마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

시그널링 경로는 히스톤 테일의 번역 후 변형 (PTM), 히스톤 변이체와의 표준 히스톤 교환 및 뉴 클레오 솜 퇴거와 같은 상이한 수준에서 염색질 구조의 조절을 통해 유전자 발현 프로그램을 조절한다. 이러한 조절은 인핸서 (enhancers)로 정의 된 조절 요소에서 염색질 변형 효소를 모집하는 신호 감수성 전사 인자 (signal-sensitive transcription factors, TF)의 결합을 필요로한다. 신호 전달 계통이 enhancer 활동을 조절하는 방법을 이해하려면 TF, 염색질 변형 효소의 결합, 특정 히스톤 마크로 및 히스톤 변이체의 점유에 대한 포괄적 인 분석이 필요합니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 분석은 특이 적 항체를 이용하여 특정 단백질 / DNA 복합체를 면역 침전시킨다. 정제 된 DNA의 후속 분석은 항체에 의해 인식되는 단백질에 의해 점유 된 영역을 확인하게한다. 이 작업은 효율적으로 pe성숙 마우스 T 세포주에서 histone 단백질의 rform 칩. 제시된 프로토콜은 합리적인 시간 프레임 및 높은 재현성으로 ChIP 분석의 수행을 가능하게한다.

발달, 분화 및 항상성은 염색질 구조를 조절하는 시그널링 사건에 의해 확립 된 특정 유전자 발현 프로그램에 의존하기 때문에 특정 유전자가 세포 및 시간 특이 적 방식으로 활성화되거나 억제되는지를 결정한다. T 세포 발달 과정에서 여러 개의 중간 단계 ¹ 을 거쳐 이중 네거티브 (DN)에서 단일 포지티브 (SP) 상태로 T 세포 전구체의 성숙을 올바르게 결정하기위한 특정 유전자 발현 프로그램을 수립해야합니다 ¹ . T 세포 발달 과정에서 유전자 발현 프로그램이 어떻게 동적으로 조절되는지는 지난 몇 년 동안 여러 실험실에서 ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 번 조사} 되었다.

히스톤의 번역 후 변형 (PTM)에 의해,히스톤 변이가있는 표준 히스톤, 뉴 클레오 솜 퇴거 및 DNA 메틸화는 유전자의 ON / OFF 스위치를 조절합니다. 여러 그룹이 PTM과 히스톤 변이체의 게놈 전체 분포를 조사하여 근위 및 원위의 조절 영역 ^{7 , 8 , 9 , 10} 에서 다른 염색질 상태와 관련된 표지를 결정했습니다. 시그널링 캐스케이드는 특정 인핸서 요소에서 양성 및 음성 염색질 변형 효소 (염색질 변형 제로도 알려짐)의 교환을 통해 동적 인 염색질 조절을 조율합니다. 이러한 염색질 변형 제는 염색질 구조를 조절하여 예를 들어 동적 히스톤 메틸화 및 아세틸 화에 의한 전사 결과를 조절합니다. 이것은 Notch 신호 전달 경로 ^{11 , 12 , 13 ,}14.

동적 히스톤 PTM; 히스톤 변이체와 교환; 히스톤, 전사 인자 및 보조 인자의 동적 인 점유는 염색질 면역 침전 (ChIP) 분석에 의해 조사 될 수있다. 고도로 특이적인 항체를 사용하여 특정 DNA- 단백질 복합체를 정제하고 정제 된 DNA를 정량적 PCR (qPCR)로 분석합니다. 심층 시퀀싱 (ChIP-Seq); 또는 요즘에는 마이크로 어레이 (ChIP-ChIP)와의 하이브리드 화가 적습니다.

칩 분석은 세포의 용해, 염색질의 전단 및 / 또는 항체의 낮은 특이성으로 인해 때로는 어려움을 겪습니다. NEXSON ¹⁵ 와 마찬가지로 프로토콜을 개선하기위한 몇 가지 전략이 채택되었습니다. 냉각 수 욕조 소니 케이 터의 사용은 조사중인 단백질에 존재하는 에피토프를 손상시킬 수있는 시료 가열을 피할 수 있지만 시료의 전단에 필요한 에너지는 물에 분산됩니다.에너지의 분산을 방지하는 집속 된 초음파 장치의 개발로 또 다른 개선이 이루어졌습니다. 따라서 초점을 맞춘 초음파 장치는 세포 용해 및 염색질 전단에서의 개선을 허용하여 조작자 - 유도 된 변이를 제거하고 재현성을 현저히 증가시킵니다.

이 작업은 E2-10HA ^{16 , 17} 이라고 불리는 성숙한 마우스 T 세포주에서 히스톤 단백질의 ChIP을 효율적으로 수행하기위한 프로토콜 ( 그림 1의 개략도)을 설명합니다. T 세포는 보통 용해하기가 어렵고, 염색질의 전단은 비효율적 인 것으로 밝혀졌습니다. 냉각 집중 초음파 장치를 사용하는이 프로토콜에서는 E2-10HA 마우스 T 세포주에 대해 세포 수, 용해 완충액 및 전단 설정이 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 높은 재현성과 합리적인 시간에 ChIP을 수행 할 수있게합니다. 사실, 그것은 requir염색질을 전단하고 전단력의 품질을 평가하고 약 3 일 동안 면역 침전을 수행하고 교차 결합을 역전 시키며 DNA를 정제하는 데 약 2 일이 소요됩니다.

참고 :이 프로토콜에 사용 된 모든 버퍼와 매체는 표 1 에 나열되어 있습니다.

1 일과 2 일

1. 셀과 가교 결합하기

1. 6 잘 접시에서 50 ML 튜브와 4 분 5 분 동안 원심 분리기에서 마우스 T - 세포를 전송 ° C와 ~ 271 X G. IMDM 세포 배양 배지 30 ML에 세포 펠렛을 Resuspend하고 Neubauer 챔버를 사용하여 셀을 계산합니다.
2. 새로운 50 mL 튜브에 20 x 10 ⁶ 세포의 분취 량을 수집하십시오.
3. 포름 알데히드 (FMA)를 세포 배양 배지에 1 % 최종 농도로 첨가하고 10 분 동안 실온에서 배양하십시오.
   주의 : 흡입하면 FMA가 유독하므로 흄 후드 아래에서 작업하고 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 또한 호스트 기관의 규정에 따라 FMA 폐기물을 처리하십시오.
4. 1/8 볼륨의 1M 글리신 (pH 7.0)을 넣고 실온에서 5 분간 품어 둔다.
5. 5 일 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛 화4 ° C 및 ~ 271 xg에서 10 분간 인산 완충 식염수 (PBS) 10 mL로 세척한다.
6. PBS 1 ML 및 1.5 ML 튜브로 전송 세포 펠렛을 씻으십시오.

2. 세포 용해 및 크로 마틴 절단

1. SDS 용해 버퍼 1 ML에 세포 펠렛을 Resuspend하고 10 분 동안 얼음에 품어.
2. 각 샘플을 초음파 처리 튜브로 옮기고 표 2 에 표시된 설정에 따라 집중된 초음파기를 사용하여 전단을 수행하십시오 .
3. 전단 후, 샘플을 1.5 mL 튜브에 옮기고 4 ℃에서 10 분간 원심 분리하고 ~ 18,000 x g.
4. 상층 액을 새 튜브로 옮긴다.
5. 50 μL를 수집하여 3 단계에 따라 전단 효율을 결정하고 전단 된 용해 액을 액체 질소로 스냅 프리즈하십시오. lysate를 -80 ° C에서 단일 사용 분취 량으로 보관하십시오.

3. 전단 효율의 결정

1. 50 & amp;각각의 전단 된 용 해물을 181 ㎕ 씩 넣고 흔들어 주면서 밤새 65 ℃에서 배양한다.
2. TE 완충액 100 μL와 10 MG / ML RNase A (0.2 μg / μL 최종 농도) 4 μL를 추가합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 혼합하고 품어, 흔들어 섞으십시오.
3. 2 μL의 20 mg / mL proteinase K (0.2 μg / μL 최종 농도)를 각 시료에 첨가하고 55 ° C에서 2 시간 동안 배양하고 흔들어 섞으십시오.
4. 각 샘플을 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 추출에 적합한 겔 튜브로 옮긴다. 제조업체의 지침에 따라 취급하십시오.
5. 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 200 μL를 넣고 튜브를 흔든다. 24 ° C 및 ~ 16,000 XG에서 5 분간 원심 분리하고 상층을 새로운 튜브로 옮긴다.
   주의 : 페놀, 클로로포름, 이소 아밀 알코올은 흡입하면 부식성이있다. 흄 후드에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 또한 페놀, 클로로포름 및 이소 아밀 알코올 폐기물 처리주관 기관의 규칙에 따라
   1. 한 번 반복하십시오.
6. 다음의 수정 사항과 함께 제조사의 지시에 따라 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하십시오 :
   1. 멤브레인을 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 후 튜브를 실온에서 2 분 동안 열어두고 잔여 에탄올을 증발시킵니다.
   2. 용출을 위해, 50 μL의 H ₂ O를 첨가하고, 실온에서 1 분 동안 인큐베이션하고, 막을 적절하게 적시는데 1 초 동안 스핀시키고, 실온에서 1 분 동안 인큐베이션하여, 1 분 동안 원심 분리하여 DNA를 용출시킨다 24 ° C ~ 17,900 X g.
7. 제조 업체의 지침에 따라 고감도 키트를 사용하여 형광 분석기에서 정제 DNA를 정량하십시오.
8. 1.8 % 아가 로스 겔에서 약 500 ng의 정제 된 DNA를 분석하고 고감도 키트를 사용하는 전기 영동 시스템에서 약 1 ng을 분석합니다.
   참고 : 예상 크기e는 200 내지 500 bp이다.

3, 4 일째

4. 면역 침전

1. 5 부피의 희석 완충액으로 전단 된 용 해물 1 부피를 희석한다.
2. 30μL / ML 단백질 A 아가로 오스 비즈 ( 부록 A에 따라 준비)와 미리 차가운 방에서 회전하면서 30 분.
3. ~ 750 x g에서 5 분간 4 ℃에서 원심 분리하십시오.
4. 투입물의 10 %를 모으고 4 ° C에 보관하십시오.
5. 원하는 분량의 용 해물을 새로운 튜브에 분주하십시오 (자세한 내용은 표 3 참조). 각 튜브에 원하는 항체를 추가하고 (자세한 내용은 표 3 참조) 4 ° C에서 밤새 회전하십시오.
6. 회전하는 동안 단백질 A 비즈 40 μL를 추가하고 4 ° C에서 1 시간 동안 품어 둡니다.
7. 낮은 소금 버퍼, 높은 소금 버퍼, LiCl 버퍼 및 TE 버퍼 (각 씻어에 대한 4 분 ° C.에 5 분 품어 회전 및 원심 분리기 1 ML의 구슬을 씻으십시오4 ℃에서 3 분, ~ 950 xg). 자세한 내용은 표 3 을 참조하십시오.
8. 용리 버퍼 110 μL를 추가하고 매 2 분 vortexing 실온에서 15 분 품어.
9. 4 ° C에서 3 분 동안 원심 분리기와 ~ 950 XG 및 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는의 100 μL를 전송합니다.
10. 용리 완충액 100 μL로 4.7-4.8 단계를 반복하고 용리액을 합치십시오. 샘플을 입력하기 위해 최대 200 μL의 용리 완충액을 첨가하십시오.
11. 모든 샘플을 65 ° C에서 밤새 인큐팅하여 흔들어 섞으십시오.

5 일째

5. DNA 정제

1. 각 용리액에 TE 완충액 200 μL와 10 mg / mL RNase A (0.2 μg / μL 최종 농도) 8 μL를 넣는다. 37 ° C에서 2 시간 동안 혼합하고 품어, 흔들어 섞으십시오.
2. 20 μg / mL proteinase K 4 μL (0.2 μg / μL 최종 농도)를 각 용리액에 첨가하고 55 ° C에서 2 시간 동안 항온 배양하십시오.
3. 각 샘플을 젤로 옮기십시오.페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 추출에 적합한 튜브; 제조업체의 지침에 따라 취급하십시오.
4. 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 400 μL를 넣고 튜브를 흔든다. 24 ° C 및 ~ 16,000 X g에서 5 분간 원심 분리하십시오. 상층을 새로운 튜브로 옮긴다.
   주의 : 페놀, 클로로포름, 이소 아밀 알코올은 흡입하면 부식성이있다. 흄 후드에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 또한 호스트 기관의 규정에 따라 페놀, 클로로포름 및 이소 아밀 알코올 폐기물을 처리하십시오.
   1. 한 번 반복하십시오.
5. 다음의 수정 사항과 함께 제조 업체의 지침에 따라 정제 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하십시오 :
6. 멤브레인을 두 번 씻으십시오. 마지막 씻은 후 잔여 에탄올을 증발 실온에서 2 분 동안 튜브를 열어 둡니다.
7. 용출을 위해, 50 μL의 H ₂ O를 첨가하고, 실온에서 배양한다다시 1 분 동안 24 ° C에서 1 분간 원심 분리하여 DNA를 용리시키기 전에 실온에서 1 분 동안 배양하고 ~ 17,900 x g.

성숙한 쥐의 T 세포를 ChIP 분석하여 히스톤 3 (H3K4me1)에 대한 리신 4의 모노 메틸화, 히스톤 3 (H3K4me3)에 대한 리신 4의 트리 메틸렌 화, 및 리신 27의 아세틸 화 히스톤 3 (H3K27ac)뿐만 아니라 panH3 칩에 의해 밝혀 뉴 소 솜 점유. 전단 품질은 1.8 % 아가 로즈 겔 ( 그림 2A ) 및 전기 영동 시스템 ( 그림 2B )에 대한 분석에 의해 평가되었습니다. H3K4me1과 H3K4me3은 일반적으로 각각 인핸서 사이트와 프로모터를 식별하는 데 사용됩니다 ( 그림 3A ). 사실, H3K4me3는 발기인 ^{5 , 8 , 14} 에서 두드러지게 나타나지만 배타적이지는 않습니다. 활성 증강 인자의 특성은 H3K4me1 및 H3K27ac에 대해 고도로 강화되고 H3K4me3에 대해서는 풍부하게 농후하게된다 (<비활성 패널은 H3K4me3과 H3K27ac의 낮은 수준을 나타내지 만 높은 수준의 H3K4me1을 보였다 ( 그림 3A , 하부 패널). 도 3B 에 나타낸 바와 같이 , 글리세롤 알데히드 3- 인산 탈수소 효소 ( Gapdh ) 유전자는 활성 유전자 프로모터 ( Gapdh 프로모터 )의 분석을 대표한다. 사실, H3K4me3과 H3K27ac의 높은 수준과 H3K4me1의 낮은 수준을 보여줍니다. 도 3b 에서, Deltex1 ( Dtx1 )은 H3K4me1에 대해 고도로 농축되고 H3K4me3 및 H3K27ac에 대해서는 불충분하게 풍부하므로, 비활성 인핸서 ( Dtx1 인핸서 )를 대표한다. 유전자 사막 은 코딩 유전자가없는 지역의 대표이며, 일반적으로 활성 염색질 표지에 대한 음성 대조군으로 고소됩니다. H3K4me1이 잘 받아 들여지는 인핸서 마크 ^{4 , 5 , 7 , 14 , 18} 번은 진 사막 에서 풍성하지 않다.이 지역에는 인핸서가 없다.

그림 1 : 제시된 ChIP 프로토콜의 개략 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 성숙한 마우스 T - 세포 라인의 전단 품질 관리. ( A ) 성숙한 마우스 T 세포주 E2-10HA의 2 개의 상이한 분취 량을 전단하고 약 500 ng의 정제 된 DNA를 1.8 % 아가 로스 겔에서 분석하여 이들의 전단을 평가 하였다ing 품질. ( B ) 샘플 2의 정제 DNA 1ng을 전기 영동으로 분석하여 전단 품질을 평가 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 인핸서와 프로모터를 특징 짓는 크로마 틱 마크. ( A ) 액티브 인핸서 (상부 패널)는 높은 H3K4me1, 낮은 H3K4me3 및 높은 H3K27ac을 특징으로하는 반면, 비활성 인핸서 (낮은 패널)는 높은 H3K4me1, 낮은 H3K4me3 및 낮은 H3K27ac을 나타낸다. ( B ) 그림 2A 에 제시된 샘플을 함께 모아 ChIP 분석 대 H3K4me1, H3K4me3 및 H3K27ac 히스톤 마크와 히스톤 점유, panH3 칩에 의해 밝혀졌다. 이 분석은 the 프로모터 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( Gapdh promoter )는 H3K4me3과 H3K27ac에 대해 매우 농축되어 있으며 H3K4me1에 대해서는 풍부하게 농축되어있다. 한편, 비활성 유전자 Deltex1 ( Dtx1 인핸서 )의 인핸서 는 H3K4me1에 대해 고도로 농축되지만 H3K4me3 및 H3K27ac에 대해서는 풍부하게 농축되지 않는다. panH3 항체를 사용하는 칩을 사용하여 뉴 소솜 점유를 조사 하였다. 유전자 사막 은 음성 대조군으로 사용되었다. 하나의 대표적인 실험이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1 :이 프로토콜에 사용 된 버퍼 및 매체 목록.

표 2 :이 프로토콜에서 사용 된 전단 설정. 이러한 조건은 성숙한 마우스 T 세포주에 최적화되었습니다.

표 3 :이 연구에서 사용 된 항체 및 세척 조건.

표 4 :이 연구에서 qPCR에 사용 된 프라이머 및 프로브.

표 5 : 문제 해결.

ChIP는 단백질 또는 그 PTM이 특정 게놈 영역에서 풍부하게되는지 여부를 조사하는 유효한 기술입니다. ChIP 분석 결과는 종종 생물학적 또는 기술적 인 이유로 해석하기가 어렵습니다. 생물학적 인 이유는 여러 가지이며 DNA에 약하거나 간접적으로 결합하는 단백질을 포함합니다. 제한된 항체 특이성 및 비효율적 인 세포 용해 또는 염색질 전단과 같은 기술적 한계도 있습니다. 문제 해결 가이드 ( 표 5 )는 독자가 ChIP 분석에서 발생할 수있는 문제를 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 프로토콜은 냉각 집중 초음파 장치를 사용하여 성숙한 마우스 T 세포주의 염색질을 효율적으로 전단 할 수 있습니다. 프로토콜의 주요 중요 단계는 각 세포 유형에 대해 항상 최적화되어야하는 염색질의 전단으로 표현됩니다. 세포 수와 sonication주기의 수를 변화시키는 것이 좋습니다. 게다가, 그녀는 활성 효율성은 샘플에서 SDS 침전물의 존재에 의해 부정적으로 영향을받으며, 이는 SDS 용해 완충액으로 얼음 위에서 세포를 분해하는 동안 형성 될 수있다. 이 경우 SDS 침전물의 존재를 줄이기 위해 실온에서 몇 분 동안 용해한 후 시료를 배양하는 것이 가장 좋습니다. 200 ~ 500 bp 사이에서 절단 된 단편을 얻고 면역 침전을 진행하기 전에 시료의 전단 품질을 항상 평가하기 위해 프로토콜을 최적화하는 것이 좋습니다. 또한, 고정 시간, 항체 및 / 또는 세포의 양 및 세척 조건은 각각의 항체에 대해 최적화되어야한다.

저 특이성 항체가 면역 침강의 효율을 현저히 감소 시킴에 따라 ChIP 절차를 성공적으로 수행하는 데있어 한 가지 더 중요한 단계는 항체의 선택입니다. 이전에는 통일 된 품질 검사 절차를 통해 시장에서 판매되는 여러 항체의 특이성을 평가할 수있었습니다 ss = "xref"> 19. 선별 파이프 라인은 도트 블랏, 웨스턴 블랏 및 ChIP을 기반으로 ChIP ^19에 적합한 고품질 시약 목록을 제공합니다. 보다 최근에는 여러 상업적으로 이용 가능한 항체의 특이성을 고밀도 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여 평가하여 항체 특이성에 대한 데이터베이스를 확립했다. 독자는이 유용한 도구를 사용하여 ChIP 실험에 사용할 수있는 가장 구체적인 항체를 확인할 수 있습니다.

이 프로토콜은 기본 T 세포에 대해 테스트되지 않았으며,이 경우 판독기는 기본 T 세포 ^{3 , 4 , 21} 에서 ChIP를 성공적으로 수행하는 다른 게시 된 프로토콜을 참조해야합니다. 주목할 만하게,이 프로토콜은 성공적으로 마우스 progenitor T - 세포 라인뿐만 아니라 마우스 내피 세포 라인에 대한 칩을 수행하는 데 사용되었습니다.

이 프로토콜은 또한 DNA에 직접적으로 결합하지 않는 내인성 단백질에서 ChIP을 수행하도록 변형 될 수 있습니다. 이 경우 단백질 - 단백 가교제 ( 예 : 디메틸 아디 피 미딘, DMA)를 사전 고정해야 할 수 있습니다 (자세한 내용은 부록 B 참조). 보조 인자에 대한 ChIP의 성공적인 수행은 이전에 biotin-tag에 융합 된 단백질을 과발현함으로써 이루어졌습니다. 이 경우 단백질을 streptavidin-conjuga자성 비드를 넣고 DMA로 사전 고정시켰다.

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.

탁월한 기술 지원에 대해 P. Käse와 T. Schmidt-Wöll에게 감사드립니다. 이 연구는 DFG (독일 연구 재단)의 공동 연구 보조금 TRR81 및 Heisenberg 프로그램 (BO 1639 / 5-1), Freiburg의 Max Planck Society 및 EXC 294, Cardio Pulmonary System의 우수 클러스터 (ECCPS) - Giessen에서 TB까지