Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em linhas de células T de mouse

Este trabalho descreve um protocolo para a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) usando uma linha de células T de mouse maduras. Este protocolo é adequado para investigar a distribuição de marcas de histonas específicas em locais promotores específicos ou em todo o genoma.

As vias de sinalização regulam os programas de expressão gênica através da modulação da estrutura da cromatina em diferentes níveis, tais como modificações pós-tradução (PTMs) das caudas de histonas, troca de histonas canônicas com variantes de histonas e despejo de nucleossomos. Essa regulamentação requer a ligação de fatores de transcrição sensíveis ao sinal (TFs) que recrutam enzimas modificadoras de cromatina em elementos reguladores definidos como potenciadores. Entender como as cascatas de sinalização regulam a atividade do intensificador requer uma análise abrangente da ligação de TFs, enzimas modificadoras de cromatina e a ocupação de marcas de histonas específicas e variantes de histonas. Os ensaios de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) utilizam anticorpos altamente específicos para imunoprecipitar complexos específicos de proteína / ADN. A análise subsequente do DNA purificado permite a identificação da região ocupada pela proteína reconhecida pelo anticorpo. Este trabalho descreve um protocolo de forma eficiente paraRIP Chift de proteínas de histonas em uma linha de células T de mouse maduras. O protocolo apresentado permite o desempenho de ensaios ChIP em um prazo razoável e com alta reprodutibilidade.

O desenvolvimento, a diferenciação e a homeostasia dependem de programas específicos de expressão gênica que são estabelecidos por eventos de sinalização que modulam a estrutura da cromatina e, portanto, determinam se um gene específico é ativado ou reprimido de uma maneira específica de célula e tempo. Durante o desenvolvimento das células T, programas específicos de expressão gênica devem ser estabelecidos para determinar adequadamente a maturação dos precursores de células T do duplo negativo (DN) para o estado único positivo (SP), passando por vários estádios intermediários ¹ . Como o programa de expressão gênica é regulado dinamicamente durante o desenvolvimento das células T foi amplamente investigado em anos anteriores por vários laboratórios ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} .

Por modificações pós-tradução (PTMs) de histonas, a troca deHistonas canônicas com variantes de histonas, despejo de nucleossomos e metilação de DNA regulam o interruptor de genes ON / OFF. Vários grupos investigaram a distribuição genômica de PTMs e variantes de histonas para determinar marcas associadas a diferentes estados de cromatina nas regiões reguladoras proximal e distal ^{7 , 8 , 9 , 10} . As cascatas de sinalização orquestram a regulação dinâmica da cromatina através da troca de enzimas modificadoras de cromatina positivas e negativas (também conhecidas como modificadores de cromatina) em elementos potenciadores específicos. Esses modificadores de cromatina regulam a estrutura da cromatina e, portanto, a saída da transcrição, por exemplo, metilação histona e acetilação dinâmica. Este é o caso na via de sinalização Notch ^{11 , 12 , 13 ,}14.

PTM de histonas dinâmicas; Trocas com variantes de histonas; E a ocupação dinâmica de histonas, fatores de transcrição e cofatores podem ser investigadas por ensaios de imunoprecipitação com cromatina (ChIP). Anticorpos altamente específicos são usados ​​para purificar complexos de DNA-proteína específicos, e o DNA purificado é analisado por PCR quantitativa (qPCR); Sequenciação profunda (ChIP-Seq); Ou, com menor freqüência hoje em dia, hibridação ao microarray (ChIP-ChIP).

Os ensaios ChIP são às vezes desafiadores devido a complicações com a lise das células, corte da cromatina e / ou baixa especificidade dos anticorpos. Várias estratégias foram adotadas para melhorar o protocolo, como é o caso do NEXSON ¹⁵ . O uso de sonicadores de banho de água de refrigeração evita o aquecimento da amostra que pode danificar os epítopos presentes na proteína sob investigação, mas a energia necessária para o corte das amostras é dispersa na água.Outra melhoria foi feita com o desenvolvimento de dispositivos de ultra-sonografia focados que impedem a dispersão da energia. Portanto, os dispositivos ultra-sônicos focados permitem melhorias na lise celular e no cisalhamento da cromatina, eliminando as variações induzidas pelo operador e aumentando significativamente a reprodutibilidade.

Este trabalho descreve um protocolo (visão geral esquemática na Figura 1 ) para executar eficientemente o ChIP de proteínas histonas em uma linha de células T de mouse maduras chamada E2-10HA ^{16 , 17} . As células T são geralmente difíceis de lição, e o corte de sua cromatina revelou-se ineficiente. Neste protocolo, que faz uso de um ultra-som focado em resfriamento, o número de células, o buffer de lise e a configuração de cisalhamento foram otimizados para a linha de células T de mouse E2-10HA. Este protocolo permite executar um ChIP com alta reprodutibilidade e em um tempo razoável. Na verdade, ele exigeÉ aproximadamente dois dias para cortar a cromatina e para avaliar a qualidade do corte e três dias para realizar a imunoprecipitação, reverter a reticulação e purificar o DNA.

NOTA: Todos os buffers e o meio utilizado neste protocolo estão listados na Tabela 1 .

Dias 1 e 2

1. Crosslinking the Cells

1. Transfira as células-tronco de uma placa de 6 poços para um tubo de 50 mL e centrifugue durante 5 min a 4 ° C e ~ 271 x g. Ressuspender o sedimento celular em 30 mL de meio de cultura celular IMDM e contar as células usando uma câmara Neubauer.
2. Coletar alíquotas de 20 x 10 ⁶ células em novos tubos de 50 mL.
3. Adicionar formaldeído (FMA) a uma concentração final de 1% diretamente no meio de cultura celular e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
   Cuidado: FMA é tóxico se inalado, então trabalhe sob uma chaminé e use equipamento de proteção adequado. Além disso, lide com os resíduos FMA de acordo com as regras da instituição anfitriã.
4. Adicionar um volume 1/8 de glicina 1 M, pH 7,0, e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
5. Pellet as células por centrifugação por 5Min a 4 ° C e ~ 271 xg e lavar com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
6. Lave o sedimento celular com 1 mL de PBS e transfira para tubos de 1,5 mL.

2. Lise celular e Cisma de cromatina

1. Ressuspender o sedimento celular em 1 mL de tampão de lise SDS e incubar em gelo durante 10 min.
2. Transfira cada amostra para um tubo de sonicação e realize o corte usando um ultra-som focalizado de acordo com as configurações indicadas na Tabela 2.
3. Após o corte, transferir as amostras para tubos de 1,5 mL e centrifugar durante 10 min a 4 ° C e ~ 18,000 x g.
4. Transfira o sobrenadante para tubos novos.
5. Recolher 50 μL para determinar a eficiência de corte de acordo com o passo 3 e congelar instantaneamente o lisado cortado em nitrogênio líquido. Armazene o lisado em alíquotas de uso único a -80 ° C.

3. Determinação da Eficiência de Cisalha

1. Adicionar 50 μL de tampão de eluição ao 50 & #181; L de cada lisado cortado e incubar a 65 ° C durante a noite, com agitação.
2. Adicionar 100 μL de tampão TE e 4 μL de RNase A 10 mg / mL (concentração final 0,2 μg / μL). Misture e incube durante 2 h a 37 ° C, com agitação.
3. Adicionar 2 μL de 20 mg / mL de proteinase K (0,2 μg / μL de concentração final) a cada amostra e incubar durante 2 h a 55 ° C, com agitação.
4. Transfira cada amostra para um tubo de gel adequado para extração de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico; Manipular de acordo com as instruções do fabricante.
5. Adicione 200 μL de álcool fenol / clorofórmio / isoamílico (25: 24: 1) e agite os tubos. Centrifugar por 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 xg e transferir a fase superior para novos tubos.
   Cuidado: fenol, clorofórmio e álcool isoamílico são tóxicos se inalados e são corrosivos; Trabalhe sob uma chaminé e use equipamento de proteção pessoal apropriado. Além disso, lidar com resíduos de álcool isoamílico, fenol, clorofórmio eDe acordo com as regras da instituição anfitriã.
   1. Repita uma vez.
6. Purifique o DNA usando colunas de purificação de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes modificações:
   1. Lave a membrana duas vezes. Após a última lavagem, deixe o tubo aberto durante 2 minutos à temperatura ambiente para evaporar o etanol residual.
   2. Para a eluição, adicionar 50 μL de H ₂ O, incubar à temperatura ambiente durante 1 min, girar o tubo durante 1 s para molhar adequadamente a membrana e incubar à temperatura ambiente durante 1 min antes de eluir o DNA por centrifugação durante 1 min a 24 ° C e ~ 17.900 x g.
7. Quantifique o DNA purificado em um fluorômetro usando um kit de alta sensibilidade de acordo com as instruções do fabricante.
8. Analisar aproximadamente 500 ng do DNA purificado em um gel de agarose 1,8% e aproximadamente 1 ng em um sistema de eletroforese usando um kit de alta sensibilidade.
   NOTA: O esperadoE dos fragmentos de DNA está entre 200 e 500 pb.

Dias 3 e 4

4. Imunoprecipitação

1. Diluir 1 volume de lisado cortado com 5 volumes de tampão de diluição.
2. Preclear com 30 μL / mL de proteína A gotas de agarose (preparadas de acordo com o apêndice A ) durante 30 min enquanto gira na sala fria.
3. Centrifugar a 4 ° C durante 5 min a ~ 750 x g.
4. Coletar 10% da entrada e armazená-la a 4 ° C.
5. Alíquota a quantidade desejada de lisado em novos tubos (ver Tabela 3 para detalhes). Adicione os anticorpos desejados a cada tubo (ver Tabela 3 para detalhes) e gire durante a noite a 4 ° C.
6. Adicione 40 μL de esferas de proteína A e incube durante 1 h a 4 ° C enquanto gira.
7. Lave as esferas com 1 mL de tampão de baixo teor de sal, tampão de alto teor de sal, tampão de LiCl e tampão TE (para cada lavagem, incube durante 5 minutos a 4 ° C enquanto gira e centrifugaPor 3 minutos a 4 ° C e ~ 950 xg). Consulte a Tabela 3 para obter detalhes.
8. Adicionar 110 μL de tampão de eluição e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente, em vórtice a cada 2 min.
9. Centrifugar durante 3 minutos a 4 ° C e ~ 950 xg e transferir 100 μL de sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
10. Repita as etapas 4.7-4.8 com 100 μL de tampão de eluição e combine os eluatos. Adicione o buffer de eluição até 200 μL para inserir as amostras.
11. Incubar todas as amostras durante a noite a 65 ° C, com agitação.

Dia 5

5. Purificação de DNA

1. Adicionar 200 μL de tampão TE a cada eluato e 8 μL de RNase A 10 mg / mL (0,2 μg / μL de concentração final). Misture e incube durante 2 h a 37 ° C, com agitação.
2. Adicionar 4 μL de 20 μg / mL de proteinase K (0,2 μg / μL de concentração final) a cada eluato e incubar durante 2 h a 55 ° C, com agitação.
3. Transfira cada amostra para um gelTubo adequado para extração de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico; Manipular de acordo com as instruções do fabricante.
4. Adicione 400 μL de álcool fenol / clorofórmio / isoamílico (25: 24: 1) e agite os tubos. Centrifugar durante 5 min a 24 ° C e ~ 16,000 x g. Transfira a fase superior para novos tubos.
   Cuidado: fenol, clorofórmio e álcool isoamílico são tóxicos se inalados e são corrosivos; Trabalhe sob uma chaminé e use equipamento de proteção pessoal apropriado. Além disso, manipule resíduos de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico de acordo com as regras da instituição anfitriã.
   1. Repita uma vez.
5. Purifique o DNA usando colunas de purificação de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes modificações:
6. Lave a membrana duas vezes. Após a última lavagem, deixe os tubos abertos durante 2 min a temperatura ambiente para evaporar o etanol residual.
7. Para a eluição, adicionar 50 μL de H ₂ O, incubar à temperatura ambientePor 1 min, gire os tubos durante 1 s para molhar adequadamente a membrana e incubar à temperatura ambiente durante 1 min antes de eluir o DNA por centrifugação durante 1 min a 24 ° C e ~ 17,900 x g.

As células T murinas maduras foram submetidas à análise de ChIP para investigar o enriquecimento da mono-metilação da marca histona da lisina 4 na histona 3 (H3K4me1), tri-metilação da lisina 4 na histona 3 (H3K4me3) e acetilação da lisina 27 no Histona 3 (H3K27ac), bem como a ocupação dos nucleossomos, como revelado pelo panH3 ChIP. A qualidade de corte foi avaliada por análise em um gel de agarose 1,8% ( Figura 2A ) e em um sistema de eletroforese ( Figura 2B ). H3K4me1 e H3K4me3 geralmente são usados ​​para identificar sites e promotores de intensificação, respectivamente ( Figura 3A ). Na verdade, H3K4me3 é proeminente, mas não exclusivamente enriquecido nos promotores ^{5 , 8 , 14} . Uma característica dos intensificadores ativos deve ser altamente enriquecida para H3K4me1 e H3K27ac e pouco enriquecida para H3K4me3 ( Figura 3A, painel superior), enquanto que os intensificadores inativos apresentam baixos níveis de H3K4me3 e H3K27ac, mas altos níveis de H3K4me1 ( Figura 3A , painel inferior). Conforme mostrado na Figura 3B , o gene Glyceraldehyde 3-phosphate deshydrogenase ( Gapdh ) é representativo da análise de promotores de genes ativos ( promotor de Gapdh ). Na verdade, mostra níveis elevados de H3K4me3 e H3K27ac e baixos níveis de H3K4me1. Na Figura 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) é representativo de potenciadores inativos ( Dtx1 enhancer ), pois é altamente enriquecido para H3K4me1 e mal enriquecido para H3K4me3 e H3K27ac. Gene desert é representativo de uma região que não possui genes de codificação e geralmente é processado como um controle negativo para marcas de cromatina ativas. A observação de que H3K4me1, uma marca melhoradora bem aceita ^{4 , 5 , 7 , 14 , 18} , não está enriquecido no deserto de gene sugere que esta região não possui potenciadores.

Figura 1: Visão geral esquemática do protocolo ChIP apresentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Controle de qualidade de corte da linha de células T maduras do mouse. ( A ) Duas alíquotas diferentes da linha de células T de ratinho maduro E2-10HA foram cortadas e aproximadamente 500 ng de DNA purificado foram analisados ​​em um gel de agarose a 1,8% para avaliar o seu cisalhamentoQualidade. ( B ) 1 ng de ADN purificado da amostra 2 foi analisado por eletroforese para avaliar a sua qualidade de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: marcas de cromatina que caracterizam potenciadores e promotores. ( A ) Os intensificadores ativos (painel superior) são caracterizados por H3K4me1 alto, H3K4me3 baixo e alto H3K27ac, enquanto que os intensificadores inativos (painel inferior) apresentam alta H3K4me1, H3K4me3 baixo e H3K27ac baixo. ( B ) As amostras apresentadas na Figura 2A foram agrupadas e utilizadas para análise de ChIP versus marcas de histonas H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac e ocupação de histonas, conforme revelado por PanH3 ChIP. Esta análise mostra que oE promotor do gene de limpeza da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ( promotor Gapdh ) é altamente enriquecido para H3K4me3 e H3K27ac e pouco enriquecido para H3K4me1. Por outro lado, o intensificador do gene inativo Deltex1 ( potenciador Dtx1 ) é altamente enriquecido para H3K4me1 mas pouco enriquecido para H3K4me3 e H3K27ac. O ChIP usando um anticorpo panH3 foi utilizado para investigar a ocupação dos nucleossomos. Gene desert foi usado como um controle negativo. Uma experiência representativa é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista dos buffers e do meio utilizado neste protocolo.

Tabela 2: Configurações de corte usadas neste protocolo. Estas condições foram otimizadas para uma linha de células T de mouse maduras.

Tabela 3: Anticorpos e condições de lavagem utilizados neste estudo.

Tabela 4: Primers e sondas usadas para qPCR neste estudo.

Tabela 5: Solução de problemas.

ChIP é uma técnica válida para investigar se as proteínas ou os seus PTMs são enriquecidos em regiões genômicas específicas. Os resultados do ensaio ChIP são muitas vezes difíceis de interpretar por razões biológicas ou técnicas. As razões biológicas são múltiplas e incluem ligação fraca ou indireta de proteínas ao DNA. Há também limitações técnicas, tais como especificidade limitada de anticorpos e lise celular ineficiente ou corte de cromatina. Um guia de solução de problemas ( Tabela 5 ) pode ajudar o leitor a resolver os problemas que podem ser encontrados com os ensaios ChIP.

Este protocolo, que faz uso de um dispositivo de ultra-sonografia focado em resfriamento, permite cortar eficientemente a cromatina de uma linha de células T de mouse maduras. O principal passo crítico do protocolo é representado pelo corte da cromatina, que sempre deve ser otimizado para cada tipo de célula. Sugere-se que varie o número de células e o número de ciclos de sonicação. Além disso, ela A eficiência de aring é influenciada negativamente pela presença de precipitados SDS nas amostras, que podem se formar durante a lise das células em gelo com tampão de lise SDS. Neste caso, é melhor incubar a amostra após a lise à temperatura ambiente por alguns minutos para reduzir a presença de precipitados SDS. Recomenda-se otimizar o protocolo para obter fragmentos cortados entre 200 e 500 pb e avaliar sempre a qualidade de cisalhamento das amostras antes de prosseguir com a imunoprecipitação. Além disso, o tempo de fixação, quantidade de anticorpo e / ou células, e as condições de lavagem devem ser otimizadas para cada anticorpo.

Mais um passo crítico na elaboração de um procedimento ChIP é a escolha do anticorpo, uma vez que os anticorpos de baixa especificidade reduzem significativamente a eficiência da imunoprecipitação. Anteriormente, um procedimento de teste de qualidade unificado permitiu a avaliação da especificidade de vários anticorpos disponíveis no mercado Ss = "xref"> 19. O pipeline de triagem foi baseado em ponto blot, Western blot e ChIP, fornecendo uma lista de reagentes de alta qualidade adequados para ChIP ¹⁹ . Mais recentemente, a especificidade de vários anticorpos comercialmente disponíveis foi avaliada usando plataformas de microarrays de péptidos de histona de alta densidade, permitindo o estabelecimento de um banco de dados sobre especificidade de anticorpos ²⁰ . O leitor pode usar essa ferramenta útil para identificar os anticorpos mais específicos que podem ser usados ​​para experiências de ChIP.

Este protocolo não foi testado para células T primárias e, neste caso, o leitor deve consultar outros protocolos publicados que executam com sucesso o ChIP nas células T primárias ^{3 , 4 , 21} . Notavelmente, este protocolo foi usado com sucesso para executar ChIP em uma linhagem de células T de progenitor de mouse, bem como em uma linha de células endoteliais de mouse.

Este protocolo também pode ser modificado para realizar ChIP em proteínas endógenas que não se ligam diretamente ao DNA. Neste caso, a pré-fixação com reticulantes proteína-proteína ( por exemplo, adipimidato de dimetilo, DMA) pode ser necessária (ver Apêndice B para mais informações). O desempenho bem sucedido de ChIP em cofactores foi feito anteriormente por sobreexpressão de proteínas que são fundidas em uma etiqueta de biotina. Neste caso, a proteína foi purificada com estreptavidina-conjugaEsferas magnéticas e magnéticas e uma pré-fixação com DMA foi realizada ²² .

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecemos a P. Käse e T. Schmidt-Wöll pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela bolsa de pesquisa colaborativa TRR81 e o programa Heisenberg (BO 1639 / 5-1) da DFG (Fundação Alemã de Pesquisa), a Sociedade Max Planck e o EXC 294 em Freiburg e o Cluster de Excelência para o Sistema Cardio Pulmonar (ECCPS) em Giessen para TB