Заготовка Venom токсины от убийца ошибок и других насекомых, Heteropteran

Хотя многие насекомых подотряда клопы (Insecta: полужесткокрылые) являются ядовитыми, их состав яда и функции их яд токсинов в основном неизвестных. Этот протокол описывает методы для сбора heteropteran яды для дальнейшей характеризации, используя электростимуляции, притеснения и железы рассечение.

Heteropteran насекомых, таких как убийца (Хищнецы) и гигантских воды ошибок (Belostomatidae) произошли от общего предка хищные и ядовитая, и большинство сохранившихся heteropterans сохранить этот трофических стратегии. Некоторые heteropterans перешли кормления на крови позвоночных (например поцелуи ошибок, Триатомовые клопы; и клопов, постельные клопы) в то время как другие вернулись к питанию растений (наиболее Pentatomomorpha). Однако за исключением слюны, используемые целовать ошибок для облегчения подачи крови, мало что известно о heteropteran яды, по сравнению с яды пауков, скорпионов и змей.

Одним из препятствий для характеризации heteropteran яд токсинов является структура и функции желез яда/губной, которые оба морфологически комплекс и несколько биологических ролями (обороны, добычей захвата и дополнительное устное пищеварение). В этой статье мы опишем три метода, которые мы успешно используется для сбора heteropteran яды. Во-первых мы представляем электростимуляции, как удобный способ собрать яд, который часто является смертельным, когда вводят в добычи животных, и которое устраняет загрязнение железистой ткани. Во-вторых мы покажем, что нежный домогательства животных достаточно для производства экструзии яд от Хоботок и/или ядом плевать в некоторых группах heteropterans. В-третьих мы описываем методы урожай яд токсинов путем рассечения анестезированные животных для получения яд желез. Этот метод дополняет другие методы, поскольку это может позволить Уборка токсины из таксонов, в которых электростимуляции и преследования являются неэффективными. Эти протоколы позволят исследователям собрать токсины от насекомых heteropteran структура функция определения характеристик и возможного применения в медицине и сельском хозяйстве.

Heteropteran яды, мощно биоактивных веществ¹. К примеру яд/слюны выделениями крови кормления клопы как целовать (Триатомовые клопы) и кровать ошибок (постельные клопы) облегчает кормление нарушения гемостаза². Токсины в эти яды целевой несколько путей, включая коагуляции, агрегации тромбоцитов и сужение кровеносных сосудов, а также боль и зуд пути. Яды из большинства других видов heteropteran приспособлены для облегчения хищничество, вместо того, чтобы кровь кормления. Их яды вызывают паралич, смерть и сжижение ткани, когда вводят в беспозвоночных^3,4. Когда вводят в позвоночных, их яд может также иметь серьезные последствия. К примеру инъекции яда из убийца ошибка Holotrichius innesi в позвоночных вызывает боль, паралич мышц и кровотечений; мышей envenomated от этот ошибка быстро умирают из-за паралич дыхания⁵.

Транскриптомики и протеомических исследований выявили белок состав некоторых heteropteran яды. Яды хищные виды богаты протеаз, другие ферменты и пептидов и белков неизвестных структуры и функции^6,,78. Целовать ошибка яд богата triabin белка семьи, члены которых глубоко влиять на коагуляцию, агрегации тромбоцитов и вазоконстрикция^2,9. Однако не известно, какие токсинов лежат в основе большинства bioactivities яда. Например яд целовать ошибки Триатомовые клопы infestans поступили обезболивающее и подавляют натрия каналы¹⁰, однако компоненты, ответственные по-прежнему быть раскрыты. Аналогичным образом не известно, какие элемента(элементов) убийца ошибка яд вызывает паралич или боль. Предпосылкой для определения токсинов, ответственность за bioactivities частности яда и характеризующих структуру и функции Роман яд токсинов, является получение яда.

Яд были получены из heteropterans электростимуляции^{5,6,,78,11,12,13}, провокации обороны ответы^4,8, механически сжимая грудную клетку^12,14,15,16, рассечения, яд желез^{8,17 ,18,19,20,21,22}и применение агонистами ацетилхолина мускариновых рецепторов²³. Судя потенциальные преимущества и недостатки любого метода осложняется морфология heteropteran яд желез, которые состоят из основных железы с двух отдельных люмен, передней основные железы (AMG) и задняя основные железы (PMG), а также связанные аксессуар железы (AG). Эти отсеки разные железы производят секреции различных белков, которые могут быть специализированы для различных биологических функций, включая захват добычу, обороны и дополнительное устное пищеварение^8,17. В peiratine и ectrichodiine убийца ошибок AMG был связан с добычей захвата и PMG с экстра устные пищеварение¹⁷. Однако в harpactorine ошибка Pristhesancus plagipennis PMG специализирован для захвата добычу и пищеварение тогда как AMG предположил выделять оборонительных яд⁸. AG был описан как имеющий мало секреторная функция ошибок убийцы⁸ или как основных сайт хранения протеазы в гигантских воды ошибок²³. Очевидно чтобы уточнить функции каждого отсека железы среди различных подгрупп heteropteran и определить функции большинства яд токсинов необходима дальнейшая работа. В настоящем докладе мы описываем протоколы для уборки яд токсины от heteropterans к этой цели.

Этот протокол соответствует политике университета Квинсленда, изложенных в ответственный подход и использование животных в области преподавания и научных исследований (PPL 4.20.11), а также национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралийский кодекс для ухода за и использования животных для научных целей (8-^й выпуск 2013).

Предупреждение: не заботиться быть envenomated при обработке ошибок убийцы. Позаботьтесь, чтобы защитить глаза при обработке видов, плевать яд оборонительно. Будьте осторожны во всем чтобы не травмировать экспериментальных животных. Это включает в себя мониторинг давления на ограничения такие как резинки и обеспечение того, что Хоботок не нарушается.

Примечание: При необходимости, обезболивают животных под воздействием CO₂ на 0,5-2 мин или охлаждения для 4-10 ° C до яд уборки в цель 1-3 для содействия безопасной передачи и сдержанность. Обезболивания не является строго обязательным, но может способствовать безопасной сдержанность гибкой или сильный образцов. Однако животных должна быть проснулся, чтобы позволить яд уборки. Имейте в виду, нисходящие приложения, при принятии решений или не добавить ингибиторов протеазы.

1. Уборка токсины яд по электростимуляции

1. Получение образцов из которого собрать токсины.
2. Использование предварительно подготовленных пластиковые пинцет с положительным и отрицательным электродами монтируется на либо отзыв. Подключите электрифицированных пинцет электростимулятор или источник постоянного напряжения, что позволяет регулировки напряжения.
   1. Для малых (~ 10 мм) и большие (~ 25 мм) убийца ошибок используйте пика напряжения 15 и 25 V соответственно.
   2. Для более крупных heteropterans таких гигантских воды ошибок используйте до 40 V.
3. Останови живой ошибок путем крепления их к платформе, с использованием резинкой над грудной клетки.
4. Место кончике Хоботок в подходящей собирая подсказки. Ошибок убийцы используете наконечник пипетки P200. Гигантские воды ошибок Отрежьте конечности от оконечности Р200 для увеличения размера апертуры.
   1. Аккуратно поднимите Хоботок с закрытой парой чистого пинцета и нажмите открытой диафрагмой коллекции кончик над конце Хоботок.
   2. При желании, Совет поглощение ~ 5 мкл ультрачистая вода до размещения Хоботок в сборе. Это уменьшает потери яда, оставаясь внутри чаевые, хотя собранные яд будет разведен.
5. Применение электростимуляции. Окуните стимулирующих электродов в проводящего геля, например 2,5 М NaCl/50% глицерина. Применять электроды к грудной клетки. Для belostomatids применяются два электрода к спинной задней поверхности головы.
6. Хранить яд для предотвращения autodegradation. После того, как яд выдавливается, быстро, передача его в трубку при-20 ° C или -60 ° C, или трубка, содержащая ингибитор протеазы коктейль.
7. Повторите шаги 1.5 и 1.6, пока не приобрела достаточно яда или без дальнейших яд поступает.

2. заготовка Venom токсинов, домогательства

1. Готовить животных для уборки яда и поместите кончик Хоботок в коллекции прихожую, как описано в пунктах 1.1 и 1.3-1.4.
2. Если яд экструдированный спонтанно, перейдите к шагу 2.3. Если нет, то беспокоить животных, нежно прикасаясь к нему на ноги, живот и антенн с помощью пинцета пока яд производится.
3. Быстро передавать яд трубку в-20 ° C-60 ° C или трубка содержащий ингибитор протеазы коктейль, при желании.

3. заготовка Venom токсинов от преследования от яда, «Плевать» видов

1. Обезболивают, или частично обезболивают, насекомых перед ее удалением из его корпуса для предотвращения преждевременной оборонительных плевать.
2. Спровоцировать ядом плевать поведение. Содержат и переместите насекомых, используя глубокий крышку стандарта 90 x 16 мм Петри. Держите крышку слегка задний и 1-4 см выше насекомых для предотвращения бегства. Большинство насекомых будет плевать несколько раз, часто в быстрой последовательности. Убедитесь, что все яд собирается в нижней части блюда.
3. Соберите яда на нижней Петри, полоскание с 10 мкл ультрачистая вода. Быстро, передача его в трубку при-20 ° C или -60 ° C, или трубка, содержащая ингибитор протеазы коктейль.

4. заготовка Venom токсинов, рассечение железы

1. Приносить в жертву животных. Сильно обезболивают или убивать животных, с использованием > 5 минут воздействия CO₂. Труба чистая CO₂ непосредственно в воздух отверстия корпуса Корпус животного.
2. PIN-код насекомых рассечение лоток. Ошибок убийцы вскрыть через вентральной поверхности (4.3). Гигантские воды ошибок вскрыть через спинной поверхности (4.4).
3. Вентральной рассечение
   1. Вставьте три штыря в задней брюшной полости для насекомых и удерживайте без проколов яд желез.
   2. Вырежьте короткий срединной линии разреза в брюшной поверхности живота с помощью миниатюрных скальпель. Используйте миниатюрные ножницы для расширения срединной линии разреза кпереди на голове, заботясь, чтобы вырезать экзоскелет только и не повредить внутренние структуры.
   3. Подвергать внутренние структуры, сделайте несколько боковых порезов, простирается от срединной линии разреза в сторону насекомых. Затем контактный обратно каждый взмах вентральной экзоскелет выявить внутренние структуры.
   4. Для больших убийца ошибок сделать четыре боковые разрезы, в середине живота, передней живот, между первым и вторым ног и перед первой ноги.
4. Дорсальная рассечение
   1. Удаление крылья у основания. Вставьте три штыря в задней брюшной полости для насекомых и удерживайте без проколов яд желез.
   2. Вырежьте срединной линии разреза от головы в брюшную полость, с использованием миниатюрных ножницы и скальпеля, заботясь, чтобы вырезать экзоскелет только и не повредить внутренние структуры.
   3. Силу друг от друга две половинки насекомых. Место несколько контактов боково вдоль длины насекомое оставить подвергаются внутренней полости.
   4. Удаление полет мышцы с помощью пинцета.
5. Наводнение рассечение лоток. Добавление PBS до тех пор, пока ошибка погружен разрешить внутренние структуры плавать вверх и быть более легко визуализировать.
6. С помощью микро ножницы и щипчики, осторожно удалите соединительной и нервной ткани и трахеи. Яд желез появляются как удлиненные, светопрозрачные конструкции, вдоль каждой стороны желудочно-кишечного тракта.
   1. Определите основные железы, его характерный внешний вид, с передней и задней лопастями и два короба, встреча в хилус.
   2. При необходимости, определите аксессуар железы путем отслеживания воздуховод от хилус. Бесплатно основные железы путем разрезания два короба, вытекающих из хилус.
7. Сбор желаемых железы люмен. Передать microcentrifuge железы на льду, содержащих 30 мкл PBS или PBS плюс ингибитор протеазы коктейль. Лэнс желез с чистой острым PIN-код.
   1. Вортекс для 10 s и центрифуги (1 мин, 5000 × g, 4 ° C) очистить железы люмен. Удаление железистой ткани, с помощью пинцета.
8. Уточнить экстракт токсин. Центрифуга (5 мин, 17000 × g, 4° C) для удаления твердых частиц, сохраняя супернатант и отменяя гранулы. Хранить при-20 ° C или -60 ° C для предотвращения деградации autoproteolytic.

Некоторые виды heteropteran, например harpactorine P. plagipennis и reduviine Platymeris Радаманте, надежно доходность больших количествах (5-20 мкл) яд в ответ электростимуляции (Таблица 1). В общем большинство peiratine, reduviine и harpactorine ошибок принести яд в ответ на этот метод. Среди stenopodaine ошибок электростимуляция вызвал яд от Oncocephalus sp. но не Thodelmus sp. Holoptiline и emesine ошибок выборки не приносят значительных яда (например достаточно для анализа по масс-спектрометрии) в ответ на электростимуляции. Электростимуляции может также использоваться для урожая яд от belostomatid ошибок и хищных вонючие. Однако электростимуляции воды скорпионы (Водяные скорпионы) индуцированной высвобождения содержимого предлежании желез только, а не яд из Хоботок. Неспособность урожай яд по электростимуляции в некоторых видов скорее всего объясняется морфологических сложности яд желез и физиологических механизмов, контролирующих выпуск яда⁸.

В дополнение к выпускать яд благодаря электростимуляции, reduviids P. plagipennis, Havinthus rufovarius, P. Радаманте и belostomatid Lethocerus distinctifemur, Уилл спонтанно извлечения яда от Хоботок во время обработки. Такой яд отстрела часто сопровождается оборонительных дисплеев. P. Радаманте также плюет яд оборонительно⁴, поведение, которое происходит в змей²⁴ и пауков²⁵ , но которые мы не известно о каких-либо других видов поцелуйными.

SDS-PAGE и протеомики эксперименты показывают, что яды, собирают электростимуляции и домогательства богатых белком^6,,78. Белки приходится значительная часть материала настоящего, хотя это также вероятно, что яды содержат неорганических ионов и других веществ. Убийца ошибка яд, полученные путем электростимуляции и домогательств обычно содержит более ста пептидов и белков (рис. 1, рис. 2). Яд Belostomatid сообщалось ранее быть богатым в lysophospholipids¹³. Спектры поглощения инфракрасного яда от belostomatine воды Баг Diplonychus eques согласуются с содержанием белков и lysophospholipids. Для lethocerine л distinctifemurбыло обнаружено только для белков и не lysophospholipids⁶.

Как сообщалось на паука яды²⁶, яд, добываемых из heteropteran насекомых может меняться в концентрации и композиции, в зависимости от насекомых используются и метод, в которой он собирается. УФ спектроскопия проб разреженных яд предлагает значения поглощения (₂₈₀) 50-250 (длина пути 10 мм) для неразбавленном яд, в соответствии с высоким содержанием белка концентрацию ~ 50-250 мг/мл^7,12,19. Сообщается, что лишение добычу причиной последовательных увеличения в яд концентрации и расслабленного при Овчей Купели потенциальных³ , а также последовательно уменьшается в рН²⁷. Однако длительное голодание приведет к потере состояния и смерти. А также концентрация метод, по которому яд добывается из heteropterans может повлиять на ее состав. Токсин состав яда из убийца ошибка P. plagipennis существенно отличаются в зависимости от того, ли оно было собрано⁸электростимуляции или домогательств. В случае P. plagipennisэто было показано в связи электростимуляции, уступая содержимое ПМГ, тогда как преследование принесли содержимое AMG. Яд получен путем электростимуляции, но не домогательства, мощно парализована хищных насекомых (рис. 3). Однако, неясно, в какой степени этот результат может быть обобщена на другие Хищнецы или других клопы.

Заготовка яд непосредственно путем рассечения яд желез позволяет механизмы контроля яд желез, чтобы быть обойдены, за счет загрязнения с белками (не яд) железистой ткани. Несмотря на это экстракты, полученные из расчлененных материала может использоваться для анализов биологическую/токсичности. Например экстракты ПМГ, AMG и AG P. plagipennis, подготовлен с использованием вышеупомянутого протокола, были проанализированы с использованием жидкого хроматография/тандемные масс-спектрометрии⁸. Этот процесс определяется в общей сложности 182, 114 и 71 белков в общей сложности, из которых 45, 51 и 12 были классифицированы как предполагаемый яд протеины основанные на характеристики последовательность аминокислот, с оставшиеся белки, классифицируются как предполагаемый уборки белков. Инъекции экстрактов ПМГ, но не AMG или AG, в насекомых в результате паралич и смерть⁸.

Таблица 1: Taxon специфику методов, используемых для сбора яда из heteropterans.

Рисунок 1 : Белков, обнаруженных LC-MS/MS анализ 2D SDS-PAGE пятен и HPLC фракций яда собранные от P. plagipennis путем электростимуляции (протокол 1), показывая обильные протеаз, CUB-домен белков и белки heteropteran яд семьи 1. (A) 2D геля SDS-PAGE сырой P. plagipennis яд, показаны семей протеина, выявленные LC-MS/MS гель пятен. (B) ВЭЖХ Хроматограмма от фракционирование P. plagipennis яда, показаны семей протеина, выявленные LC-MS/MS анализ собранных фракций. Воспроизводится с разрешения⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Доля последовательностей, принадлежащих к каждому классу основных белков в яда P. plagipennis. Воспроизводится с разрешения⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : P. plagipennis яд, полученные путем электростимуляции, но не домогательства, парализует насекомых. (A) эффект инъекции яда, полученные путем электростимуляции или домогательства или воде, на крикет бежать. Для каждого условия яд, 0.17 мкл яд эквивалент было впрыснуто в живот и время, чтобы избежать перевернутой Петри блюдо крышкой (в s, до 300 s, среднее ± SD) был забит. (B) доза ответ кривой для ингибирования успех бежать от яда, полученные из P. plagipennis электростимуляции. Воспроизводится с разрешения⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Наиболее важным этапом в уборке убийца ошибка яд является выбор соответствующего метода в зависимости от целей исследования. Каждый из трех методов, представлены для уборки heteropteran яды имеет преимущества и недостатки в зависимости от нисходящие приложения.

Вызывая ошибки высылать яд от Хоботок (протоколы 1-3) позволяет избежать загрязнения яда, железистой ткани. Кроме того эти методы являются нелетального и может повторяться много раз в течение жизни ошибка. Электростимуляция обычно обеспечивает наибольшее количество яда и урожаи яд с мощным токсичности с добычей насекомых согласно несколько исследований^5,8. Провоцируя защитную реакцию является еще одним способом выяснить яд от Хоботок и один, который может принести яд содержание различных белка для электростимуляции⁸. Однако, электростимуляция и провокации не работают для многих видов, и без параллельных расследований производства секреторную яд желез неясно, какой просвет железы (или комбинации железы люмен) собирают.

Уборка урожая яд, рассечение (протокол № 4) — во многих отношениях дополняет. Рассечение представляет собой прямой способ для доступа к хранимой яд, и каждый отсек яд желез может быть собрано отдельно или пуле (то есть, возможность, что «неправильный» яд собран является отпала). Однако метод является смертельной и дополнительно вызывает незначительное загрязнение яда ткани компонентами. Многие клопы слишком мал (или слишком удлиненные в случае Emesinae, поток legged ошибок) разрешить яд уборке рассечение. Если рассечение используется для извлечения белков из отсеков отдельных железы отдельно, важно быстро отделить лопастями и извлечь их содержимое отдельно, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

Представленные здесь методы должны быть изменены в зависимости от конкретного вида учился. Для коллекции яд, электростимуляция основные аспекты оптимизации являются, как ошибка является сдержанным. Например большинство reduviids имеют возможность расширить их Хоботок в широком диапазоне движения. Эти виды могут быть просто сдержанный право способ вверх на платформе с использованием резинкой, и Хоботок вывернута вручную. Для видов с менее гибкими Хоботок, таких как belostomatids вместо этого необходимо сдерживать насекомых в перевернутом положении и Нижняя емкость коллекции под правильным углом, с помощью реторты или механической рукой. Масштабы и характер электроэнергии применяется также должны быть оптимизированы, и в этом случае, это лучше для низких и медленно увеличивайте приложенного напряжения во избежание летальность.

Если цель исследования достичь детального понимания как особого вида производит и использует яд, углубленное исследование, комбинирования несколько лесозаготовительных методов, а также технологии, такие как масс-спектрометрии и РНК-Seq экспериментов, может быть Обязательно. Если целью является использовать яды heteropteran как библиотеки биологических молекул, чтобы проверяться для некоторых желаемых биологической активности, то группа образцов яд получено электростимуляции, притеснения, и/или вскрытие может быть подходящим. Однако мы отмечаем, что нормальный Биологическая роль яда собирают вероятно определить, какие bioactivities присутствуют. Например яд для хищничество, скорее всего, содержат инсектицидных соединений, в то время как яд для обороны, скорее всего, содержат агенты болезненные (вызывая боль).

Мы не включили яд урожай приложением пилокарпин агонист рецептора мускариновых ацетилхолина в настоящем Протоколе. Будущие эксперименты необходимо определить характеристики пилокарпин индуцированной яд высылки по сравнению с выше методов.

В этой статье мы представили методы, которые позволят исследователям получить яды из heteropteran насекомых. Успешное яд коллекции позволит дальнейшие расследования в производство, состав, функции и эволюция яда в клопы. Кроме того некоторые heteropteran токсины могут найти утилиту как эко-инсектициды, ведущий молекул развивать человека терапии, или научные инструменты для изучения биологических систем.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мы признаем финансовую поддержку от Австралийский исследовательский совет (гранты DP130103813 и LP140100832 к G.F.K., ПОЛУПРОЗРАЧНЫЕ стипендий DE160101142 до EABU), австралийского национального здравоохранения и Совета медицинских исследований (основных исследовательских стипендий APP1044414 к G.F.K.) и университета штата Квинсленд (докторантура стипендий для A.A.W.).