Развитие

Современные модели в пробирке для оценки контактных линз (КНК) и других приложений , связанных с глаз сильно ограничены. Представленная глазное платформа имитирует физиологическую поток разрыв, слезоточивый объем, воздействия воздуха и механического износа. Эта система является универсальным и может быть применен к различным в пробирке анализов с CLs.

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,^1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.⁷ The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Два важных областях, представляющих интерес в пределах контактных линз (CL) арене включают дискомфорт и разработку новых приложений CL. Выяснение механизмов , лежащих в основе CL дискомфорта является вопросом , который ускользает поле в течение многих десятилетий. ⁸ Развитие новых, функциональных КН, такие как устройства доставки лекарственных средств ^1,3,9 и биосенсоров, ^10-12 является областью растущего интереса, с существенными потенциальными рынками. В обоих случаях, сложная и в модели пробирке будет предоставлять соответствующую информацию для оказания помощи в выборе материалов подходит для объективов или конструктивных характеристик на этапе разработки. К сожалению, в настоящее время моделях пробирке для оценки КН и других приложений , связанных со зрением являются относительно грубыми и бесхитростно. Традиционно, в пробирке исследования CL , оценивающие слезоточивым осаждения пленки или доставки лекарственного средства выполняются в статических, больших флаконах объемом , содержащих фиксированный объем жидкости, который GreaTLY превышает физиологические количества. Кроме того, эта простая модель не естественный компонент потока на разрыв и мерцающего рефлекс, оба из которых являются определяющими факторами глазного среды.

Разработка сложных, физиологически соответствующих глаз "модели" потребует междисциплинарного подхода и требуют существенной в естественных условиях проверки. По этим причинам, фундаментальная основа для нашей экстракорпорального модели глаза в очень универсальна, так что модель может быть постоянно улучшена за счет будущих обновлений и модуляций. На сегодняшний день модель способна имитировать слезоточивый объем, слезоточивый поток, механического износа и воздействия воздуха. Цель состоит в том, чтобы создать модель в пробирке , которая обеспечит значимые результаты, что является предсказанием и бесплатно в естественных условиях и естественных условиях наблюдений бывших.

Все эксперименты были завершены в соответствии и с соблюдением всех соответствующих руководящих принципов, изложенных в Университете Ватерлоо исследований животных комитета по этике. Бычьего глаза щедро пожертвовали от местного бойне.

1. Модель глаз

1. Проектирование и производство пресс - форм ¹³
   1. Дизайн модели глаз в соответствии со средними физиологических размеров взрослого глаз человека. ¹³
   2. Отступ 250 мкм между глазным яблоком и веко куски модели глаза. Конструкция соответствующих пресс-форм с помощью разработки программного обеспечения автоматизированного (САПР).
   3. Создать новый файл .cad или .sldprt файл с AutoCAD или Solidworks. Создание 3D модели человеческого глазного яблока / веко. Создание форм из моделей и сохранять формы в виде .stl файлов.
   4. Импорт .stl файлов в программное обеспечение принтера 3D (например, makeware для replicator2). Укажите параметры печати (местоположение, разреженность, масштаб, ориентация, гладкость и т.д. ) ^13.
   5. Сохраните файл под именем G-кода файла для 3D-принтеров для чтения. Выберите материалы , такие как АПТ (полимолочной кислоты), ABS (акрилонитрил - бутадиен - стирол), PC (поликарбонат), или их комбинации, для печати пресс - формы ^13.
   6. Установить желаемую нить материала выбора. Импорт файла G-кода в 3D-принтер для чтения. Печать пресс-формы.
      Примечание: В качестве альтернативы, производят глазные формы с помощью компьютера числовым программным управлением (ЧПУ) машина, если гладкая поверхность на модели глаза желательно. Для изготовления пресс-форм с ЧПУ, материалы для пресс-форм, больше не ограничивается тепловыми пластике, но распространяется на металл, керамика, а также химически резистивных полимеров, таких как политетрафторэтилена.
   7. Открытый программный интерфейс с ЧПУ, который соединен с режущим сверлом. Построить 3D формы в соответствии с передней, сверху, сбоку и вид в перспективе ранее построенной модели глазного яблока / веко форм в программном интерфейсе управления. Выберите соответствующие параметры дляобработка (немного размер, материал подложки, толщина материала) и приступить к вырезать форму.
2. Синтез Окуляры с использованием PDMS
   1. С помощью шприца, измерить 10 мл объема PDMS (полидиметилсилоксана) базы и заполнить его в центрифужную пробирку 15-50 мл. Добавьте 10% вес / объем раствора эластомера от общей массы PDMS. С помощью палочки-мешалки, смешать растворы хорошо.
   2. Налейте раствор PDMS в глазное яблоко и веко формы. Разрешить PDMS, чтобы поселиться в РТ O / N (или, по крайней мере, 12 ч) для начала полимеризации и позволить пузырьки, чтобы растворить из полимера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что нет никаких пузырей, оставленных в PDMS, которые могут расти или расширяться.
   3. Затем поместите пресс-формы в 75 ° С (167 ° F) духовке в течение 1 ч, или 150 ° C (302 ° F) в течение 5 мин. Для получения более мягкого геля, пусть PDMS сидеть при комнатной температуре в течение по крайней мере 48 часов, чтобы полностью полимеризуется.
   4. Поместите образцы в морозильной камере в течение нескольких минут; это будет сжать PDMS и упроститьВскрытие образцов из пресс-форм. Извлеките окуляры из пресс-форм с помощью тонкого шпателя.
   5. Для доставки раствора в пространство между глазным яблоком и веко куски, соединить 1/16 "х 1/8" политетрафторэтилена трубку с разъемом 1/16 «равной ноге стяжка трубы и прикрепить его к веко кусок в отверстие трубки ,
3. Синтез Eyeball Кусок Использование агарозном
   Примечание: Глазное яблоко часть может быть синтезирована с использованием других полимеров, таких как агароза. Следующая процедура также может быть изменен, чтобы произвести глаз кусочки из различных типов агар, таких как PDA (картофельный агар с декстрозой) или SDA (декстрозный агар Сабуро).
   1. Для получения 2% (2 г / 100 мл) гель, мера 2 г агарозы и смешивают с 100 мл сверхчистой воды. Доведите раствор до кипения (100 ° C) таким образом, что агарозном растворяется полностью. Дают раствору остыть в течение 5 мин.
   2. Налейте раствор в глазное яблоко формы и дайте раствору остыть в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалить глазного яблока кусочки с помощью шпателя. Хранить агар глазного яблока в -20 ° С с морозильной камерой для последующего использования. Для исследований микробиологических, стерилизовать глазного яблока формы автоклавированием и / или УФ-облучения.
4. Включение бычьего роговицу на PDMS Eyeball
   Примечание:. Этот протокол был адаптирован из Parekh и др ¹⁴
   1. Выполните рассечение и включение говяжьих роговицу в стерильных условиях под колпаком с ламинарным потоком. Приобретать глаза и рассекать их в тот же день.
   2. Поверните кожух потока на 10 мин до использования и дезинфицировать с 70% -ным спиртом этанола. Убедитесь в том, что все материалы и инструменты стерильны автоклавированием при 273 ° F / 133 ° С в течение 45 мин, и расположены не менее 4 дюймов от входа капота потока.
   3. Опустить глаза крупного рогатого скота в химический стакан, содержащий разбавленный повидон-йода в течение 2 мин. Промыть глаза в химический стакан, содержащий фосфатно-буферный раствор (PBS), рH 7.4. Использование щипцов осторожно положите глаз на стеклянную чашку Петри, роговице лицевой стороной вверх.
   4. Удалите излишки мышц и жировой ткани путем разрезания на склеры точек крепления с тупым концом рассечение ножницами. Утилизацию избыточной ткани в стерильный стакан, предназначенную для отходов животного происхождения.
   5. С помощью микро-ножницы, удалите конъюнктиву из глаза. Оберните глаз стерильной марлей, сохраняя расстояние не менее 1 см от лимба.
   6. Используя скальпель, надрезать склеры примерно 2 мм от лимба области и поверхностно таким образом, чтобы избежать проникновения нижележащей сосудистой оболочке глаза и стекловидного тела. Осторожно продлить разрез на 360 ° с помощью скальпеля или рассечение ножницами, не деформируя роговицу от его естественной кривизны.
   7. С тонким пинцетом, удалите роговую оболочку из глаза. Использование щипцов, тщательно удалить любые остатки увеальной ткани и промойте роговицу с PBS.
   8. Храните роговицу при 31ºC в стерильный контейнер с культуройсреда (например, среде 199), содержащий 3% фетальной бычьей сыворотки, чтобы поддерживать влажность тканей и клеток питание.
   9. До начала экспериментов, отдохнуть вырезанную роговицу на глазное яблоко PDMS, и зажимают две части вместе со специализированным Петличный.

2. Blink-платформа

1. Проектирование и производство Blink-платформы
   Примечание: Мигание-платформа состоит из трех функциональных частей: модель глаза (как описано в разделе 1), трансмиссионные системы, а также электронная система.
   1. Проектирование и производство моргания платформу с использованием САПР и 3D-печать, аналогичную описанной для модели глаза (раздел 1.1). Конструкция системы передач таким образом, что она транслирует простое вращение двигателей в боковых и вращательных движений в окуляры. ¹⁵
   2. С помощью шестерней и передаточный механизм, перевести вращательное движение шагового двигателя в боковом движении зубчатого колеса, которое соединено с веко штук.
   3. Используясопряженная система передач, усиливать одно вращательное движение от шагового двигателя на три (или более) ротационных движений для трех различных частей глазного яблока.
   4. Совместите два передаточных систем, один для веко и один для глазного яблока, таким образом, чтобы расстояние между двумя постоянными. Соберите электронную систему с микроконтроллером, щитом двигателя и двух двигателей.
      Примечание: Используйте два шаговых двигателей, чтобы обеспечить вращательных двигателей, что переводится системой передачи в мигающем движения.
   5. Соедините два шаговых двигателей с системой, состоящей из двигателя щита устанавливаются на микроконтроллер. Подключение и настройка электронных компонентов для работы с открытыми исходными кодами программных продуктов.
   6. Программирование системы для контроля параметров двигателя, таких как выстрелов в минуту (RPM), количество раундов вперед, количество раундов назад и поворота стиля.
      Примечание: Обратитесь к дополнительному "Arduino файл кода" для подробностей.
   7. Загрузите программное обеспечение системы с масайт nufacturers.
   8. Установка программного обеспечения и открыть его. Написать код для управления шаговым двигателем в нужной конфигурации. Подключение системы с источником для питания электронной системы, так что двигатели двигаться в желаемом порядке, как это определено исследователем.
      Примечание: Обратитесь к дополнительному "Arduino файл кода".
2. Монтаж с Microfluidics (Tear Искусственное Solution)
   1. Возьмите синтезированный глазного яблока и век кусочки и скольжения их на соответствующие им клип дополнения для глаз модели. Подключите трубку, которая соединяется с помощью шприца и расположенный на микрожидком насоса с веко части (раздел 1.2.5). Пробный запуск платформы и проверить для последовательного движения.
   2. Премьер-трубки и проверьте наличие стационарного потока искусственного раствора слезной (ATS). Рецепт для САР уже сообщалось ранее. ¹⁶
   3. Вручную переместить модели глаза вместе частей на ровной поверхности, таким образом, что глазное яблоко, и глазкрышки находятся в контакте. Установить расход микрожидком насоса до требуемых значений. Установить физиологические скорости потока в 1-1.5 мкл / мин. ¹⁷
   4. Включите насос и исполнительные механизмы, чтобы начать эксперимент. Для экспериментов доставки лекарственного средства, место, содержащим лекарственное средство контактные линзы на глазное яблоко кусок.
   5. Дайте проточный жидкости капать в 12-луночный планшет. В нужный набор интервалов времени, количественного определения анализируемого вещества или концентрации лекарственного средства с использованием обычных методов обнаружения , таких как УФ-Vis спектроскопии или флуоресценции. ^1,4,18
   6. Для исследований, оценивающих осаждение компонентов слезных на контактные линзы, поместите контактные линзы на "глазного яблока" кусок. Собирают проточную жидкость, которая может быть отброшен.
   7. После того, как желаемые промежутки времени, снимите контактные линзы от глазного яблока кусок и подготовить объектив для дальнейшего анализа, таких как конфокальной микроскопии.

Синтезированные глазные формы , полученные из механического цеха и от 3-D печати показаны на рисунке 1. Эти формы могут быть использованы с различными полимерами, такими как PDMS и агарозы, чтобы произвести окуляра с требуемыми свойствами. Поманил сборка модели глаза платформы с микрожидком шприцевой насос , показан на рисунке 2. Платформа имитирует механический износ за счет вращения глазного яблока части, и воздействия воздуха через боковые в и из движения веко части. Слезная жидкость вливается в веко из микрожидком насоса при требуемой скорости потока, а проточный жидкость может быть собрана в 12-луночный планшет.

Процедура рассечения хрусталика глаза быка, и крепление на окуляр PDMS изображен на рисунке 3. Избыточные ткани отделяются от глаза и отбрасывают, с последующим удалениемконъюнктивы. Удаление роговицы начинается с разреза в склере вблизи лимба. Рисунок 4 показывает разнообразие окуляров , которые могут быть использованы для различных анализов в пробирке. Смонтированные части глазного яблока показаны синтезируются из PDMS, агар, и экс-естественных условиях бычьего роговица , установленный на глазное яблоко кусок PDMS.

На рисунке 5 показано исследование с целью оценки высвобождения антибиотика, моксифлоксацин, от CLs. ¹⁸ При проведении измерений в традиционной модели флакона, высвобождение лекарственного средства происходит в течение первых 2 ч следует фаза плато. В противоположность этому , новая модель глаза показывает высвобождение лекарственного средства будет медленным и устойчивым до 24 ч. ¹⁸ Исследование оценки отложение холестерина на CLs показано на рисунке 6. Холестерин в исследовании был флуоресцентно помечены в виде NBD -холестерина (7-nitrobenz-2-окса-1,3-тиадиазол-4-ил-холестерина), и Deposition была визуализируют с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Эти результаты указывают на то, что существуют значительные различия, когда исследования осаждения проводят в ампуле по сравнению с моделью глаза.

Рисунок 1. окуляра формы. (A) Eyeball шт плесень из механический цех. (B) глаз крышка формы из 3-D печати. ​​Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. В пробирке глазное платформы. (A) Круговое движение имитирует механический износ. (В) Боковое движение производит прерывистый воздухвоздействие. (C) Tear вливание жидкости в веко. (D) Сбор луночного планшета. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Вскрытие и включение бычьей роговицы. (A) Удаление избыточной ткани. (Б) Удаление конъюнктивы. (С) врезания в лимба регионе. (D) вырезают роговица может храниться или устанавливаться на PDMS глаз шаровой части. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Примеры окуляры. Образец PDMS окуляра с контактной линзой, агар окуляра, и исключая виво бычьего роговица глаза кусок установлен. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Доставка лекарственных средств с использованием экстракорпорального глазное платформы. Выпуск моксифлоксацина от ежедневных одноразовые контактные линзы , из (A) большой объем статической ампулу и (В) модель глаз (Повторная печать с разрешения Ассоциации по исследованиям в области видения и Офтальмология). ¹⁸ Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Есть три важных шагов в рамках протокола, которые требуют особого внимания: разработка и изготовление пресс-форм (раздел 1.1), монтажная платформа (раздел 2.2.1-2.2.3), а также мониторинг экспериментальный пробег (раздел 2.2.4-2.2.7 ). С точки зрения проектирования и производства пресс-форм (раздел 1.1), глазное яблоко кусок должен быть разработан в соответствии с размерами человеческой роговицы. Тем не менее, может потребоваться несколько прототипов формы перед глазного яблока кусок может быть создан, который идеально подходит коммерческий контактные линзы (CL). Кроме того, потребности в 250 мкм, которые будут поддерживаться при глазное яблоко и веко часть находятся в контакте, чтобы обеспечить слезной жидкости течет плавно по всей модели глаза, когда CL присутствует. Это расстояние может быть изменено в будущих итераций, но не должно быть меньше, чем 150 мкм, чтобы обеспечить достаточное расстояние, чтобы соответствовать CL. Сборка платформы (раздел 2.2.1-2.2.3) требует особого внимания таким образом, что глазное яблоко и веко кусочек вступают в Контакт во время движения мигать. Если окуляры не в идеальном контакте, то моделирование замкнутого веко и механическое трение терпит неудачу. Оператор должен наблюдать платформу в движении в течение нескольких циклов, чтобы гарантировать, что и глазное яблоко и веко находятся в контакте, и что растирание происходит в соответствии с программой. В настоящее время платформа предназначена для непрерывной работы в течение одного месяца, но оператор должен всегда проверять на стабильность системы каждые 24 ч при проведении эксперимента (раздел 2.2.4-2.2.7). Это важно, поскольку текущая платформа не обладает контроля температуры или влажности, а также колебания этих параметров может иссякнуть ЦБС. Если это происходит, место модели глаза в контролируемой камере влажности и температуры. Кроме того, для экспериментов доставки лекарственного средства, собранные проточный жидкость следует анализировать или хранить по крайней мере через каждые 2 ч, чтобы избежать значительного испарения образца.

Есть в настоящее время два ограничения представленныхмодель глаза. Первое ограничение в отношении воздействия на окружающую среду. В настоящее время, потому что глаз части не заключены в контролируемой камере, изменения, такие как температура и влажность в рабочей зоне будет влиять на различные аспекты экспериментов. Например, если окружающая среда слишком сухая, то КН высыхают быстрее и может отделить от глазного яблока части, или проточный жидкость могла испаряться. Для решения этой проблемы, будущие итерации разместятся модели глаза в контролируемой температуры и влажности камеры. Второе ограничение относится к сложности глазного яблока кусок. В настоящее время окуляры простые, состоящие либо из PDMS или агарозы, ни один из которых действительно представляет роговичных свойств поверхности. Дальнейшая работа будет направлена ​​на создания моделей глаз, который ближе имитирует роговичной поверхности структуры.

В пробирке исследования глазного , как правило , рассматривается в качестве предшествующего этапа тестирования к исследованиям в естественных условиях. Однако,важно иметь в виду , что исследования в пробирке также может быть дополнением к данным в естественных условиях, обеспечивая Критическое представление , что в противном случае не может быть достигнуто в результате исследований в естественных условиях в одиночку. К сожалению, в настоящее время в пробирке модели для тестирования CLs рудиментарны и отсутствие нескольких ключевых компонентов , чтобы адекватно имитируют среду в естественных условиях. Например, в пробирке исследования CL выполняются во флаконах , содержащих 2-5 мл фосфатно - буферного раствора, ^1-6 , который значительно превышает физиологические объемы слезу 7,0 ± 2 мкл. ⁷ Кроме того, два важных фактора , окуляра среды, поток естественной слезной и мигающий рефлекс, отсутствуют в простой статической модели флакона. Ограничения традиционной модели флакона, были признаны исследователями, и были предприняты попытки создать уникальный в пробирке моделей глаза , имитирующих глазное среды, путем включения компонента пополнения Микрожидкостных слезной ²0-24 и / или прерывистый экспозиции воздуха. ^25,26 Не удивительно, что результаты , полученные в результате этих экспериментов весьма различны , чем полученные с традиционной моделью флакона, и , возможно , более похожи по данным естественных условиях. ^20-25 Таким образом, разработка запутанные в пробирке модели глаза для изучения КН обеспечит новое понимание взаимодействия линз материалов с поверхности глазного яблока, а также способствовать развитию новых материалов и новых приложений для CLs в ближайшие десятилетия.

Можно утверждать, что одним из наиболее обсуждаемых аспектов экстракорпорального модели глаза в это напоминает ли глаз бесконечный раковину, что особенно важно , когда речь идет о доставке наркотиков из CLs. Под бесконечных условиях моек, объем окружающего раствора значительно выше , чем объем насыщения лекарственного средства, таким образом, что высвобождение лекарственного средства не зависит от растворимости препарата. ²⁷ Защитники флакона как аксесptable модель глаза утверждают, что роговица, конъюнктива, и окружающие глазные ткани вместе функцию как бесконечный раковину. Хотя теоретически это может быть правдой, препарат должен сначала раствориться в жидкости на разрыв. Этот шаг ограничение скорости, вероятно, не является условием раковины, и будет зависеть от объема как слеза и поток, как моделируется нашей модели.

Уникальный идентификатор представленной модели заключается в ее способности подражать пленки слезной жидкости. Приняв дизайн состоящий из двух частей, а "роговицу / склеры" глазного яблока раздел и "веко", можно создать равномерно тонкий слой слезной пленки через глазное яблоко кусок, когда обе части вступают в контакт. Для дальнейшего имитации поверхности глазного яблока, механического износа и воздействия воздуха включена в модель с помощью двух механических приводов. По мере того как веко движется в боковом направлении кусок, он имитирует закрытие глаза и прерывистого воздействия воздуха. Вращение глазного яблока имитирует механический износ произведенный Дьюринг мигает. Система соединена с микрожидком насосом, который вливает модели глаза с слезной жидкости при физиологическом скорости потока или любой другой желательной скорости потока. Слезная пленка формируется каждый раз, когда две части вступают в контакт, и слеза Распад происходит, когда две части разделены.

Цель состоит в том, чтобы создать универсальную платформу тестирования для оценки КН для различных анализов в пробирке. Для того, чтобы быть универсальным, глазное яблоко кусочки могут быть синтезированы из различных полимеров, таких как полидиметилсилоксан (PDMS) или агар. Для простых офтальмологических исследований, эти полимеры, которые представляют собой гидрофобные и гидрофильные поверхности, соответственно, будет достаточно. Тем не менее, поскольку необходимы более сложные анализы, например, глазное проникновение лекарственного средства или токсичности исследований, глаз части должны быть дополнительно модифицированы. Эти дополнительные модификации модели, такие , как включение экс виво роговицы , как показано, являются относительно осуществимо. Однако дальнейшие исследования по валидациинеобходимы, и будущая работа будет направлена ​​на улучшение обоснованности этой модели путем сравнения ее с моделями в естественных условиях.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Авторы хотели бы отметить наш источник финансирования NSERC 20/20 сеть для развития передовых офтальмологических материалов.