הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות קו עכבר T- התא הבוגר. פרוטוקול זה מתאים לחקור את ההפצה של סימני היסטון ספציפיים באתרי מקדם ספציפי או גנום רחב.

מסלולי האיתור מסדירים את תוכניות הביטוי של גנים באמצעות אפנון של מבנה הכרומטין ברמות שונות, כגון על ידי שינויים פוסט-טרנסלציוניים (PTM) של זנבות היסטון, החלפת היסטונים קנוניים עם גרסאות היסטוניות ופינוי נוקלאוזום. תקנה כזו דורשת מחייב של גורמים שעתוק אותות רגישים (TF) כי לגייס אנזימים שינוי הכרומטין על אלמנטים רגולטוריים שהוגדרו משפר. ההבנה כיצד איתות איתותים מסדירים פעילות משופרת דורשת ניתוח מקיף של קשירת TFs, אנזימים שינוי הכרומטין, ואת התפוסה של סימני היסטון ספציפיים וריאנטים היסטון. Chromatin immunoprecipitation (שבב) מבחני לנצל נוגדנים ספציפיים במיוחד immunoprecipitate חלבון ספציפי / מתחמי DNA. הניתוח הבא של הדנ"א המטוהרים מאפשר לזהות את האזור הכבוש על ידי חלבון מוכר על ידי הנוגדן. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול ביעילות peRform צ'יפ של חלבונים היסטון בשורת עכבר T-cell בוגרת. הפרוטוקול המוצג מאפשר את הביצועים של מבחני שבב במסגרת זמן סבירה עם reproducibility גבוהה.

פיתוח, דיפרנציאציה והומיאוסטזיס תלויים בתכניות ספציפיות לביטוי גנים, אשר נקבעו על ידי אירועים איתותים המווסתים את מבנה הכרומטין, ולכן קובעים אם גן מסוים מופעל או מודחק בצורה תאית וזמנית. במהלך פיתוח תאי T, יש להגדיר תוכניות ספציפיות לביטוי גנים כדי לקבוע כראוי את ההבשלה של מבשרי תא-תא מהמצב הדו-שלילי (DN) למצב החיובי (SP), העובר דרך שלבי ביניים אחדים. כיצד התוכנית ביטוי גנים הוא מוסדר באופן דינמי במהלך התפתחות תא T כבר נחקר בשנים האחרונות על ידי כמה מעבדות ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} .

על ידי שינויים שלאחר טרנסלוציאציה (PTM) של היסטונים, חילופיהיסטונים קנוניים עם גרסאות היסטון, פינוי נוקלאוזום, ומתילציה של דנ"א מסדירים את מתג ה- ON / OFF של הגנים. מספר קבוצות חקרו את התפלגות גנום רחב של PTMs וריאנטים היסטון כדי לקבוע סימנים הקשורים למצבים הכרומטין שונים באזורי פרוקסימלי ו דיסטלי ^{7 , 8 , 9 , 10} . איתות cascades תזמון דינמי הכרומטין רגולציה באמצעות חילופי של אנזימים חיוביים ושליליים chromatin- שינוי (הידוע גם בשם כרום מחליפים) על אלמנטים משפר ספציפיים. אלה מכפילי הכרומטין לווסת את המבנה הכרומטין ובכך פלט תעתיק על ידי, למשל, מתילציה דינמית היסטון acetylation. זה המקרה ב Notch איתות המסלול ^{11 , 12 , 13 ,}14.

דינמי היסטון PTMs; חילופים עם גרסאות היסטון; ואת התפוסה הדינמית של היסטונים, גורמי שעתוק, cofactors ניתן לחקור על ידי מבחני immunoprecipitation הכרומטין (שבב). נוגדנים ספציפיים במיוחד משמשים לטהר מתחמי DNA ייחודיים, ואת ה- DNA מטוהרים מנותח על ידי PCR כמותי (qPCR); עמוק רצף (שבב- Seq); או, בתדירות נמוכה יותר בימינו, הכלאה כדי microarray (שבב שבב).

מבחני שבב הם לפעמים מאתגר בשל סיבוכים עם תמוגה של תאים, גז של הכרומטין, ו / או ספציפיות נמוכה של הנוגדנים. מספר אסטרטגיות אומצו כדי לשפר את הפרוטוקול, כמו במקרה של NEXSON ¹⁵ . השימוש במקררים קירור מים אמבטיה נמנע חימום המדגם שעלולים לפגוע epitopes הנוכחי על החלבון הנחקר, אבל האנרגיה הדרושה הגז של דגימות מקבל מפוזרים לתוך המים.שיפור נוסף נעשה עם פיתוח של מכשירי ultrasonication ממוקדים המונעים פיזור של האנרגיה. לכן, התקנים ultrasonicator ממוקד לאפשר שיפורים תמוגה התא ואת הכרומטין גז, ביטול וריאציות המושרה על ידי מפעיל ו להגדיל באופן משמעותי את reproducibility.

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול (סקירה סכמטית באיור 1 ) ביעילות לבצע את שבב של חלבונים היסטון בקו עכבר T- תא הבוגר שנקרא E2-10HA ^{16 , 17} . T- תאים הם בדרך כלל קשה lyse, ואת הגז של הכרומטין שלהם התגלה להיות יעיל. בפרוטוקול זה, אשר עושה שימוש ultrasonicator ממוקד קירור, מספר תאים, המאגר תמוגה, והגז ההגדרה היו אופטימיזציה עבור העכבר E2-10HA העכבר תא. פרוטוקול זה מאפשר אחד לבצע שבב עם reproducibility גבוה ובזמן סביר. למעשה, זה requirEs בערך יומיים כדי לגזום את הכרומטין כדי להעריך את איכות הגז, ושלושה ימים לבצע immunoprecipitation, להפוך את crosslink, ולטהר את ה- DNA.

הערה: כל המאגרים והאמצעים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1 .

ימים 1 ו -2

1. Crosslinking התאים

1. מעבירים את העכבר תאים T מ צלחת 6-היטב לצינור 50 מ"ל ו צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 ° C ו ~ 271 x גרם. Resuspend תא גלולה ב 30 מ"ל של תרבות IMDM תא תאים לספור את התאים באמצעות תא Neubauer.
2. איסוף aliquots של 20 x 10 ⁶ תאים לתוך צינורות 50 מ"ל חדשים.
3. הוספת פורמלדהיד (FMA) לריכוז סופי 1% ישירות בינוני תרבות התא דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
   זהירות: FMA הוא רעיל אם בשאיפה, כך לעבוד תחת מכסה המנוע קטר ללבוש ציוד מגן נאות. כמו כן, אנא לטפל בזבוז FMA על פי הכללים של המוסד המארחת.
4. הוסף 1/8 נפח של 1 גליצין M, pH 7.0, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
5. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5דקות ב 4 ° C ו ~ 271 xg ולשטוף עם 10 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
6. לשטוף את גלולה תא עם 1 מ"ל של PBS ולהעביר צינורות 1.5 מ"ל.

2. תא תמוגה ו הכרומטין גז

1. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של חיץ תמוגה SDS ו דגירה על הקרח במשך 10 דקות.
2. העברת כל מדגם לצינור sonication ולבצע גז באמצעות ultrasonicator ממוקד בהתאם להגדרות המצוין בטבלה 2.
3. לאחר הגז, להעביר את דגימות צינורות 1.5 מ"ל ו צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4 ° C ~ 18,000 x גרם.
4. מעבירים את supernatant צינורות חדשים.
5. איסוף 50 μL כדי לקבוע את יעילות הגז על פי צעד 3 ו הצמד להקפיא lysate גז בחנקן נוזלי. חנות Lysate ב aliquots לשימוש יחיד ב -80 מעלות צלזיוס.

3. קביעת יעילות הגז

1. הוסף 50 μL של חיץ elution כדי 50 & #181; L של כל lysate גז ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה, עם רועד.
2. הוסף 100 μL של חיץ TE ו 4 μL של 10 מ"ג / מ"ל ​​RNase A (0.2 מיקרוגרם / ריכוז סופי μL). מערבבים ו לדגור על 2 שעות ב 37 ° C, עם רועד.
3. הוסף 2 μL של 20 מ"ג / מ"ל ​​proteinase K (0.2 מיקרוגרם / ריכוז μL הסופי) לכל מדגם ו דגירה של 2 שעות ב 55 מעלות צלזיוס, עם רעד.
4. העברת כל מדגם לצינור ג'ל מתאים פנול / כלורופורם / אלכוהול isoamyl החילוץ; ידית בהתאם להוראות היצרן.
5. הוסף 200 μL של פנול / chloroform / אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) ולנער את צינורות. צנטריפוגה 5 דקות ב 24 ° C ו ~ 16,000 XG ולהעביר את השלב העליון צינורות חדשים.
   זהירות: פנול, כלורופורם, אלכוהול איזואמי הם רעילים אם הם בשאיפה והם קורוזיביים; לעבוד תחת מכסה המנוע קטר ללבוש ציוד מגן אישי ראוי. כמו כן, לטפל פנול, כלורופורם, וכן אלכוהול isoamyl פסולת acבהתאם לכללי המוסד המארח.
   1. חזור פעם אחת.
6. טיהור ה- DNA באמצעות עמודות טיהור על פי הוראות היצרן, עם השינויים הבאים:
   1. לשטוף את הקרום פעמיים. לאחר לשטוף האחרון, להשאיר את הצינור פתוח למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר להתאדות אתנול שיורית.
   2. עבור elution, להוסיף 50 μL של H ₂ O, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות, לסובב את הצינור עבור 1 s כדי רטוב כראוי את הממברנה, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות לפני eluting DNA על ידי צנטריפוגה דקות 1 ב 24 ° C ו ~ 17,900 x גרם.
7. לכמת את ה- DNA מטוהרים על פלואורמטר באמצעות ערכת רגישות גבוהה על פי הוראות היצרן.
8. לנתח כ 500 ng של ה- DNA מטוהרים על ג'ל agarose 1.8% ו כ 1 ng על מערכת אלקטרופורזה באמצעות ערכת רגישות גבוהה.
   הערה: הגודל הצפויE של שברי ה- DNA הוא בין 200 ל 500 bp.

ימים 3 ו -4

4. Immunoprecipitation

1. מדולל 1 נפח של lysate גז עם 5 כרכים של חיץ דילול.
2. Preclear עם 30 μL μL / חלבון מ"ל אגרוס agarose (מוכן על פי נספח א ) במשך 30 דקות תוך סיבוב בחדר קר.
3. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב ~ 750 x גרם.
4. איסוף 10% קלט קלט את זה ב 4 ° C.
5. Aliquot את הסכום הרצוי של lysate לתוך צינורות חדשים (ראה טבלה 3 לפרטים). הוסף את הנוגדנים הרצויים לכל צינור (ראה טבלה 3 לפרטים) וסובב בן לילה ב 4 ° C.
6. הוסף 40 μL של חלבון חרוזים לדגור על 1 שעות ב 4 ° C תוך סיבוב.
7. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של חיץ מלח נמוך, חיץ מלח גבוהה, חיץ LiCl, חיץ TE (עבור כל לשטוף, דגירה של 5 דקות ב 4 ° C תוך סיבוב צנטריפוגהבמשך 3 דקות ב 4 ° C ו ~ 950 xg). ראה טבלה 3 לפרטים.
8. הוסף 110 μL של חיץ elution ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, vortexing כל 2 דקות.
9. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 4 ° C ו ~ 950 xg ולהעביר 100 μL של supernatant לצינור 1.5-מ"ל חדש.
10. חזור על שלבים 4.7-4.8 עם 100 μL של חיץ elution ולשלב eluates. הוסף חיץ אלוטי עד 200 μL כדי להזין את הדגימות.
11. דגירה כל הדגימות לילה ב 65 מעלות צלזיוס, עם רועד.

יום 5

5. טיהור דנ"א

1. הוסף 200 μL למאגר TE כדי eluate כל 8 μL של 10 מ"ג / מ"ל ​​RNase A (0.2 מיקרוגרם / ריכוז סופי μL). מערבבים ו לדגור על 2 שעות ב 37 ° C, עם רועד.
2. הוסף 4 μL של 20 מ"ג / מ"ל ​​proteinase K (0.2 מיקרוגרם / ריכוז μL הסופי) כדי כל eluate ו דגירה של 2 שעות ב 55 מעלות צלזיוס, עם רועד.
3. מעבירים כל מדגם לג'לצינור מתאים פנול / כלורופורם / אלכוהול isoamyl החילוץ; ידית בהתאם להוראות היצרן.
4. הוסף 400 μL של פנול / כלורופורם / אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) ולנער את צינורות. צנטריפוגה 5 דקות ב 24 ° C ו ~ 16,000 x גרם. מעבירים את השלב העליון צינורות חדשים.
   זהירות: פנול, כלורופורם, אלכוהול איזואמי הם רעילים אם הם בשאיפה והם קורוזיביים; לעבוד תחת מכסה המנוע קטר ללבוש ציוד מגן אישי ראוי. כמו כן, לטפל פנול, כלורופורם, פסולת אלכוהול isoamyl על פי הכללים של המוסד המארחת.
   1. חזור פעם אחת.
5. טיהור ה- DNA באמצעות עמודות טיהור על פי הוראות היצרן, עם השינויים הבאים:
6. לשטוף את הקרום פעמיים. לאחר לשטוף האחרון, להשאיר את צינורות פתוחים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר להתאדות אתנול שיורית.
7. עבור elution, להוסיף 50 μL של H ₂ O, דגירה בחדר temperatuמחדש עבור 1 דקות, לסובב את צינורות 1 s כדי רטוב כראוי את הממברנה, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות לפני eluting DNA על ידי צנטריפוגה דקות 1 ב 24 ° C ~ 17,900 x גרם.

בתאי T מורין בוגרים הוכנסו לבדיקת שבב כדי לחקור את העשרה של ההיסטונוס של סמן ההיסטון של ליזין 4 על היסטון 3 (H3K4me1), תלת-מתילציה של ליזין 4 על היסטון 3 (H3K4me3) ואצטילציה של ליזין 27 היסטון 3 (H3K27ac), כמו גם תפוסה nucleosome, כפי שנחשף על ידי שבב panH3. איכות הגז הוערך על ידי ניתוח על ג'ל agarose 1.8% ( איור 2 א ) ועל מערכת אלקטרופורזה ( איור 2 ב ). H3K4me1 ו H3K4me3 משמשים בדרך כלל כדי לזהות אתרים משפר ומקדמים, בהתאמה ( איור 3 א ). למעשה, H3K4me3 בולט אך לא מועשר באופן בלעדי על היזמים ^{5 , 8 , 14} . מאפיין של משפרי פעיל הוא להיות מועשר מאוד עבור H3K4me1 ו H3K27ac ו מועשר כראוי עבור H3K4me3 (<(איור 3 א ', פאנל עליון), בעוד ששיפורים לא פעילים מציגים רמות נמוכות של H3K4me3 ו- H3K27ac, אך רמות גבוהות של H3K4me1 ( איור 3 א' , לוח תחתון). כפי שמוצג באיור 3 ב , Glyceraldehyde 3-פוספט dehydrogenase ( Gapdh ) הגן הוא נציג של ניתוח של היזמים פעיל גן ( האמרגן Gapdh ). למעשה, זה מראה רמות גבוהות של H3K4me3 ו H3K27ac ורמות נמוכות של H3K4me1. באיור 3 ב , Deltex1 ( Dtx1 ) הוא נציג של משפרי פעיל ( Dtx1 משפר ), כפי שהוא מועשר מאוד עבור H3K4me1 מועשר היטב עבור H3K4me3 ו H3K27ac. המדבר הגנטי הוא נציג של אזור חסר גנים קידוד והוא נתבע בדרך כלל כביקורת שלילית עבור סימני הכרומטין פעיל. התצפית כי H3K4me1, מקובל היטב סימן משפר ^{4 , 5 , 7 , 14 , 18} , אינו מועשר במדבר ג 'ין עולה כי באזור זה חסרים משפרי.

איור 1: סקירה סכמטית של פרוטוקול שבב שהוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: בקרת איכות הגז של בשורת עכבר T- התא הבוגר. ( A ) שני aliquots שונים של העכבר הבוגר T-Cell תא E2-10HA היו גזוז, כ 500 ng של DNA מטוהרים נותחו על ג 'ל agarose 1.8% כדי להעריך את הגזירה שלהםהאיכות. ( ב ) 1 ng של DNA מטוהרים מדגם 2 נותח על ידי אלקטרופורזה כדי להעריך את איכות הגז שלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: סימני הכרומטין המאפיינים משפרי ומקדמי. ( A ) משפרי פעיל (פאנל עליון) מאופיינים H3K4me1 גבוהה, נמוך H3K4me3, גבוה H3K27ac, בעוד משפרי לא פעיל (פאנל התחתון) הנוכחי גבוה H3K4me1, נמוך H3K4me3, ו H3K27ac נמוך. ( ב ) הדגימות שהוצגו בתרשים 2 א היו משולבים יחד המשמשים ניתוח שבב לעומת סימני היסטון H3K4me1, H3K4me3, ו H3K27ac תפוסה היסטון, כפי שנחשף על ידי שבב panH3. ניתוח זה מראה כי thE מקדם של Ghyceraldehyde Geneceraldehyde גופרלדהיד 3-פוספט ( Gapdh האמרגן ) מועשר מאוד עבור H3K4me3 ו H3K27ac מועשר נמוך עבור H3K4me1. מצד שני, משפר את הגן הלא פעיל Deltex1 ( Dtx1 משפר ) מועשר מאוד עבור H3K4me1 אבל מועשר היטב עבור H3K4me3 ו H3K27ac. שבב באמצעות נוגדן panH3 שימש לבדיקת תפוסה של נוקלאוזום. המדבר הגנטי שימש כבקרה שלילית. ניסוי נציג אחד מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: רשימת המאגרים והמדיום המשמש בפרוטוקול זה.

: Keep-together.within-page = "1"> טבלה 2: הגדרות הגז המשמשות בפרוטוקול זה. תנאים אלה כבר מותאם במיוחד עבור T-T העכבר התא הבוגר.

טבלה 3: נוגדנים ותנאי כביסה המשמשים במחקר זה.

טבלה 4: פריימרים וחיישנים המשמשים את QPCR במחקר זה.

טבלה 5: פתרון בעיות.

שבב הוא טכניקה חוקית כדי לחקור אם חלבונים או PTM שלהם מועשרים באזורים גנומיים ספציפיים. תוצאות שבב assay לעתים קרובות מאתגר לפרש בשל סיבות ביולוגיות או טכניות. הסיבות הביולוגיות הן רבות וכוללות חיבור חלש או עקיף של חלבונים לדנ"א. יש גם מגבלות טכניות, כגון סגוליות נוגדן מוגבל ותאי תא לא יעיל או גז הכרומטין. מדריך לפתרון בעיות ( טבלה 5 ) יכול לסייע לקורא לפתור את הבעיות שעשויות להיתקל בבדיקות צ'יפ.

פרוטוקול זה, תוך שימוש במכשיר ultrasonicator הקירור ממוקד, מאפשר אחד לגזז ביעילות את הכרומטין של קו T העכבר התא הבוגר. השלב הקריטי העיקרי של הפרוטוקול מיוצג על ידי גז של הכרומטין, אשר חייב תמיד להיות מותאם לכל סוג תא. מומלץ לשנות את מספר התאים ואת מספר מחזורי sonication. יתר על כן, היא יעילות aring מושפעת לרעה על ידי נוכחות של משקעים SDS בדגימות, אשר עשויים להיווצר במהלך תמוגה של תאים על הקרח עם חיץ תמוגה SDS. במקרה זה, עדיף לדגור את המדגם לאחר תמוגה בטמפרטורת החדר למשך כמה דקות כדי להפחית את נוכחותם של משקעים SDS. מומלץ לייעל את הפרוטוקול כדי להשיג שברי גזעים בין 200 ל 500 BP ו תמיד להעריך את איכות הגז של הדגימות לפני שתמשיך עם immunoprecipitation. בנוסף, זמן קיבוע, כמות נוגדנים ו / או תאים, ואת תנאי כביסה חייב להיות מותאם לכל נוגדנים.

צעד אחד קריטי יותר בהפיכת הליך שבב מוצלח הוא הבחירה של הנוגדנים, כמו נוגדנים ספציפיות נמוכה להפחית באופן משמעותי את היעילות של immunoprecipitation. בעבר, הליך מבחן איכות אחיד מותר להעריך את הספציפיות של נוגדנים מספר זמין בשוק Ss = "xref"> 19. צינור ההקרנה התבסס על כתם נקודה, כתם מערבי וצ'יפ, המספק רשימה של ריאגנטים באיכות גבוהה המתאימים ל- CHIP ¹⁹ . לאחרונה, הספציפיות של מספר נוגדן זמין מסחרית הוערך באמצעות צפיפות גבוהה היסטון פפטיד microarray פלטפורמות, המאפשר להקמת מסד נתונים על ספציפיות נוגדן ²⁰ . הקורא יכול להשתמש בכלי זה שימושי כדי לזהות את הנוגדנים הספציפיים ביותר שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים שבב.

פרוטוקול זה לא נבדק עבור תאי T ראשוניים, במקרה זה, הקורא צריך להתייחס פרוטוקולים שפורסמו אחרים בהצלחה לבצע שבב על T- ³ תאים ראשוניים ^{3 , 4 , 21} . יש לציין, פרוטוקול זה שימש בהצלחה לביצוע שבב על שורה תא העכבר תא, כמו גם על קו תא אנדותל העכבר.

פרוטוקול זה יכול גם להיות שונה כדי לבצע שבב על חלבונים אנדוגניים שאינם קשורים ישירות ל- DNA. במקרה זה, טרום קביעה עם crosslinkers חלבון חלבון ( למשל, dimethyl adipimidate, DMA) עשוי להידרש (ראה נספח B לקבלת מידע נוסף). ביצועים מוצלחים של שבב על cofactors נעשה בעבר על ידי overexpressing חלבונים כי הם התמזגו תג ביוטין. במקרה זה, חלבון היה מטוהרים עם streptavidin-conjugaTed חרוזים מגנטיים, וכן קיבוע מראש עם DMA בוצע ²² .

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אנו אסירי תודה P. Käse ו T. Schmidt-Wöll לעזרה טכנית מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר המשותף TRR81 ותוכנית הייזנברג (BO 1639 / 5-1) של DFG (קרן המחקר הגרמנית), חברת מקס פלנק ו- EXC 294 בפרייבורג, ואשכול הצטיינות של מערכת ריאתי לב ריאה (ECCPS) ב Giessen כדי שחפת