Иммунопреципитация хроматина (ChIP) в линиях Т-клеток мыши

В этой работе описывается протокол иммунопреципитации хроматина (ChIP) с использованием зрелой мышиной линии Т-клеток. Этот протокол подходит для исследования распределения конкретных меток гистонов на конкретных сайтах-промоторах или в геноме.

Сигнальные пути регулируют программы экспрессии генов посредством модуляции структуры хроматина на разных уровнях, таких как посттрансляционные модификации (ПТМ) хвостов гистонов, обмен каноническими гистонами с вариантами гистонов и выселение нуклеосом. Такое регулирование требует связывания чувствительных к сигналу факторов транскрипции (ТФ), которые набирают хроматин-модифицирующие ферменты в регулятивных элементах, определяемых как усилители. Понимание того, как сигнальные каскады регулируют активность энхансера, требует всестороннего анализа связывания TF, ферментов, модифицирующих хроматин, и заполнения специфических гистоновых меток и вариантов гистонов. Анализы иммунопреципитации хроматина (ChIP) используют высокоспецифичные антитела к иммунопреципитации специфических комплексов белка / ДНК. Последующий анализ очищенной ДНК позволяет идентифицировать область, занятую белком, распознаваемым антителом. Эта работа описывает протокол для эффективного управленияRform ChIP белков гистонов в зрелой линии Т-клеток мыши. Представленный протокол позволяет проводить анализы ChIP в разумные сроки и с высокой воспроизводимостью.

Развитие, дифференцировка и гомеостаз зависят от конкретных программ экспрессии генов, которые устанавливаются сигнальными событиями, которые модулируют структуру хроматина и, следовательно, определяют, активирован или репрессирован конкретный ген, специфичным для клеток и времени. Во время развития Т-клеток необходимо установить специфические программы экспрессии генов, чтобы правильно определить созревание предшественников Т-клеток из двойного отрицательного (DN) в однополюсное состояние (SP), проходя через несколько промежуточных этапов ¹ . Как динамическая регуляция программы экспрессии генов в процессе развития Т-клеток широко исследовалась в предыдущие годы несколькими лабораториями ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} .

В результате посттрансляционных модификаций (ПТМ) гистонов обменКанонические гистоны с вариантами гистонов, выселение нуклеосом и метилирование ДНК регулируют переключатель ON / OFF генов. Несколько групп исследовали распространение генома РММ и вариантов гистонов в геноме для определения меток, связанных с различными состояниями хроматина как в проксимальной, так и в дистальной областях регуляции ^{7 , 8 , 9 , 10} . Сигнализационные каскады организуют динамическую регуляцию хроматина посредством обмена положительными и отрицательными хроматин-модифицирующими ферментами (также известными как модификаторы хроматина) у конкретных энхансерных элементов. Эти модификаторы хроматина регулируют структуру хроматина и, следовательно, выход транскрипции, например, путем динамического метилирования гистонов и ацетилирования. Это имеет место в канале ^{11 , 12 , 13} сигнализации Notch ^,14.

Динамические гистоновые ПТМ; Обмены с вариантами гистонов; И динамическое заполнение гистонов, факторов транскрипции и кофакторов может быть исследовано с помощью анализов хроматина иммунопреципитации (ChIP). Для очистки специфических ДНК-белковых комплексов используют высокоспецифичные антитела, а очищенную ДНК анализируют с помощью количественной ПЦР (qPCR); Глубокое упорядочение (ChIP-Seq); Или, реже, в настоящее время, гибридизацию с микрочипом (ChIP-ChIP).

Анализы ChIP иногда сложны из-за осложнений с лизису клеток, срезанием хроматина и / или низкой специфичностью антител. Было принято несколько стратегий для улучшения протокола, как это имеет место для NEXSON ¹⁵ . Использование охлаждающих водяных ванн позволяет избежать нагревания образцов, которые могут повредить эпитопы, присутствующие на исследуемом белке, но энергия, необходимая для сдвига образцов, рассеивается в воде.Еще одно улучшение было достигнуто при разработке сфокусированных устройств ультразвуковой диагностики, которые препятствуют диспергированию энергии. Поэтому сфокусированные ультразвуковые устройства позволяют улучшить лизис клеток и сдвиг хроматина, устраняя вызванные оператором вариации и значительно увеличивая воспроизводимость.

Эта работа описывает протокол (схематический обзор на рисунке 1 ) для эффективного выполнения ChIP белков гистонов в зрелой мышиной T-клеточной линии E2-10HA ^{16 , 17} . Т-клетки обычно трудно лизировать, и было обнаружено, что сдвиг их хроматина неэффективен. В этом протоколе, который использует охлаждающий сфокусированный ультразвуковой преобразователь, количество ячеек, буфер лизиса и настройка сдвига были оптимизированы для линии Т-клеток мыши E2-10HA. Этот протокол позволяет выполнять ЧИП с высокой воспроизводимостью и в разумные сроки. Фактически, это требованиеПримерно через два дня, чтобы срезать хроматин и оценить качество срезания, и три дня для проведения иммунопреципитации, переверните сшивку и очистите ДНК.

ПРИМЕЧАНИЕ. Все буферы и среда, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице 1 .

Дни 1 и 2

1. Сшивание клеток

1. Перенесите мышиные Т-клетки из 6-луночного планшета в трубку объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 5 мин при 4 ° С и ~ 271 х г. Ресуспендируют клеточный осадок в 30 мл культуральной среды клеток IMDM и подсчитывают клетки с использованием камеры Нойбауэра.
2. Собирайте аликвоты 20 × 10 ⁶ клеток в новые 50 мл пробирки.
3. Добавить формальдегид (FMA) до конечной концентрации 1% непосредственно в среду для культивирования клеток и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
   Осторожно: FMA токсичен при вдыхании, поэтому работайте под вытяжным колпаком и надевайте надлежащее защитное оборудование. Кроме того, обращайтесь с отходами FMA в соответствии с правилами принимающего учреждения.
4. Добавьте 1/8-объем 1 М глицина, pH 7,0 и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
5. Гранулируют клетки центрифугированием в течение 5Мин при 4 ° С и ~ 271 хг и промыть 10 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
6. Промывают клеточный осадок 1 мл PBS и переносят в 1,5 мл пробирки.

2. Лизис клеток и резка хроматина

1. Ресуспендируют клеточный осадок в 1 мл буфера для лизиса SDS и инкубируют на льду в течение 10 мин.
2. Перенесите каждый образец в трубку для ультразвуковой обработки и выполните сдвиг с помощью сфокусированного ультразвукового устройства в соответствии с настройками, указанными в таблице 2.
3. После сдвига перенесите образцы в 1,5 мл пробирки и центрифугируйте в течение 10 минут при 4 ° C и ~ 18000 x g.
4. Перенесите супернатант в новые трубки.
5. Соберите 50 мкл для определения эффективности сдвига в соответствии со стадией 3 и защелкните замороженный лизат в жидком азоте. Храните лизат в одноразовых аликвотах при -80 ° C.

3. Определение эффективности среза

1. Добавить 50 мкл буфера для элюирования в 50 &181; L каждого срезанного лизата и инкубировать при 65 ° С в течение ночи, со встряхиванием.
2. Добавьте 100 мкл ТЕ-буфера и 4 мкл 10 мг / мл РНКазы А (конечная концентрация 0,2 мкг / мкл). Смешать и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С, сотрясая.
3. Добавьте 2 мкл 20 мг / мл протеиназы К (0,2 мкг / мкл конечной концентрации) к каждому образцу и инкубируйте в течение 2 ч при 55 ° С при встряхивании.
4. Перенесите каждый образец в гель-трубку, подходящую для экстракции фенол / хлороформ / изоамиловый спирт; В соответствии с инструкциями производителя.
5. Добавить 200 мкл фенола / хлороформа / изоамилового спирта (25: 24: 1) и встряхнуть трубки. Центрифуга в течение 5 минут при 24 ° C и ~ 16 000 xg и перенос верхней фазы на новые трубки.
   Осторожно: фенол, хлороформ и изоамиловый спирт являются токсичными при вдыхании и коррозии; Работайте под вытяжным шкафом и надевайте надлежащее личное защитное оборудование. Кроме того, обрабатывать фенол, хлороформ и изоамиловый спиртВ соответствии с правилами принимающего учреждения.
   1. Повторите один раз.
6. Очистите ДНК с помощью колонок очистки в соответствии с инструкцией изготовителя со следующими изменениями:
   1. Промойте мембрану дважды. После последней стирки оставляйте трубу открытой в течение 2 мин при комнатной температуре для испарения остаточного этанола.
   2. Для элюирования добавьте 50 мкл H ₂ O, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин, закрутите пробирку в течение 1 с для надлежащего смачивания мембраны и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин перед элюированием ДНК центрифугированием в течение 1 мин при 24 ° C и ~ 17 900 x g.
7. Количественный анализ очищенной ДНК на флюорометре с использованием набора с высокой чувствительностью в соответствии с инструкциями производителя.
8. Проанализируйте приблизительно 500 нг очищенной ДНК на 1,8% агарозном геле и приблизительно 1 нг на электрофоретической системе с использованием набора с высокой чувствительностью.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Ожидаемый результатE фрагментов ДНК составляет от 200 до 500 пар оснований.

Дни 3 и 4

4. Иммунопреципитация

1. Разбавьте 1 объем срезанного лизата с 5 объемами буфера для разведения.
2. Пречистите 30 мкл / мл белковых агарозных гранул (приготовленных согласно Приложению А ) в течение 30 мин при вращении в холодной комнате.
3. Центрифуга при 4 ° С в течение 5 мин при ~ 750 х g.
4. Соберите 10% входного сигнала и храните его при 4 ° C.
5. Выровняйте необходимое количество лизата в новые пробирки (подробности см. В таблице 3 ). Добавьте необходимые антитела в каждую пробирку (см. Таблицу 3 ) и вращайте ее в течение ночи при 4 ° C.
6. Добавить 40 мкл белковых гранул А и инкубировать в течение 1 ч при 4 ° С при вращении.
7. Вымойте шарики 1 мл буфера с низким содержанием соли, буфера с высоким содержанием соли, буфера LiCl и буфера TE (для каждой промывки инкубируйте в течение 5 мин при 4 ° С при вращении и центрифугеВ течение 3 мин при 4 ° С и ~ 950 мкг). Подробную информацию см. В таблице 3 .
8. Добавить 110 мкл буфера для элюирования и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре, встряхивая каждые 2 мин.
9. Центрифугируют в течение 3 мин при 4 ° С и ~ 950 мкг и переносят 100 мкл супернатанта в новую пробирку объемом 1,5 мл.
10. Повторите шаги 4.7-4.8 с помощью 100 мкл буфера для элюирования и объедините элюаты. Добавьте буфер элюции до 200 мкл для ввода образцов.
11. Инкубируйте все образцы в течение ночи при 65 ° C, сотрясая.

День 5

5. Очистка ДНК

1. Добавьте 200 мкл ТЕ-буфера в каждый элюат и 8 мкл 10 мг / мл РНКазы А (конечная концентрация 0,2 мкг / мкл). Смешать и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С, сотрясая.
2. Добавьте 4 мкл 20 мг / мл протеиназы К (0,2 мкг / мкл конечной концентрации) в каждый элюат и инкубируйте в течение 2 ч при 55 ° С, сотрясая.
3. Перенесите каждый образец в гельПробирка, подходящая для экстракции фенол / хлороформ / изоамиловый спирт; В соответствии с инструкциями производителя.
4. Добавить 400 мкл фенола / хлороформа / изоамилового спирта (25: 24: 1) и встряхнуть трубки. Центрифуга в течение 5 мин при 24 ° С и ~ 16 000 х г. Перенесите верхнюю фазу на новые трубки.
   Осторожно: фенол, хлороформ и изоамиловый спирт являются токсичными при вдыхании и коррозии; Работайте под вытяжным шкафом и надевайте надлежащее личное защитное оборудование. Кроме того, обрабатывайте отходы фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соответствии с правилами принимающего учреждения.
   1. Повторите один раз.
5. Очистите ДНК с помощью колонок очистки в соответствии с инструкциями производителя со следующими изменениями:
6. Промойте мембрану дважды. После последней промывки оставьте трубки открытыми в течение 2 мин при комнатной температуре для испарения остаточного этанола.
7. Для элюирования добавьте 50 мкл H ₂ O, инкубируйте при комнатной температуреПовтор ют в течение 1 мин, вращают пробирки в течение 1 с дл надлежащего смачивани мембраны и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин перед элюированием ДНК путем центрифугировани в течение 1 мин при 24oC и ~ 17,900 & bull; g.

Зрелые мышиные Т-клетки подвергали анализу ChIP для исследования обогащения монометилирования метки гистоном лизина 4 на гистоне 3 (H3K4me1), триметилировании лизина 4 на гистоне 3 (H3K4me3) и ацетилировании лизина 27 на Гистона 3 (H3K27ac), а также при загрузке нуклеосом, как показано panH3 ChIP. Качество среза оценивали анализом на 1,8% агарозном геле ( фиг. 2А ) и на электрофоретической системе ( фиг. 2В ). H3K4me1 и H3K4me3 обычно используются для идентификации сайтов-энхансеров и промоторов соответственно ( фиг. 3А ). Фактически, H3K4me3 является заметным, но не исключительно обогащенным промоторами ^{5 , 8 , 14} . Характеристика активных энхансеров должна быть высоко обогащена для H3K4me1 и H3K27ac и плохо обогащена для H3K4me3 (<Сильный класс = «xfig»> Рисунок 3A, верхняя панель), тогда как неактивные усилители представляют низкие уровни H3K4me3 и H3K27ac, но высокие уровни H3K4me1 ( рисунок 3A , нижняя панель). Как показано на фиг.3В , ген Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( Gapdh ) является репрезентативным для анализа активных промоторов генов ( промотор Gapdh ). Фактически, он показывает высокие уровни H3K4me3 и H3K27ac и низкие уровни H3K4me1. На рисунке 3B Deltex1 ( Dtx1 ) представляет собой неактивные энхансеры ( усилитель Dtx1 ), поскольку он высоко обогащен H3K4me1 и плохо обогащен для H3K4me3 и H3K27ac. Джин-пустыня является репрезентативной для региона, в котором отсутствуют кодирующие гены, и обычно применяется в качестве отрицательного контроля для активных меток хроматина. Наблюдение, что H3K4me1, хорошо принятая энхансерная отметка ^{4 , 5 , 7 , 14 , 18} , не обогащается в Джин-пустыне, говорит о том, что в этом регионе отсутствуют энхансеры.

Рисунок 1: Схематический обзор представленного протокола ChIP. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Контроль качества среза зрелой мышиной линии Т-клеток. ( А ). Две различные аликвоты линии Т-клеток зрелой мыши E2-10HA были сдвинуты и приблизительно 500 нг очищенной ДНК были проанализированы на 1,8% агарозном геле для оценки их сдвигаКачества. ( B ) 1 нг очищенной ДНК из образца 2 анализировали электрофорезом для оценки его качества сдвига. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Хроматиновые метки, которые характеризуют усилители и промоторы. ( A ) Активные энхансеры (верхняя панель) характеризуются высоким H3K4me1, низким H3K4me3 и высоким H3K27ac, тогда как неактивные энхансеры (нижняя панель) имеют высокий H3K4me1, низкий H3K4me3 и низкий H3K27ac. ( B ) Образцы, представленные на фиг. 2A , объединяли вместе и использовали для анализа ChIP по сравнению с гистоновыми метками H3K4me1, H3K4me3 и H3K27ac и заполнением гистонов, как показано PanH3 ChIP. Этот анализ показывает, чтоE промотор гена домашнего хозяйства Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( промотор Gapdh ) высоко обогащен для H3K4me3 и H3K27ac и слабо обогащен для H3K4me1. С другой стороны, энхансер неактивного гена Deltex1 ( усилитель Dtx1 ) сильно обогащен для H3K4me1, но плохо обогащен для H3K4me3 и H3K27ac. ChIP с использованием антитела panH3 использовали для исследования активности нуклеосом. Джин-пустыня использовалась как отрицательный контроль. Показан один представительный эксперимент. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Список буферов и среды, используемой в этом протоколе.

Таблица 2: Параметры сдвига, используемые в этом протоколе . Эти условия были оптимизированы для зрелой мышиной линии Т-клеток.

Таблица 3: Антитела и условия стирки, используемые в этом исследовании.

Таблица 4: Грунты и зонды, используемые для qPCR в этом исследовании.

Таблица 5: Поиск и устранение неисправностей.

ChIP является допустимым методом для исследования того, обогащены ли белки или их ПТМ в определенных геномных областях. Результаты анализа ChIP часто сложно интерпретировать по биологическим или техническим причинам. Биологические причины многообразны и включают слабое или непрямое связывание белков с ДНК. Существуют также технические ограничения, такие как ограниченная специфичность антител и неэффективный клеточный лизис или сдвиг хроматина. Руководство по поиску и устранению неисправностей ( Таблица 5 ) может помочь читателю решить проблемы, которые могут возникнуть при анализе ChIP.

Этот протокол, используя охлаждающее сфокусированное ультразвуковое устройство, позволяет эффективно сдвигать хроматин зрелой мышиной линии Т-клеток. Основной критический шаг протокола представлен сдвигом хроматина, который всегда должен быть оптимизирован для каждого типа ячейки. Предлагается варьировать количество ячеек и количество циклов обработки ультразвуком. Кроме того, она На эффективность реакции отрицательно влияет присутствие осадка SDS в образцах, которое может образоваться при лизении клеток на льду с помощью буфера для лизиса SDS. В этом случае лучше всего инкубировать образец после лизиса при комнатной температуре в течение нескольких минут, чтобы уменьшить присутствие осадков SDS. Рекомендуется оптимизировать протокол для получения срезанных фрагментов от 200 до 500 пар оснований и всегда оценивать качество срезанных образцов перед проведением иммунопреципитации. Кроме того, время фиксации, количество антитела и / или клеток и условия стирки должны быть оптимизированы для каждого антитела.

Еще одним важным шагом в успешном выполнении процедуры ChIP является выбор антитела, поскольку антитела с низкой специфичностью значительно снижают эффективность иммунопреципитации. Ранее единая процедура проверки качества позволила оценить специфичность нескольких антител, доступных на рынке Ss = "xref"> 19. Просеивающий трубопровод был основан на дот-блоте, вестерн-блоте и ChIP, предоставляя список высококачественных реагентов, подходящих для ChIP ¹⁹ . Совсем недавно специфика нескольких коммерчески доступных антител оценивалась с использованием высокоплотных гистоновых пептидных микроматричных платформ, позволяющих создать базу данных по специфичности антител ²⁰ . Читатель может использовать этот полезный инструмент для определения наиболее специфических антител, которые могут быть использованы для экспериментов ChIP.

Этот протокол не был протестирован для первичных Т-клеток, и в этом случае читатель должен ссылаться на другие опубликованные протоколы, которые успешно выполняют ChIP на первичных Т-клетках ^{3 , 4 , 21} . Примечательно, что этот протокол был успешно использован для выполнения ChIP на линии T-клеток прародителя мыши, а также на линии эндотелиальных клеток мыши.

Этот протокол также можно было бы модифицировать для выполнения ChIP на эндогенных белках, которые не связываются непосредственно с ДНК. В этом случае может потребоваться предварительная фиксация белково-белковыми сшивающими агентами ( например, диметиладипимидатом, DMA) (дополнительную информацию см . В приложении B ). Успешное выполнение ChIP на кофакторах ранее выполнялось с помощью сверхэкспрессирующих белков, которые слиты с биотином. В этом случае белок очищали стрептавидином-конъюнктомБыли выполнены магнитные бусины и предварительная фиксация с помощью DMA ²² .

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Мы благодарны П. Кэсе и Т. Шмидт-Вёлл за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана совместным исследовательским грантом TRR81 и программой Гейзенберга (BO 1639 / 5-1) DFG (Германский исследовательский фонд), Общество Макса Планка и EXC 294 во Фрайбурге и Кластер Excellence для сердечно-легочной системы (ECCPS) в Гиссене с туберкулезом