Обнаружение РНК-связывающих белков

Выпадающий протокол РНК оптимизирован здесь для обнаружения взаимодействий между РНК-связывающих белков (ОДП) и некодирующих, а также кодирования РНК. Фрагмент РНК из рецептора андрогена (AR) был использован в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как извлечь ее из ОПБ lystate первичных бурых адипоцитов.

РНК-связывающие белки (ОДП) появляются в качестве регулирующего слоя в развитии и функционировании жировой ткани. ОДП играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционных уровнях, влияя на стабильность и поступательное эффективность мРНК мишеней. РНК выпадающий метод широко используется для изучения взаимодействия РНК-белок, который необходим, чтобы выяснить механизм, лежащий в основе функции ОДП ", а также длинные некодирующие РНК» (lncRNAs). Однако высокая липидный изобилие в адипоциты представляет собой сложную техническую задачу в проведении этого эксперимента. Здесь подробно выпадающий протокол РНК оптимизирован для первичной культуры адипоцитов. Фрагмент РНК из (AR) 3 'нетранслируемой области рецептора андрогена (в 3'UTR), содержащие аденилатной-uridylate богатых elementwas, используемые в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как получить его RBP партнера, Гур белок, из адипоцитов lystate. Описанный здесь способ может быть применен для обнаружения взаимодействий междуОДП и некодирующие РНК, а также между ОДП и кодирование РНК.

ОДП представляют собой белки, которые связываются с двойной или одноцепочечной РНК в клетках и участвуют в формировании РНК-белковых комплексов. ОДП может связать различные виды РНК, включая мРНК и длинных некодирующих РНК (lncRNAs), и оказывают свое влияние на пост-транскрипционных уровнях. Оба ОДП и lncRNAs появляются в качестве новых регуляторов в развитии жировой и функции ^1,2,3. Для того, чтобы понять механизм RBP- и lncRNA-опосредованной регуляции клеточных путей, часто бывает необходимо, чтобы обнаружить взаимодействие между конкретной молекулы РНК и одного или нескольких ОДП, и, иногда, чтобы определить полный спектр белковых партнеров РНК транскрипт. Тем не менее, этот эксперимент может быть сложной задачей из-за высокого содержания липидов в адипоцитах. Протокол спускающее РНК , описанный здесь может быть использовано для получения белковых партнеров специфической РНК из адипоцитов лизатов первичных культур ^4,5.

Обоснование для этого протоCol можно суммировать следующим образом. РНК приманку в пробирке транскрипции из матрицы ДНК, меченного биотином и конъюгированные с покрытыми стрептавидином магнитными гранулами ^4. РНК приманку инкубируют с клеточными лизатов, чтобы обеспечить образование РНК-белковых комплексов, которые впоследствии снесенных на магнитной подставке. Более конкретно, РНК протокол спускающее описано ниже использовать фрагмент РНК из AR 3' - UTR в качестве приманки , чтобы получить Hur протеин, универсально выраженный ОПБ , связанный с 3' - UTR мРНК ^6,7, от theadipocytelysate первичной культуры. Для проверки специфичности связывания этого анализа, а нерелевантных RNAas также пустые стрептавидином шарики включен в качестве контроля. Этот протокол совместим с вестерн - блоттинга или масс - спектрометрии (MS) , чтобы подтвердить захват конкретного ОПБ или определить полный репертуар захваченных ОДП соответственно ^8.

Некоторые методы доступны для изучения взаимодействия РНК-белокs. Для выявления РНК, связанные с данной РСП, RIP (РНК иммунопреципитации) и CLIP (УФ-сшивка и иммунопреципитация) могут быть применены. В противоположность этому, для выявления белковых партнеров данной РНК, РНК выпадающий, Chirp (хроматина изоляция путем очистки РНК), ДИАГРАММА (захват анализ гибридизации РНК-мишеней) и RAP (очистка антисмысловой РНК) могут быть применены. По сравнению с более поздними, РНК выпадающий метод требует меньших усилий, чтобы создать. Он может быть использован для захвата белков в пробирке и в естественных условиях. В естественных условиях подход РНК спуском, который является технически более сложной , чем его аналог в пробирке, сохраняет РНК-белковых взаимодействий путем сшивания в клетках, захватывает аптамеров меченные РНК , представляющие интерес из клеток, а затем обнаруживает связанные ОДП. РНК спускающее может быть использован для обогащения низких обильные ОДП, и для выделения и идентификации РНК-белковых комплексов , которые имеют различные функциональные роли в управлении клеточной регуляции ^9,10 .

Примечание: РНК представляет интерес в контексте данного исследования является фрагментом AR 3'UTR.

1. Приготовление биотин-меченой РНК

1. Для получения РНК, усиливать Т7-AR-олиго методом ПЦР с последующей транскрипцией в пробирке с использованием коммерческого набора и в соответствии с инструкциями изготовителя ^11.
   Примечание: праймеры для ПЦР, приведены в таблице 4: T7-AR-F и Т7-AR-R.
2. Для неспецифического связывания контроля, усиливать частичную последовательность люциферазы светлячка (ФЛ) ДНК с помощью ПЦР из psiCHECK-2 плазмиды, а затем в пробирке транскрипции.
   Примечание: праймеры для ПЦР, приведены в таблице 4: hluc (+) - Т7-зонд-F и hluc (+) - зонд-R Таблица 4 Последовательности матрицы и праймеров для ПЦР - амплификации...
3. Для 50 мкл ПЦР-реакции, смесь 50 нг ДНК (олиго или плазмиды), 4 мкл дНТФ (2,5 мМ каждого отдельного дНТФ), 5 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл 2,5 U / & #181; л ДНК-полимеразы, 2 мкл 10 мкМ прямого праймера, 2 мкл 10 мкМ обратного праймера, и нуклеазы без воды.
   1. Запуск ПЦР-амплификации в амплификатор с использованием следующей программы. ЭТАП 1: один цикл 95 ° С в течение 2 мин; STEP2: 35 циклов 95 ° С в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 30 секунд (AR) или 60 секунд (FL); ШАГ3: один цикл при 72 ° С в течение 10 мин.
4. Обобщить биотинилированных РНК с использованием транскрипции набора в пробирке в соответствии с инструкциями изготовителя ^11. В этом эксперименте используют продукты ПЦР в качестве матриц для синтеза РНК. Для 20 мкл в пробирке реакции транскрипции, смешайте 200 нг ПЦР - амплификации ДНК, 2 мкл каждого отдельного NTP, 1 мкл 10 мМ биотин-CTP, 2 мкл 10х реакционного буфера и 2 мкл РНК - полимеразы Т7. Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 4 часов.
5. После транскрипции в пробирке, Трит реакционной смеси с 1 мкл 2 ед / мкл ДНКазы при 37 & #176 ° С в течение 15 мин для разрушения шаблона ДНК. И, наконец, разбавленным биотинилированного РНК в общем объеме 60 мкл для последующей очистки.
6. Очищают биотинилированных РНК для удаления солей и некорпоративные нуклеотидов с помощью колонок для очистки в соответствии с инструкциями изготовителя ^12. Измерение концентрации РНК и хранят при -80 ° С в течение последующих раскрывающихся анализов.
7. Для обеспечения правильной вторичной структуры для РНК интереса к РНК-белкового взаимодействия, тепла 50 мкл биотинилированным РНК (50 мкМ) при 90 ° С в течение 2 мин, холод на льду в течение 2 мин, затем поставить с 50 мкл 2x структуры РНК - буфера (табл 3), а также позволяют РНК складном при комнатной температуре в течение 30 мин ^13,14.

2. Получение РНК-гранулами, конъюгированными

Примечание: Используйте магнитную подставку для разделения магнитных шариков и супернатанта.

1. Ресуспендируют покрытые стрептавидином магнитные гранулы в оригинальном флаконе с кратким vorteсин в соответствии с инструкциями изготовителя. Перенести 150 мкл ресуспендировали бусин в 1,5 мл трубки. Поместите пробирку на магнит в течение 1 мин. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
   Примечание: В РНК раскрывающихся анализах, когда аликвоты ресуспендировали бусы из оригинального флакона, используйте 50 мкл бус Для анализа с последующим вестерн-блоттинга, и 200 мкл бусинки для анализа с последующим МС.
2. Вымойте бусин один раз ресуспендирования бусинка гранул с 1 мл рекомендованной заводом - изготовителем 1x W & B (связывание и промывки) буфера (таблица 3), а затем, вращая трубку в течение 5 мин при комнатной температуре в ротатор. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
3. Для того, чтобы инактивировать РНКазы на шариках, мыть бусин в два раза, каждый раз с помощью ресуспендирования осадком из гранул с 400 мкл буфера А. буфера А представляет собой щелочной раствор , содержащий 0,1 М NaOH и 0,05 М NaCl (таблица 3). Поворот через трубку в течение 2 мин при комнатной температуре в ротатора. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
<литий> Чтобы удалить NaOH из бисера, бусин мыть дважды, каждый раз при диспергировании осадком из гранул с 400 мкл буфера В (таблица 3), с последующим поворотом трубочки в течение 2 мин при комнатной температуре в ротатора. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
4. Ресуспендируют осадок шарик 300 мкл 2x W & B буфера, разделить поровну шарики и переносят на три 1,5 мл пробирки (100 мкл шариков на пробирку). Поставка бортовых содержащих пробирки с 100 мкл РНКазы свободной воды, 100 мкл биотинилированным РНК FL и 100 мкл биотинилированного А.Р. 3'UTR РНК, соответственно.
5. Инкубируют каждый шарик смеси в течение 1 ч при комнатной температуре с вращением. Поместите трубки на магнит в течение 1 мин. Выбросьте все супернатант. Держите шарик гранул.
6. Промыть бусин в два раза, каждый раз с помощью ресуспендирования каждый осадком из гранул с 400 мкл 1x W & B буфера, а затем вращая пробирки в течение 5 мин при комнатной температуре в ротатора.
7. Поместите трубки на магнит в течение 1 мин. Выбросьте все супернатант. Ресуспендируют каждый шарик Pelleт с 50 мкл буфера для ядерной изоляции (таблица 3).

3. преадипоцитов Изоляция и адипогенеза Индукционная

1. Как было описано в предыдущих публикациях ^5, рассекают преадипоциты из межлопаточной бурой жировой ткани (мышей дикого типа C57BL6, 3 недель).
2. Вырастить и в пробирке дифференцировать преадипоциты ^5. Клетки готовы к применению вниз по течению через 4-5 дней после начала дифференцировки.

4. Получение клеточного лизата из первичных адипоцитов

Примечание: Убедитесь, что все процедуры подготовки клеточного лизата сделаны на льду, и все буферы охлажденным на льду. Предварительно охлажденные Даунса стеклянные гомогенизаторы на льду.

1. Растут и дифференцировать преадипоциты в 15 см чашки ⁵ (смотри раздел 3.2). Каждое блюдо обеспечивает адекватные клетки для одной РНК выпадающим анализа. На 4-й день или 5-й день дифференциации, сброшенных среды для культивирования клеток, и мыть CELLS один раз с 1x PBS.
2. Для сбора клеток, добавляют 10-15 мл 1X PBS к клеткам, царапать, чтобы собрать клетки в 50 мл пробирку и Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант с помощью пипетки 1 мл.
3. Осадок Ресуспендируют клеток в 2 мл гипотонического буфера (таблица 3), и инкубировать клетки на льду в течение 15 мин. Передача клеток в стеклянном гомогенизаторе 15 мл Даунса и касательные клетки механически на льду с 20 ударов.
4. Гранул ядра клеток центрифугированием при 3300 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Держите ядер гранул на льду для дальнейшего использования (см раздел 4.6). Перенести супернатант в 1,5 мл пробирки, добавляют 3М KCl к супернатанту, чтобы получить конечную концентрацию 150 мМ, и спина при 20000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
5. После центрифугирования, тщательно удалить lipidlayeron верхней с помощью 1 мл пипетку, и собирают супернатант в качестве цитоплазматического клеточного лизата.
6. Ресуспендируют ядер гранул (смотри раздел 4.4) в 1 мл ядерной изоляции буфера. Tядер ransfer в стеклянном гомогенизаторе 15 мл Даунса с использованием 1 мл пипетку и сдвига ядер механически на льду с 100 ударов. Гранул ядерного дебриса путем центрифугирования при 20000 х г в течение 15 мин при 4 ° С, и собирают супернатант в качестве ядерного клеточного лизата.
7. Либо объединить ядерные и цитоплазматические клеточные лизаты, или использовать каждую фракцию отдельно, ниже по течению выпадающим применения. В этом демонстрационном эксперименте, эти две фракции клеточных лизатов были объединены при объемном соотношении 1: 1.
8. Добавить ингибитор РНКазы в этой нефракционированного клеточного лизата с получением конечной концентрации 0,5 ед / мкл. Отложите 100 мкл клеточного лизата в качестве входного контроля для вестерн - блоттинга ^15.

5. Binding и элюирования ОПБ

1. Разделение лизат клеток на три равные аликвоты (1 мл лизата клеток в 1,5 мл трубки), и инкубировать с пустым, FL РНК-конъюгированные и А.Р. 3'UTR РНК-гранулами, конъюгированными (смотри раздел 2.8), соответственно, в течение 3 ч при 4 ° Сс вращением.
2. Поместите трубки на магнит в течение 1 мин. Собирают супернатант с использованием 1 мл пипетки, с последующим выделением РНК из надосадочной жидкости для подтверждения РНК целочисленность. Изолировать РНК с использованием кислоты гуанидина раствора тиоцианата-фенол В соответствии с инструкциями производителя (таблица 2). Оценка РНК целость путем анализа 28S и 18S субъединиц рибосомальной РНК. Держите шарик гранул на льду.
3. Промыть магнитные гранулы шесть раз, каждый раз с помощью ресуспендирования каждый осадком из гранул с 1 мл ядерной изоляции буфера, содержащего 40 ЕД РНКазы ингибитора и 0,25% Igepal, а затем вращая пробирки в течение 2 мин при комнатной температуре в ротатора. Используйте магнитную подставку для разделения магнитных шариков и супернатанта. Выбросьте все супернатант. Держите шарик гранул на льду.
4. Используйте следующие шаги для элюирования РНК-белковые комплексы из бисера для вестерн-блоттинга. Во-первых, ресуспендируют каждый шарик осадок в 75 мкл буфера для ядерной изоляции; Затем добавьте 25 мкл 4x Вестерн-блот загрузки БУФFER (содержащий SDS), чтобы получить общий объем 100 мкл. И, наконец, кипеть бусин в этом 100 мкл раствора при 95 ° С в течение 5 мин.
   Примечание: Используйте следующие шаги для элюирования РНК-белковые комплексы из бисера для MS. STEP1: ресуспендирования каждый шарик осадок в 100 мкл буфера для элюции (таблица 3); STEP2: инкубировать пробы шарик в течение 2-3 ч при комнатной температуре с вращением; STEP3: центрифуга и собирать белок, содержащий супернатант; STEP4: концентрат белковых растворов до 20-30 мкл до подачи на MS.
5. Центрифуга каждые 100 мкл бисерной образца при 12000 х г в течение 30 с при температуре 4 ° С, и собирать надосадочную жидкость. Алиготе 15 мкл супернатанта для Вестерн-блоттинга (смотри раздел 6.1 и 6.2). Зонд полученной мембраны с разбавленной HuR мышиных моноклональных антител (1: 1000 разбавления), в течение ночи.

6. Вестерн-блоттинг по проверке ОПБ

1. Отдельные ОДП по SDS-PAGE с использованием стандартных методик.
2. Проведение мыСтерн-блоттинга с использованием стандартных методов, путем зондирования для ОДП, ассоциированных с РНК, представляющей интерес.
   Примечание: В этом демонстрационном эксперименте HuR мышиные моноклональные антитела использовали для иммунологического белка Hur.
3. Выдержите полученную мембрану, разбавленным Hur антителом (1: 1000 разведение) в 5% вес / объем Обезжиренное сухое молоко, 1x TBS, 0,1% Твин - 20 на 4 ° C при осторожном встряхивании, в течение ночи. Вымойте мембраны три раза 1x TBST. Инкубируйте мембрану со вторичным антителом (козье антитело против мышиного IgG-HRP), при комнатной температуре в течение 1 часа. Вымойте мембраны. Разработка и запись сигнала.

В этом демонстрационном эксперименте, фрагмент AR РНК использовали в качестве приманки, чтобы захватить его связывающий белок Hur. Оба РНК-приманка FL, которая не является отношение к белку Хур и аликвот неконъюгированных пустых стрептавидином бусин служили в качестве отрицательного контроля. РНК-белковых взаимодействий может происходить либо в ядре или цитоплазме, и этот протокол спускающее может быть применен к любой общей или фракционированной (ядерной или цитоплазматической) клеточных лизатов. Анализ белков с помощью Вестерн-блоттинга показал, что образец 15 мкл нефракционированного лизата клеток (смотри раздел 4.8), так как не-бусинка входного контроля, дала положительный результат, указывающий, что HuR белок обнаружен в адипоцитов лизата первичной мыши культуры, используя моноклональное антитело. Вымывание фракция AR РНК дала положительный результат, указывающий, что HuR белок обнаружен в адипоцитов лизата с помощью AR РНК-конъюгированные бусинки для ниспадающего анализа РНК. Оба РНК элюирование фракции FL и бневьющийся шарик образца дали отрицательный результат, что указывает на неспецифических взаимодействий между фрагментом РНК и белка FL Hur, а также между пустыми бусин и белком Hur не обнаруживаются с помощью этой РНК выпадающим подхода. Результаты этих двух отрицательных контролей также показывают, что специфическое взаимодействие между фрагментом AR РНК и белка Hur успешно обнаруживается протоколом понижающим РНК, описанной здесь.

Рисунок 1: Вестерн - блот Проверка HuR Захваченный РНК спускающее Assays Входной сигнал: восстанавливали клеточный лизат (цитоплазматический + ядерный лизат);. Шарики: образец из заготовки покрытых стрептавидином магнитных гранул; РНК FL: стрептавидином шарики, связанные с мРНК FL; AR 3'UTR РНК: стрептавидином шарики, связанные с AR мРНК 3'UTR; Первичное антитело: HuR мышиных моноклональных антител; Вторичные антитела: козий анти-Мышь IgG-HRP; Аббревиатура, FL: люциферазы светлячка, AR: рецептор андрогена; Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Основные оборудование , используемое в этом исследовании Основное оборудование используется в данном исследовании..

Таблица 2: Основные реагенты , используемые в настоящем исследовании Основные реагенты , используемые в данном исследовании..

. Таблица 3: Основные решения , использованные в этом исследовании 2x структура РНК буфера (смотри раздел 1.7); Буфер (смотри раздел 2.3); Буфер B (смотри раздел 2.4); 1x W & B (Переплет и стиральными) буфера (см разделы 2.2, 2.5, 2.7); 1x гипотонического буфера (смотри раздел 4.3); буфер 1x Ядерная изоляция (см разделы 2.8, 4.6, 5.3, 5.4); 1x Элюирование буфера (смотри примечание следующем разделе 5.4).

Таблица 4: Последовательности матрицы и праймеры для ПЦР - амплификации Т7-AR-олиго:. ДНК - матрицы для ПЦР - амплификации (смотри раздел 10,1); T7-AR-F: прямой праймер для ПЦР-амплификации (смотри раздел 1.1); T7-AR-R: обратный праймер для ПЦР-амплификации (смотри раздел 1.1); hluc (+) - Т7-зонд-F: прямой праймер для ПЦР-амплификации (смотри раздел 1.2); hluc (+) - зонд-R: обратный праймер для ПЦР-амплификации (смотри раздел 1.2).

lncRNAs и ОДП играют жизненно важную роль в здоровье и болезни, однако молекулярные механизмы этих молекул изучены слабо. Идентификация белков, которые взаимодействуют с молекулами lncRNA является ключевым шагом на пути к выяснению механизмов регулирования. Обогащение ОДП по выпадающим системе анализа РНК на основе комплексного решения захвата взаимодействующих комплекса, так что белки из лизата клеток может быть селективно извлекали с помощью биотинилированных приманок РНК, связанные с стрептавидином магнитных шариков. Некоторые другие методы , такие как Chirp, штурманский и РПД может достичь той же цели, однако эти методы требует больше усилий , чтобы установить, чем РНК выпадающим техники ^16,17,18.

Основная сила РНК спуском в том, что она является относительно простой протокол, и легко выполнить. Оба CHIRP и RAP включает стадию сшивания, которая сохраняет природные РНК-белковые комплексы и конструкции полного набора антисмысловых олигонуклеотидов (90 NucleOtides долго в РПД, и длиной 20 нуклеотидов в Chirp) черепицей всю РНК - мишени ^16,17,18. РНК складывания является важным шагом в РНК раскрывающихся анализов. Основным ограничением этого протокола является то , что целевые РНК синтезируются в лабораторных условиях и не могут быть правильно сложены в нативную структуру , чтобы обеспечить надлежащее связывание с RBP (ами). Неправильно свернутые неродного РНК могут либо не способны формировать РНК-белковых взаимодействий и аннулированию функциональных анализов или формы взаимодействия , которые происходят только в лабораторных условиях при нефизиологических. Хотя протокол выпадающий описанный здесь был принят хорошо признанную процедуру РНК складывания ^13,14 (смотри раздел 1.7), это не гарантирует правильную укладку для других РНК - транскриптов.

РНК выпадающий часто в сочетании с RIP в качестве дополнительного подхода для выявления РНК (ы) обязательность КПБ интересов ^19. Еще одним важным шагом в этом протоколе является удаление липидной фракции из общей клеткилизат (смотри раздел 4.5), так как высокая липидный изобилие в зрелых адипоцитов представляет собой серьезную техническую проблему. Протокол, описанный здесь, в частности, разработан для использования с адипоцитов. Тем не менее, основные компоненты этого протокола и строгостью всех используемых буферов могут быть изменены и приспособлены для применения к другим моделям клеточных культур. Для тканей , которые имеют высокие уровни эндогенных РНКазы, различные РНК протоколы ниспадающие могут быть применены.

РНК выпадающий, которая использует РНК, представляющие интерес для выявления сопутствующих ОДП, является эффективным и эффективный метод, чтобы исследовать поворотные функции и механизмы lncRNAs, которые имеют широкий диапазон ролей в человеческих клетках. Дальнейшее развитие РНК на основе захвата, включая РНК-спуском, будут необходимы для решения проблем с определением компонентов, сборку и функцию РНК-белковых комплексов, а также генерировать достаточные ОДП из низких обильными РНК-белковых комплексов для РС.

Нет конфликта интересов объявлены.

Эта работа финансировалась Сингапур NRF стипендий (NRF-2011NRF-NRFF001-025), а также CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).