку с прародителем зоны маркеры¹.
   2. Чтобы измерить зоне прародителю, пятно с маркером зоны прародитель такие РЭЦ-8 или WAPL-1 антител. Прародитель зона определяется здесь как все nucleoplasmic REC-8¹⁸ или WAPL-1 иммунореактивных микрофлорой ядер. Чтобы вычислить, сумма всех WAPL-1 иммунореактивных ядер (A + B + C + D, см. таблицу 1 и рис. 2).
      Примечание: WAPL-1 также этикетки DTC и ядер соматических гонад, которые не должны учитываться. Соматические ядра являются легко определить по чрезвычайно интенсивным WAPL-1 сигнал, положение слегка за пределами микрофлорой и «жареный яйцо» морфологией ядер.
   3. Для измерения индекса S-фаза, выполнить 30 мин EdU эксперимент и совместно этикетки с РЭЦ-8 или WAPL-1 антител. Индекс S-фазы определяется как доля прародитель зоны, которая находится в S-фазе. Для вычисления, рассчитывать все S-фаза ядра, а затем разделить на общее количество ядер прародитель зоны (A + C / A + B + C + D, см. таблицу 1 и рис. 2).
   4. (Вариант II) Чтобы определить ядер в M-фаза, пятно с антителом pH3. M-фаза ядра являются любые pH3 иммунореактивных ядра. Это работает независимо от продолжительности EdU корма. Чтобы вычислить, Возьмите сумма A и B ядер, см. таблицу 1 и рис.
      Примечание: WAPL-1 также этикетки DTC и ядер соматических гонад, которые не должны учитываться. Соматические ядра являются легко определить по чрезвычайно интенсивным WAPL-1 сигнал, положение слегка за пределами микрофлорой и «жареный яйцо» морфологией ядер.
   5. Для измерения индекса M-фаза, совместно этикетка с pH3 и РЭЦ-8 или антител WAPL-1. M-фаза индекс определяется как доля прародитель зоны, которая находится в M-фазе. Для вычисления, рассчитывать все M-фаза ядра, а затем разделить на общее количество ядер прародитель зоны (A + B / A + B + C + D, см. таблицу 1 и рис. 2).
   6. (Вариант III) Ядер в S-фазе митотического и meiotic оба этикетка с EdU. Чтобы рассказать две популяции врозь, определите ли S-фазе последовало на митоз, мейоз. Чтобы определить, являются ли ядра в S-фазе митотического или аномалий, кормить EdU для 4 h и Сопредседатель метку для pH3 (маркер M-фаза) и HIM-3 (белок оси meiotic хромосома) путем пятнать антитела. Запись ядра, отображающих Эду и pH3 (тип A, см. таблицу 1 и рис. 2) как митотической S-фазы во время ядер, отображающих Эду и HIM-3 (тип E, см. таблицу 1 и рис. 2) как meiotic S-фазе.
   7. (Вариант IV) Рассчитайте продолжительность фазы G2.
      Примечание: G2-этап отделяет S-фазы от M-фазы. Хотя маркер не сообщалось на лейбле G2 в C. elegans микрофлорой, можно рассчитать продолжительность фазы G2 путем объединения данных из нескольких экспериментов, которые ярлык M-фазы (в то время рассечение) и S-фазы (начиная от нескольких часов до рассечение). Ячейки, которая отображает M-фазы и S-фазе маркеры завершил G2-этап в ходе эксперимента. Ячейки, которая отображает только М-фаза маркер и не S-фазе маркер не был в S-фазе во время эксперимента.
      1. Чтобы вычислить продолжительность фазы G2, корма EdU для 2 h и Сопредседатель этикетка с pH3 антитела. Изучите только ядрами, которые ярлык с pH3, (они находятся в M-фазы на момент вскрытия) на наличие Эду (они были в S-фазе в метке EdU 2 ч до вскрытия). Рассчитать долю M-фаза ядер, которые завершили G2-фаза (A / A + B, см. таблицу 1 и рис. 2).
      2. Повторите этот эксперимент с лейблом EdU 3 h и снова с 4 h EdU метку (и, при необходимости, метку EdU 5 h). Участок процент pH3 позитивные ядер, которые являются EdU положительных на оси y и продолжительность EdU метки на оси x, как показано на рисунке 3A.
      3. Рассчитайте средний продолжительность фазы G2, соединяющие точки на графике и определения, где линия пересекает 50%, как показано на рисунке 3A.
      4. Рассчитайте максимальную продолжительность фазы G2, соединяющие точки на графике и определения, где линия пересекает 99%, как показано на рисунке 3A.
   8. (Вариация V) Рассчитайте duraion G2 + M + G1.
      Примечание: В C. elegans микрофлорой, G1 фазе необычно короткий. Хотя сообщается, что маркер не ярлык G1 в C. elegans микрофлорой, можно оценить сумму продолжительность фазы G2, M и G1 и затем сравнить этот время с временем G2-фаза, описанных выше. Максимальная продолжительность G2 + M + G1 оценивается от процент от всех прародитель зоны ядер (WAPL-1 иммунореактивных), которые остаются EdU отрицательный (не претерпела S-фаза) после EdU маркировки на несколько часов.
      1. Чтобы вычислить продолжительность G2 + M + G1, корма EdU для 2 h и Сопредседатель этикетка с РЭЦ-8 или WAPL-1 антител. Определить долю прародитель зоны, которая претерпела S-фазы в это время (A + C / A + B + C + D, см. таблицу 1 и рис. 2).
      2. Повторите этот эксперимент с лейблом EdU 3 h и снова с 4 h EdU метку (и, при необходимости, метку EdU 5 h). Участок процент REC-8 или WAPL-1 позитивные ядер, которые являются EdU положительных на оси y и продолжительность EdU метки на оси x, как показано на рисунке 3B.
      3. Рассчитайте максимальную продолжительность G2 + M + G1, соединяющие точки на графике и найти, где линия пересекает 99%, как показано на рисунке 3B.
         Примечание: Это возможно для выполнения экспериментов для определения продолжительности G2 + M + G1 и G2 как один набор 2, 3, 4 и 5 h EdU экспериментов по совместной маркировки с кролик анти WAPL-1 и мышь анти pH3 антител.
   9. (Вариант VI) Определить ядер, которые реплицируются в зоне прародителя, но с тех пор введенные мейоз, кормите животных EdU для 10 h и Сопредседатель этикетка с РЭЦ-8 или WAPL-1 антител. В течение этих 10 h любой ядер, отображение метки EdU были в S-фазе. Ядра, которые не отображать nucleoplasmic окрашивание REC-8 или WAPL-1 были в мейоз. Просто количество ядер с EdU маркировки не отображающие маркировки с прародителем зоны маркер (E, см. таблицу 1).
      Примечание: Наоборот, если гонад витражи для маркера meiotic профаза HIM-3 с антител анти HIM-3, подсчитать количество ядер с EdU, маркировки, также являются позитивными для HIM-3.
   10. Чтобы вычислить скорость meiotic входа, выполните выше эксперимент с 5 h, 10 h и 15 h лейблом EdU. Участок количество ядер, которые вступили мейоз оси y и продолжительность EdU метки на оси x, как показано на рисунке 3 c. Затем используйте простой линейной регрессии для вычисления на склоне (мейоз ядер вступил в h) от y = mx + b.
       Примечание: Очень важно использовать линейную регрессию для расчета ставки meiotic записи. Было бы неправильно просто разделить количество ядер, которые вписаны мейоз продолжительность EdU лейбла, потому что y пересечение не равен нулю.
   11. (Вариации VII) Измерьте скорость meiotic прогрессирования.
       Примечание: Поскольку EdU ковалентно включены в ДНК, она может использоваться для отслеживания популяция клеток путем дифференциации. Клетки, которые прошли S-фазы в зоне прародитель сохраняют EdU ярлык как они вступить в мейоз, прогресс через мейоз и пройти женских. Пульс Чейз эксперимент с EdU может использоваться для измерения скорости meiotic прогрессии.
       1. Корма бактерий, EdU меченых животных для 4 h («импульс»). Передача животных немеченого ОР50 бактерии для 48 h («Чейз»), а затем вскрыть и совместно ярлык с прародителем зоны маркер такие РЭЦ-8 или WAPL-1 (или маркер meiotic профаза например HIM-3), при желании.
       2. При визуализации, искать позицию наиболее проксимальной EdU меченых ядра. Скорость прогрессирования meiotic расстояние (в ячейке диаметром от конца прародитель зоны) путешествовал на наиболее проксимальной Эду, помечаются ядра во время погони 48 ч.

Поскольку для включения EdU требуется синтез ДНК, можно сделать вывод что EdU меченых ядер претерпевает S-фазы во время окна времени EdU маркировки. Один может интерпретировать ядер что ярлык в 30 мин кормления с EdU, обозначаемый ядер в S-фазе бактерий во время вскрытия. Ядер, которые метки в больше непрерывной EdU кормления эксперимент может назвали рано в окне время и с левой S-фаза, или может помечены в конце части окна времени EdU. EdU сигнал локализует совместно с DAPI сигнала. В некоторых ядрах EdU сигнала охватывает всех хромосом, в то время как в других ядрах EdU сигнал локализуется на 1 – 2 ярких puncta (рис. 4). Эти puncta, скорее всего одну, которая реплицирует поздно в S-фазе¹³.

Здесь, были животных кормили с EdU непрерывно 30 мин и расчлененный, как описано выше и на рисунке 5. Одним из примеров успешного EdU окрашивание молодых взрослых животных и один пример неудачного окрашивания EdU в старых взрослого животного (см. ниже) показана на рисунке 4. EdU сигнал от 30 мин маркировки локализует примерно половину ядра в зоне Прародителя (определяется WAPL-1 антитела маркировки, но аппроксимированы DAPI морфология^26,27,28). Индекс S-фазе, доля зоны прародителю, EdU позитивные, был ранее сообщалось на 57 ±5% и достигает 70% молодых людей в^1,2,3. M-фаза индекс равен приблизительно 2-3%^1,29. В непрерывное питание за 4 ч или более, все ядра в метке прародитель зоны с EdU и некоторые ядра, которые помечены в зоне прародителя с тех пор вступили meiotic профаза¹.

Хотя техника работает последовательно в молодых взрослых животных одичал тип, значительная часть растяжением 5-дневных гермафродитки (даже те, которые содержат спермы) не ярлык в 30 мин EdU импульса (Рисунок 4E). Однако, с 4 h EdU, кормления, почти все эти животные метка. Спорадические неспособность метки в генетических женского животных с короткие импульсы EdU был также сообщил³⁰. Могут существовать другие ситуации, которые приводят к спорадические неспособность к метке.

Можно рассчитать длительность клеточного цикла, выполняя несколько EdU маркировки эксперименты с pH3 маркировки в каждом. Продолжительность G2 оценивалась путем анализа % ядер в M-фазы (pH3 иммунореактивных), которые были EdU положительных во время курса (рис. 6). Этот подход дает средней и максимальной продолжительности G2 (рис. 3A). Медиана времени было интерполяцией, показывая приблизительное G2 продолжительностью 2,5 ч в молодых взрослых гермафродитки. Продолжительность G2 + M + G1 оценивалась от процент от всех прародитель зоны ядер (WAPL-1 иммунореактивных), которые были EdU позитивные (рис. 6). G2 + M + G1 метод обеспечивает максимальную продолжительность мера для комбинированных фаз (рис. 3B). 99-й процентиль времени было интерполяцией, показывающий приблизительную продолжительность G2 + M + G1 3.4 h в молодых взрослых гермафродитки. Данные из те же эксперименты были использованы для расчета ставки meiotic вход (ядер за час). Скорость является наклон линейной регрессии количество ядер, которые вступили мейоз (EdU положительные, отрицательные или HIM-3 положительный WAPL-1) с длительностью метке Эду (рис. 3 c). Значения для 1 день старых взрослых гермафродитки одичал типа приведены в таблице 2.

Рисунок 1: Схема C. elegans микрофлорой и клеточного цикла. (A) клеточного цикла клетки семенозачатка в молодых взрослых Гермафродит микрофлорой. Цифры указывают Приблизительный процент времени, затраченного в каждой стадии клеточного цикла. (Б) у нематоды Caenorhabditis elegans гермафродитки двух U-образных germlines (красный и синий). Сперматека показан желтым и матки с развивающихся эмбрионов показано в темно-серый. Оранжевый пунктирная линия указывает, где животных разделяются для выдавливания germlines. (C) диаграмма развернулось C. elegans микрофлорой. DAPI (синий) является ДНК красителем, который подчеркивает ядерный морфологии. В зоне дистального Прародителя (выделена красным, основанный на Пятнать антитела WAPL-1) содержит mitotically Велоспорт стволовые клетки, клетки-предшественники и клетки в meiotic S-фазе (WAPL-1 также этикетки ядер соматических Гонада). Клетки в S-фазе митотического и meiotic этикетка с 30 мин EdU пульс и указаны в зеленый. Две клетки в M-фазе этикетка с pH3 антитела и отображаются черным цветом. Дистального наконечника клеток (DTC) обеспечивает GLP-1/паз лигандом для сохранять судьбе стволовых клеток этих клеток. Как клетки мигрировать от MS DTC, они выйти из зоны прародителем и введите meiotic профаза. Желтые клетки являются спермы в сперматека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: диаграмма Венна классов ядер. Ядра сгруппированы по присутствия и отсутствия трех маркеров: WAPL-1 указывает зону клетки-предшественники (красный), EdU указывает S-фазе клетки (зеленый), а pH3 M-фаза клетки (синий). Типы клеток определяются как A-G. Обратите внимание, что в молодых взрослых гермафродитки одичал тип клетки типа F не найдены, и клетки метки не совместно с EdU и pH3 вне Прародителя (WAPL-1 положительное) зоны. Дистальной Гонада Диаграмма ниже показывает один пример A-E и G ядер. Для более подробной информации см. таблицу 1 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: графическое представление клеточного цикла продолжительность и скорость meiotic запись экспериментальных данных. (A) продолжительность G2 фазе интерполированный из pH3 и EdU совместно маркировки следующие разнообразны продолжительность EdU импульсов серые линии показывают 50th и 99-й процентили, используемых в интерполяции средней и максимальной длительности G2, обозначается стрелками. (B) ячейку G2, M или G1 фазе не включают EdU. Таким образом максимальная продолжительность фазы G2 + M + G1 может быть оценена путем измерения максимальной продолжительности EdU лейбл, который дает EdU отрицательные клетки. Продолжительность фазы G2 + M + G1 интерполирован Эду и РЭЦ-8 совместно маркировки, следуя разнообразны длительность импульсов EdU. Серая линия указывает 99th персентиль используется в интерполяции максимальная продолжительность G2 + M + G1, указано стрелкой. Это не возможно интерполировать Медиана продолжительности G2 + M + G1. (C) скорость meiotic вступления (в ядрах за h – см. таблицу 2) рассчитывается из наклон линии регрессии. Обратите внимание, что, поскольку y пересечение перехвата не равен нулю, регрессия необходимые для точного расчета ставки meiotic вход (C). . Планки погрешностей указать стандартное отклонение. Данные изменения и перепечатана с разрешения от Фокс et al. 2011 г.¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: пример успешных и неудачных 30 мин EdU пятнать. Конфокальный микроскоп изображения 1 день старые (A-D) и 5-дневных (E-H) Гермафродит Гонада (не спермы истощены) после 30 мин EdU маркировки эксперимент. Пунктирная линия белая знаменует собой окончание прародитель зоны. Звездочка помечает положение дистального наконечника. Зеленые знаки, которые EdU пятнать визуализированное нажмите химии (A). Неудачной EdU маркировки приводит низкоуровневых фон окраски но не яркий EdU + ядер (E). Красные знаки WAPL-1 иммунофлюоресценции (B, F). Желтый цвет означает дублирование (C, G). Синие знаки DAPI окрашивание ДНК (D, H). Один стрелок указывают ядро с EdU окрашивание всей хроматина. Двойной стрелки указывают ядро с EdU puncta на только одной пары хромосом. Изображения были получены с 63 X цели. Шкалы бар = 10 мкм (D, H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: экспериментального процесса. Краткий обзор экспериментального протокола расти (A), EdU метки (B), вскрыть (C), пятно антитела (D), выполните клик реакция придают красителя Эду (E), выведение ДНК (F), изображения germlines (G), и количественно EdU помечены и антитела, окрашенных ядра (H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: пример успешного 4 h EdU пятнать. Конфокальный микроскоп образы 1 день старых взрослых Гермафродит Гонада после 4 ч EdU маркировки эксперимент. Пунктирная линия белая знаменует собой окончание прародитель зоны. Звездочка помечает положение дистального наконечника. Пурпурный знаменует pH3 иммунофлюоресценции (A, C). Зеленые знаки, которые EdU пятнать визуализированное нажмите химии (B, C). Иммунофлюоресценции красные знаки WAPL-1 (D). Желтый цвет обозначает совпадения Эду и WAPL-1 (E). Синие знаки DAPI окрашивание ДНК (F). Один стрелок указывают ядра совместно помечены Эду и pH3. Двойной стрелки знаменует pH3 + EdU ядро - редкое явление в 4 h EdU маркировки. Стрелки Марк EdU + WAPL-1 - ядер, которые ввели мейоз. Изображения были получены с 63 X цели. (F) отображается индикатор масштаба 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Метки:	pH3	EdU *	WAPL-1 или REC-8	ЕМУ-3
Интерпретация:	Митоз	S-фазы *	Прародитель зона	Мейоз
Класс:					Комбинированные интерпретация:
A					в M-фаза в зоне прародителю, были в митотическая S-фазе ходе Эду метки (завершенных G2)
B					в M-фаза в зоне прародителю, были не в S-фазе в ходе Эду этикетки
C					в интерфазе, в зоне прародителю были в S-фазе в ходе Эду этикетки
D					в интерфазе, в зоне прародителю были не в S-фазе в ходе Эду этикетки
E					в мейоз были в meiotic S-фазе в ходе Эду метки (meiotic вход ядер)
F					возвращение в митоз (найдены в некоторых мутантов) или meiotic дивизий (в сперматогенеза)
G					в мейоз были не в S-фазе в ходе Эду этикетки
	Сумма общего pH3 положительный; все ячейки в M-фаза	Сумма общего EdU положительный; все клетки в S-фазе	Общая сумма WAPL-1 положительный;  все ячейки в зоне прародителя	сумма общей положительной HIM-3; все ячейки в профазе meiotic

Таблица 1: классы ядер. * Обратите внимание, что 30 мин и 4 h EdU эксперименты в интерпретации. В длительных экспериментов Эду, клетки вероятно продвинулись за пределы S-фазе. Смотрите введение и Шаг 8 для продолжительности EdU маркировки для соответствующих эксперимента.

Таблица 2: клеточного цикла расчетов. * Буквы представляют классы ядер, определены в таблице 1 и на рисунке 3. Расчеты, изменяются от Fox и др. 2011 г.¹. ** Значения (± стандартное отклонение) одичал тип гермафродитки поднят при 20 ° C, в возрасте 24 h пост середине L4 сцену. Обратите внимание, что, поскольку y пересечение перехвата не равен нулю, регрессия необходимые для точного расчета ставки meiotic записи. G2-индекс определяется путем вычитания S-фазе индекс, индекс M-фаза и приблизительное G1-индекс (2%) от 100%, как описано в Fox et al. 2011¹.

Подготовка EdU меченых бактерий (шаг 1) имеет решающее значение для настоящего Протокола и первой точкой для устранения неполадок. Молодых взрослых гермафродитки одичал тип метки очень надежно в 4 h EdU пульс, что делает этот элемент полезным для каждого нового пакета EdU меченых бактерий. Кроме того нетронутыми EdU меченых бактерии, которые входят ЖКТ (в старых животных или определенных глотки/дробилка дефектных мутантов) будет ярлык с клик-химия и появляются как яркий продолговатые puncta в кишечнике. Альтернативный метод для маркировки гермафродитки использует «замочить» в высокой концентрации (1 мм) EdU³. Эта техника голодает животных на время маркировки, но предоставляет полезный способ обойти делая EdU меченых бактерий при устранении неполадок фиксации и нажмите химии. Если эксперимент EdU «замочить» успешно пока канал EdU нет, затем подготовьте свежие EdU меченых бактерий. Для достижения достаточной плотности бактериальных, обеспечивая при этом высокое содержание Эду, один может потребоваться настроить концентрации Эду и тимидина.

Главное ограничение этого метода для маркировки S-фазы находится в необходимости кормить бактерий, EdU меченых животных. Животные, которые не могут прокормить (вследствие генотип или стадии) не могут быть помечены с этой техникой. Тем не менее Нуклеозидные аналоги в настоящее время единственным методом для выявления S-фаза ядра в C. elegans микрофлорой, и их использование не требует, что любой трансгенов присутствовать в животных. Кроме того после включения, EdU остается в ядрах даже как они выхода S-фаза, прохождения клеточного цикла, разделить или дифференцировать. Сигнал, ослабляет наполовину с каждое деление клеток. Это делает EdU идеально подходит для отслеживания истории клетки даже через несколько клеточных делений.

Стабильность EdU делает пульс Чейз эксперименты простой; просто промойте избыток EdU бактерий от животных после завершения требуемой продолжительности импульса и передаче животных немеченого бактерий. EdU остается в ДНК и остается видимым даже после нескольких клеточных делений. Однако эксперименты ограничены в один тип S-фаза метки (один импульс EdU). Совместной маркировки с EdU и BrdU возможен в mammalian клетках³¹ , но не было сообщено в C. elegans. Совместной маркировки IdU и CldU используется в млекопитающих³² , но также не было сообщено в C. elegans.

Основными преимуществами EdU маркировки, что метод требует не трансгенов, EdU можно скармливать C. elegans во время регулярных культуры, химия совместим с immunofluorescent методами и EdU сохраняется в ДНК в течение длительного времени после кормления остановлена. Эти особенности делают EdU большой инструмент для изучения многих аспектов динамики зародышевых клеток и клеточного цикла.

Зародышевых клеток и клеточного цикла анализа динамики с EdU может применяться целый ряд вопросов. Всего лишь несколько примеров дальнейшего применения этого метода: как изменить динамику клеточного цикла в животных с мутациями гена клеточного цикла? Как физиологических условиях влияет на клеточный цикл в стволовые клетки, скорость зародышевых клеток вступления в профазе meiotic и скорость прогрессирования зародышевых клеток через meiotic профаза? Как меняется клеточного цикла в ходе развития личинок? Как крупных срывов сигнальный путь влияет на клеточный цикл, в дополнение к изменениям в судьбе ячейки (например, внематочная распространения)? Эта система может быть изменен для изучения, что клетки делают во многих различных условиях.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мы благодарны E. coli фондовый центр для MG1693; Wormbase; Центр генетики Caenorhabditis , который финансируется за счет национальных институтов из здравоохранения управление исследовательской инфраструктуры программы (P40OD010440) для штаммов; Zach Pincus статистические консультации; Айпин Фэн реагентов; Люк Шнайдер, Андреа шарф, Sandeep Кумар и Джон Brenner для обучения, консультаций, поддержки и полезной дискуссии; и Корнфельд и Schedl лаборатории для обратной связи на этой рукописи. Эта работа частично поддержали национальные институты здравоохранения [R01 AG02656106A1 к KK, R01 GM100756 к TS] и Национальный научный фонд лектор стипендий [DGE-1143954 и DGE-1745038 с ЗК]. Национальные институты здравоохранения ни Национальный научный фонд имел какую-либо роль в конструкции изучения, сбора, анализа и интерпретации данных, ни в письменной форме рукописи.