Immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) dans les lignes de cellules T de souris

Ce travail décrit un protocole pour l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) en utilisant une ligne de cellules T mûres de souris. Ce protocole est approprié pour étudier la répartition des marques d'histones spécifiques sur des sites promoteurs spécifiques ou génométriques.

Les voies de signalisation régulent les programmes d'expression des gènes via la modulation de la structure de la chromatine à différents niveaux, par exemple par des modifications post-traductionnelles (PTM) des queues d'histones, l'échange d'histones canoniques avec des variantes d'histones et l'éviction des nucléosomes. Une telle réglementation nécessite la liaison de facteurs de transcription sensibles au signal (TF) qui recrutent des enzymes modifiant la chromatine à des éléments réglementaires définis comme des amplificateurs. Comprendre comment les cascades de signalisation régulent l'activité de l'amplificateur nécessite une analyse complète de la liaison des TF, des enzymes modifiant la chromatine et l'occupation des marques d'histones spécifiques et des variantes d'histones. Les essais d'immunoprécipitation de Chromatine (ChIP) utilisent des anticorps hautement spécifiques pour immunoprécipiter des complexes protéines / ADN spécifiques. L'analyse ultérieure de l'ADN purifié permet d'identifier la région occupée par la protéine reconnue par l'anticorps. Ce travail décrit un protocole efficaceRform ChIP des protéines d'histone dans une lignée de cellules T mûres de souris. Le protocole présenté permet la réalisation de tests ChIP dans un délai raisonnable et avec une grande reproductibilité.

Le développement, la différenciation et l'homéostasie dépendent de programmes spécifiques d'expression des gènes qui sont établis en signalant des événements qui modulent la structure de la chromatine et déterminent donc si un gène spécifique est activé ou réprimé de manière spécifique à la cellule et au temps. Pendant le développement des lymphocytes T, des programmes spécifiques d'expression des gènes doivent être établis pour déterminer correctement la maturation des précurseurs de cellules T du double négatif (DN) à l'état à un seul positif (SP), passant par plusieurs étapes intermédiaires ¹ . La façon dont le programme d'expression des gènes est régulée de manière dynamique pendant le développement des lymphocytes T a été largement étudiée au cours des années précédentes par plusieurs laboratoires ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} .

Par les modifications post-traductionnelles (PTM) des histones, l'échange deLes histones canoniques avec des variantes d'histones, l'éviction des nucléosomes et la méthylation de l'ADN régulent l'interrupteur ON / OFF des gènes. Plusieurs groupes ont étudié la distribution à l'échelle du génome des PTM et des variantes d'histones pour déterminer les marques associées à différents états de la chromatine aux régions régulatrices proximale et distale ^{7 , 8 , 9 , 10} . Les cascades de signalisation orchestrent la régulation dynamique de la chromatine via l'échange d'enzymes positives et négatives de modification de la chromatine (également appelées modificateurs de la chromatine) à des éléments spécifiques de l'amplificateur. Ces modificateurs de la chromatine régulent la structure de la chromatine et donc la production transcriptionnelle, par exemple par la méthylation et l'acétylation des histones dynamiques. C'est le cas dans la voie de signalisation Notch ^{11 , 12 , 13 ,}14.

PTM des histones dynamiques; Échanges avec des variantes histoniques; Et l'occupation dynamique des histones, des facteurs de transcription et des cofacteurs peuvent être étudiés par les tests de l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP). Des anticorps hautement spécifiques sont utilisés pour purifier des complexes ADN-protéines spécifiques, et l'ADN purifié est analysé par PCR quantitative (qPCR); Séquençage profond (ChIP-Seq); Ou, moins fréquemment aujourd'hui, l'hybridation au microarray (ChIP-ChIP).

Les tests de ChIP sont parfois difficiles en raison de complications avec la lyse des cellules, du cisaillement de la chromatine et / ou de la faible spécificité des anticorps. Plusieurs stratégies ont été adoptées pour améliorer le protocole, comme c'est le cas pour NEXSON ¹⁵ . L'utilisation de sonicateurs de bain d'eau de refroidissement évite le chauffage par échantillonnage qui pourrait endommager les epitopes présents sur la protéine sous enquête, mais l'énergie requise pour le cisaillement des échantillons est dispersée dans l'eau.Une autre amélioration a été faite avec le développement de dispositifs d'ultrasons focalisés qui empêchent la dispersion de l'énergie. Par conséquent, les dispositifs à ultrasons focalisés permettent des améliorations de la lyse cellulaire et du cisaillement de la chromatine, éliminant les variations induites par l'opérateur et augmentant considérablement la reproductibilité.

Ce travail décrit un protocole (schématique de la figure 1 ) pour effectuer efficacement le ChIP des protéines histoniques dans une lignée de cellules T souris mûres appelée E2-10HA ^{16 , 17} . Les lymphocytes T sont généralement difficiles à lisser, et le cisaillement de leur chromatine a été révélé être inefficace. Dans ce protocole, qui utilise un ultrasons focalisé par refroidissement, le nombre de cellules, le tampon de lyse et le réglage de cisaillement ont été optimisés pour la ligne de cellules T de souris E2-10HA. Ce protocole permet de réaliser ChIP avec une reproductibilité élevée et dans un délai raisonnable. En fait, il requiertEst environ deux jours pour cisailler la chromatine et pour évaluer la qualité du cisaillement, et trois jours pour effectuer l'immunoprécipitation, inverser la réticulation et purifier l'ADN.

REMARQUE: tous les tampons et le support utilisé dans ce protocole sont répertoriés dans le tableau 1 .

Jours 1 et 2

1. Reticulation des cellules

1. Transférer les cellules T de souris d'une plaque à 6 puits à un tube de 50 ml et centrifuger pendant 5 min à 4 ° C et ~ 271 x g. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 ml de milieu de culture cellulaire IMDM et compter les cellules en utilisant une chambre Neubauer.
2. Recueillir des aliquotes de 20 x 10 ⁶ cellules dans de nouveaux tubes de 50 ml.
3. Ajouter du formaldéhyde (FMA) à une concentration finale de 1% directement sur le milieu de culture cellulaire et incuber à température ambiante pendant 10 min.
   Attention: FMA est toxique si inhalé, alors travaillez sous une hotte et utilisez un équipement de protection adéquat. De plus, manipulez les déchets FMA conformément aux règles de l'établissement hôte.
4. Ajouter un volume de 1/8 de glycine 1 M, pH 7,0, et incuber à température ambiante pendant 5 min.
5. Pellet les cellules par centrifugation pour 5Min à 4 ° C et ~ 271 xg et laver avec 10 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS).
6. Laver le culot cellulaire avec 1 mL de PBS et le transférer dans des tubes de 1,5 mL.

2. Lysis cellulaire et cisaillement de la chromatine

1. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 mL de tampon de lyse SDS et incuber sur de la glace pendant 10 min.
2. Transférer chaque échantillon sur un tube à sonication et effectuer un cisaillement à l'aide d'un ultrasons focalisé selon les paramètres indiqués dans le Tableau 2.
3. Après le cisaillement, transférer les échantillons dans des tubes de 1,5 mL et centrifuger pendant 10 min à 4 ° C et ~ 18 000 x g.
4. Transférer le surnageant sur de nouveaux tubes.
5. Recueillir 50 μL pour déterminer l'efficacité de cisaillement selon l'étape 3 et congéler le lysat cisaillé dans l'azote liquide. Conserver le lysat dans des aliquotes à usage unique à -80 ° C.

3. Détermination de l'efficacité du cisaillement

1. Ajouter 50 μL de tampon d'élution aux 50 et #181; L de chaque lysat cisaillé et incuber à 65 ° C pendant la nuit, avec agitation.
2. Ajouter 100 μL de tampon TE et 4 μL de RNase A 10 mg / mL (0,2 μg / μl de concentration finale). Mélanger et incuber pendant 2 h à 37 ° C, avec agitation.
3. Ajouter 2 μL de 20 mg / mL de protéinase K (0,2 μg / μl de concentration finale) à chaque échantillon et incuber pendant 2 h à 55 ° C, avec agitation.
4. Transférer chaque échantillon dans un tube de gel approprié pour l'extraction de phénol / chloroforme / alcool isoamylique; Manipuler selon les instructions du fabricant.
5. Ajouter 200 μL de phénol / chloroforme / alcool isoamylique (25: 24: 1) et secouer les tubes. Centrifugez pendant 5 min à 24 ° C et ~ 16 000 xg et transférez la phase supérieure à de nouveaux tubes.
   Attention: le phénol, le chloroforme et l'alcool isoamylique sont toxiques lorsqu'ils sont inhalés et sont corrosifs; Travailler sous une hotte et porter un équipement de protection individuelle adéquat. Aussi, manipuler le phénol, le chloroforme et les déchets d'alcool isoamyléConformément aux règles de l'établissement hôte.
   1. Répéter une fois.
6. Purifier l'ADN en utilisant des colonnes de purification selon les instructions du fabricant, avec les modifications suivantes:
   1. Lavez la membrane deux fois. Après le dernier lavage, laisser le tube ouvert pendant 2 min à température ambiante pour évaporer l'éthanol résiduel.
   2. Pour l'élution, ajouter 50 μL de H ₂ O, incuber à température ambiante pendant 1 min, faire tourner le tube pendant 1 s pour bien mouiller la membrane et incuber à température ambiante pendant 1 min avant d'éluer l'ADN par centrifugation pendant 1 min à 24 ° C et ~ 17,900 x g.
7. Quantifier l'ADN purifié sur un fluorimètre en utilisant un kit de haute sensibilité conformément aux instructions du fabricant.
8. Analyser environ 500 ng de l'ADN purifié sur un gel d'agarose 1,8% et environ 1 ng sur un système d'électrophorèse en utilisant un kit à haute sensibilité.
   REMARQUE: le siz attenduE des fragments d'ADN se situe entre 200 et 500 pb.

Jours 3 et 4

4. Immunoprécipitation

1. Diluer 1 volume de lysat cisaillé avec 5 volumes de tampon de dilution.
2. Preclérar avec 30 μL / mL de protéines Une perle d'agarose (préparée selon l' Annexe A ) pendant 30 minutes en tournant dans la chambre froide.
3. Centrifuger à 4 ° C pendant 5 min à ~ 750 x g.
4. Collectez 10% de l'entrée et rangez-le à 4 ° C.
5. Aliquotez la quantité souhaitée de lysat dans de nouveaux tubes (voir le tableau 3 pour plus de détails). Ajouter les anticorps souhaités pour chaque tube (voir le tableau 3 pour plus de détails) et faire tourner pendant une nuit à 4 ° C.
6. Ajouter 40 μL de perles de protéine A et incuber pendant 1 heure à 4 ° C pendant la rotation.
7. Laver les perles avec 1 mL de tampon à faible teneur en sel, tampon à sel élevé, tampon LiCl et tampon TE (pour chaque lavage, incuber pendant 5 minutes à 4 ° C tout en faisant tourner et centrifugerPendant 3 min à 4 ° C et ~ 950 xg). Voir le tableau 3 pour plus de détails.
8. Ajouter 110 μl de tampon d'élution et incuber pendant 15 minutes à température ambiante, tourbillonner toutes les 2 min.
9. Centrifuger pendant 3 min à 4 ° C et ~ 950 xg et transférer 100 μL de surnageant à un nouveau tube de 1,5 ml.
10. Répétez les étapes 4.7-4.8 avec 100 μL de tampon d'élution et combinez les éluats. Ajouter un tampon d'élution jusqu'à 200 μL pour entrer les échantillons.
11. Incuber tous les échantillons pendant une nuit à 65 ° C, avec agitation.

Jour 5

5. Purification de l'ADN

1. Ajouter 200 μL de tampon TE à chaque éluat et 8 μL de RNase A à 10 mg / mL (0,2 μg / μl de concentration finale). Mélanger et incuber pendant 2 h à 37 ° C, avec agitation.
2. Ajouter 4 μL de 20 mg / mL de protéinase K (0,2 μg / μl de concentration finale) à chaque éluat et incuber pendant 2 h à 55 ° C, avec agitation.
3. Transférer chaque échantillon dans un gelTube adapté à l'extraction de l'alcool phénolique / chloroforme / isoamylique; Manipuler selon les instructions du fabricant.
4. Ajouter 400 μl de phénol / chloroforme / alcool isoamylique (25: 24: 1) et secouer les tubes. Centrifuger pendant 5 min à 24 ° C et ~ 16 000 x g. Transférer la phase supérieure vers de nouveaux tubes.
   Attention: le phénol, le chloroforme et l'alcool isoamylique sont toxiques lorsqu'ils sont inhalés et sont corrosifs; Travailler sous une hotte et porter un équipement de protection individuelle adéquat. En outre, manipulez le phénol, le chloroforme et les déchets d'alcool isoamylique selon les règles de l'établissement hôte.
   1. Répéter une fois.
5. Purifier l'ADN en utilisant des colonnes de purification selon les instructions du fabricant, avec les modifications suivantes:
6. Lavez la membrane deux fois. Après le dernier lavage, laisser les tubes s'ouvrir pendant 2 min à température ambiante pour évaporer l'éthanol résiduel.
7. Pour l'élution, ajouter 50 μL de H ₂ O, incuber à température ambiantePendant 1 min, faire tourner les tubes pendant 1 s pour bien mouiller la membrane et incuber à température ambiante pendant 1 minute avant d'éluer l'ADN par centrifugation pendant 1 min à 24 ° C et ~ 17 900 x g.

Les cellules T murines mûres ont été soumises à une analyse de ChIP pour étudier l'enrichissement de la mono-méthylation de la lysine 4 sur histone 3 (H3K4me1), la tri-méthylation de la lysine 4 sur l'histone 3 (H3K4me3) et l'acétylation de la lysine 27 sur Histone 3 (H3K27ac), ainsi que l'occupation des nucléosomes, révélée par panH3 ChIP. La qualité de cisaillement a été évaluée par analyse sur un gel d'agarose à 1,8% ( figure 2A ) et sur un système d'électrophorèse ( figure 2B ). H3K4me1 et H3K4me3 sont généralement utilisés pour identifier les sites et promoteurs d'amplificateurs, respectivement ( figure 3A ). En fait, H3K4me3 est important mais pas exclusivement enrichi aux promoteurs ^{5 , 8 , 14} . Une caractéristique des amplificateurs actifs doit être fortement enrichie pour H3K4me1 et H3K27ac et peu enrichie pour H3K4me3 ( Figure 3A, panneau supérieur), alors que les amplificateurs inactifs présentent de faibles niveaux de H3K4me3 et H3K27ac mais des niveaux élevés de H3K4me1 ( Figure 3A , panneau inférieur). Comme le montre la figure 3B , le gène de la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase ( Gapdh ) est représentatif de l'analyse des promoteurs de gènes actifs ( promoteur Gapdh ). En fait, il présente des niveaux élevés de H3K4me3 et H3K27ac et de faibles niveaux de H3K4me1. Dans la figure 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) est représentatif des amplificateurs inactifs ( amplificateur Dtx1 ), car il est très enrichi pour H3K4me1 et peu enrichi pour H3K4me3 et H3K27ac. Gene desert est représentatif d'une région dépourvue de gènes de codage et est généralement poursuivi en tant que témoin négatif pour les marques de chromatine actives. L'observation que H3K4me1, une marque amélioratrice bien acceptée ^{4 , 5 , 7 , 14 , 18} , n'est pas enrichi au désert génétique suggère que cette région manque d'améliorateurs.

Figure 1: Aperçu schématique du protocole ChIP présenté. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Contrôle de la qualité de cisaillement de la ligne de cellules T matures de la souris. ( A ) Deux aliquotes différentes de la lignée de lymphocytes T de souris matures E2-10HA ont été cisaillées et environ 500 ng d'ADN purifié ont été analysés sur un gel d'agarose à 1,8% pour évaluer leur cisaillementQualité. ( B ) On a analysé 1 ng d'ADN purifié de l'échantillon 2 par électrophorèse pour évaluer sa qualité de cisaillement. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Les marques de chromatine qui caractérisent les amplificateurs et les promoteurs. ( A ) Les amplificateurs actifs (panneau supérieur) se caractérisent par un H3K4me1 élevé, un H3K4me3 faible et un H3K27ac élevé, alors que les amplificateurs inactifs (panneau inférieur) présentent un H3K4me1 élevé, un H3K4me3 faible et un H3K27ac faible. ( B ) Les échantillons présentés dans la figure 2A ont été combinés et utilisés pour l'analyse de ChIP par rapport aux marques d'histones H3K4me1, H3K4me3 et H3K27ac et l'occupation des histones, comme l'a révélé PanH3 ChIP. Cette analyse montre que thLe promoteur du gène ménager Glyceraldehyde 3-phosphate déshydrogénase ( promoteur Gapdh ) est fortement enrichi pour H3K4me3 et H3K27ac et faiblement enrichi pour H3K4me1. D'autre part, l' amplificateur du gène inactif Deltex1 ( amplificateur Dtx1 ) est très enrichi pour H3K4me1 mais peu enrichi pour H3K4me3 et H3K27ac. ChIP utilisant un anticorps panH3 a été utilisé pour étudier l'occupation des nucléosomes. Gene desert a été utilisé comme un contrôle négatif. Une expérience représentative est montrée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1: Liste des tampons et du support utilisé dans ce protocole.

Tableau 2: Paramètres de cisaillement utilisés dans ce protocole . Ces conditions ont été optimisées pour une ligne de cellules T matures.

Tableau 3: Anticorps et conditions de lavage utilisés dans cette étude.

Tableau 4: Imprimantes et sondes utilisées pour qPCR dans cette étude.

Tableau 5: Dépannage.

ChIP est une technique valable pour étudier si les protéines ou leurs PTM sont enrichis dans des régions génomiques spécifiques. Les résultats du test ChIP sont souvent difficiles à interpréter pour des raisons biologiques ou techniques. Les raisons biologiques sont nombreuses et comprennent une liaison faible ou indirecte des protéines à l'ADN. Il existe également des limitations techniques telles que la spécificité d'anticorps limitée et la lyse cellulaire inefficace ou le cisaillement de la chromatine. Un guide de dépannage ( Tableau 5 ) peut aider le lecteur à résoudre les problèmes rencontrés avec les tests ChIP.

Ce protocole, utilisant un dispositif à ultrasons focalisé par refroidissement, permet de réduire efficacement la chromatine d'une ligne de cellules T matures. La principale étape critique du protocole est représentée par le cisaillement de la chromatine, qui doit toujours être optimisé pour chaque type de cellule. Il est suggéré de faire varier le nombre de cellules et le nombre de cycles de sonication. De plus, elle L'efficacité de l'arme est influencée négativement par la présence de précipités de SDS dans les échantillons, qui peuvent se former pendant la lyse des cellules sur de la glace avec un tampon de lyse SDS. Dans ce cas, il est préférable d'incuber l'échantillon après une lyse à température ambiante pendant quelques minutes pour réduire la présence de précipités de SDS. Il est recommandé d'optimiser le protocole pour obtenir des fragments ciselés entre 200 et 500 pb et d'évaluer toujours la qualité de cisaillement des échantillons avant de procéder à l'immunoprécipitation. En outre, le temps de fixation, la quantité d'anticorps et / ou de cellules et les conditions de lavage doivent être optimisés pour chaque anticorps.

Une étape plus critique dans la réussite d'une procédure de ChIP est le choix de l'anticorps, car les anticorps de faible spécificité réduisent significativement l'efficacité de l'immunoprécipitation. Auparavant, une procédure de test de qualité unifiée permettait d'évaluer la spécificité de plusieurs anticorps disponibles sur le marché Ss = "xref"> 19. Le pipeline de dépistage était basé sur le point blot, Western blot et ChIP, fournissant une liste de réactifs de haute qualité adaptés à ChIP ¹⁹ . Plus récemment, la spécificité de plusieurs anticorps disponibles dans le commerce a été évaluée à l'aide de plates-formes de microarray aux peptides histoniques à haute densité, ce qui permet d'établir une base de données sur la spécificité des anticorps ²⁰ . Le lecteur peut utiliser cet outil utile pour identifier les anticorps les plus spécifiques qui peuvent être utilisés pour les expériences ChIP.

Ce protocole n'a pas été testé pour les cellules T primaires et, dans ce cas, le lecteur devrait se référer à d'autres protocoles publiés qui exécutent avec succès le ChIP sur les cellules T primaires ^{3 , 4 , 21} . Notamment, ce protocole a été utilisé avec succès pour exécuter ChIP sur une ligne de cellules T progénitrices de souris, ainsi que sur une ligne de cellules endothéliales de souris.

Ce protocole pourrait également être modifié pour effectuer le ChIP sur des protéines endogènes qui ne se lient pas directement à l'ADN. Dans ce cas, une pré-fixation avec des agents de réticulation protéine-protéine ( p. Ex. Adipimidate de diméthyle, DMA) peut être nécessaire (voir l'annexe B pour plus d'informations). La performance réussie de ChIP sur les cofacteurs a précédemment été réalisée en surexprimant les protéines qui sont fusionnées à une biotine. Dans ce cas, la protéine a été purifiée avec de la streptavidine-conjugaDes billes magnétiques et une pré-fixation avec DMA a été effectuée ²² .

Les auteurs n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Nous sommes reconnaissants à P. Käse et T. Schmidt-Wöll pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la bourse de recherche collaborative TRR81 et le programme Heisenberg (BO 1639 / 5-1) de la Fondation allemande de recherche (DFG), de la Société Max Planck et de l'EXC 294 à Fribourg et de l'Ensemble d'excellence pour le système pulmonaire cardiovasculaire (ECCPS) à Giessen à la tuberculose