Создание клинически значимых

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Клинически значимых, макет хирургии катаракты, экс естественных эпителиальных ранозаживляющее модель, описанная здесь была разработана, чтобы предоставить инструмент для исследования механизмов, которые регулируют ремонт эпителиальных тканей в ответ на повреждение. Основные функции, которые были направлены на создание в этой модели включены 1) обеспечение условий, которые тесно повторены ответ в естественных условиях на ранив в условиях культуры, 2) простота модуляции регуляторные элементы ремонта, и 3) способность к изображению процесс ремонта, в полном объеме, в режиме реального времени. Таким образом, задача в том, чтобы создать модель культуры, в которой можно было учиться, и манипулировать, эпителиальных ремонт раны в родном микросреды клеток. Наличие этой раны ремонта модели открывает новые возможности для идентификации эндогенных реплики сигнализации от матричных белков, цитокинов и хемокинов, которые регулируют процесс восстановления. Кроме того, модель идеально подходит для изучения того, какп эпителий способен двигаться как коллективная листа повторно epithelialize рану площадь ^2,3, а для определения происхождение лидера мезенхимальных клеток в края раны, что функционировать в управлении коллективной миграции потерпевшей эпителия ^4. Эта модель также предоставляет платформу, с которой, чтобы определить терапевтические средства, которые могли бы способствовать эффективному заживлению ран и предотвращению аномальным раны ремонт ^5.

Есть уже ряд доступных моделей раны ремонт, и в культуре, и в естественных условиях, которые предоставили большую часть того, что известно о процессе заживления раны сегодня. В моделях на животных травмы, такие как роговицы и кожи ^{6-12 13-17,} есть возможность изучать реакцию ткани ранив в контексте всех ремонтных посредников, которые могли бы быть вовлечены в процесс, в том числе взносов сосудистая и нервная система. Тем не менее, существуют ограничения на манипуляции экспериментовпсихические состояния в естественных условиях, и это пока не представляется возможным провести исследования изображений отклика ремонт в естественных условиях, непрерывно в течение времени. В противоположность этому, большинство в пробирке с раной ремонт модели культуры, такие как царапины раны, можно легко манипулировать, и последующим течением времени, но не хватает на окружающую контексте изучения заживления ран в ткани в естественных условиях. В то время как исключая виво модели имеют преимущество в изучении процесса ремонта повреждений непрерывно в течение времени в контексте микроокружения клеток в сочетании со способностью модулировать регуляторов молекулярной ремонта в любой момент времени в процессе, есть несколько моделей, которые соответствуют этим Параметры.

Здесь описан порядок генерировать высоко воспроизводимое Экс Vivo эпителиальных ранозаживляющее культур, которые воспроизводят ответ эпителиального ткани в к физиологической ранения. Использование куриных эмбрионов объектив в качестве источника ткани, экс естественных MOCК хирургии катаракты проводится. Объектив идеально подходит ткань использовать для этих исследований, так как он является самодостаточным в толстой базальной мембраны капсулы, асептический, не иннервируются, и без каких-либо связанного стромы ^18,19. В болезни человека, хирургия катаракты обращается к потере зрения из-за помутнение хрусталика, и включает в себя удаление клеточной массы линзы волокна, который включает большую часть объектива. После хирургии катаракты зрение восстанавливается путем включения искусственного хрусталика. Процедура хирургии катаракты, за счет удаления волокон клеток, индуцирует ответ травмы в соседнем линзы эпителия, который отвечает реэпителизацию заднего области капсулы хрусталика, которые были заняты клеток волокон. В хирургии катаракты, как и в большинстве ответов заживления ран, там иногда происходит аберрантный фиброзной исход в заживления ран ответ, связанный с появлением миофибробластов, что в объектив известного как Posterior Capsuле Помутнение ^20-22. Для создания хирургии катаракты заживление ран модель, процедура хирургии катаракты имитируется в линзах удалены из куриного эмбриона глаза, чтобы произвести физиологическое травмы. Микрохирургические удаление объектива волоконно клеток приводит в очень состоятельной зоне круговой раны в окружении объектив эпителиальных клеток. Это популяция клеток остается прочно прикреплены к мембраны капсулы линзы подвал и пострадал от хирургического вмешательства. Эпителиальные клетки мигрируют на обнаженную область эндогенного базальной мембраны, чтобы залечить раны, во главе с населением виментина богатых мезенхимальных клеток, известных в процессе ремонта, как лидер клеток ^1. С помощью этой модели реакция эпителия на повреждение можно легко визуализировать и последующим со временем в контексте микроокружения клеток. Клетки были легко доступны для модификации экспрессии или активации молекул ожидается, будет играть роль в заживлении ран. Мощная функция гоэто модель способность изолировать и изучать миграции конкретных изменений в рамках заживления ран. Возможность подготовки большого числа в возрасте подобранных бывших естественных условиях заживления ран культур для исследований является еще одним преимуществом этой модели. Таким образом, эта модель системы дает уникальную возможность дразнить друг от друга механизмы заживления ран и тестирования терапии для их влияния на процесс заживления ран. Экс естественных макет модель хирургии катаракты, как ожидается, широкое применение, обеспечивая критический ресурс для изучения механизмов ремонта повреждений.

Следующий протокол соответствует руководящим принципам Уходу за животными и использование комитета Университете Томаса Джефферсона и заявления ARVO для использования животных в Vision Research.

1. Установка и подготовка Объективы для экс Vivo ран культуры

1. Поместите три 100 мм чашки Петри в стерильной, ламинарного потока капотом. Заполните два из чашек Петри с полпути Трис / декстроза буфера (TD буфера; 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,7 мМ Na ₂ PO _4, 5 мМ D-глюкозы, 8,25 мМ трис-основани, рН до 7,4 с помощью HCl) при комнатной температуре , в результате чего третий пустым. Предварительно теплой культура СМИ (Media 199 дополнена, 1% L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина) до 37 ^о С.
   Примечание: стандарт заживления питательных сред без сыворотки, как это происходит в естественных условиях; Однако раны-ремонтные культуры можно с успехом выращивать в определенных условиях медиа, которые включают сыворотку или другие факторы.
2. Удалить благодатную эмбриональных Dай 15 белый леггорн куриных яиц из инкубатора (проводится в 37,7 ° С с нежным покачиванием)
3. Поместите выбранный яйцо в ламинарный и чистой внешней оболочки с 70% этанола из промывочной бутылки. Провести все процедуры, приведенные ниже в асептических условиях в капюшоне ламинарного потока, используя стерильные растворы и инструменты.
4. Crack яйцо и место содержание в пустую 100 мм чашки Петри. Обезглавьте эмбриона с использованием стандартных щипцов и тонкие ножницы. Поместите куриного эмбриона голову в чашку Петри, содержащую буфер TD и правильно распоряжаться оставшейся части эмбриона. При желании сохранить не куриного эмбриона головы в TD буфере в течение короткого периода времени, не дольше, чем 15 мин.
5. Поместите куриного эмбриона голову на чашке крышкой блюдо. Использование высокоточных пинцета, снять объектив вместе с прикрепленной стекловидного тела из глаза в следующей последовательности. Зажмите заднюю часть глаза с помощью пинцета, чтобы создать небольшое отверстие в задней части глаза.
6. Затем, возьмитесь стекловидного тела шIth щипцы и осторожно потянуть на стекловидное тело с качения, стекловидное тело с объективом будет смещена от глаза. Место линзы / стекловидного в оставшейся чашку Петри, содержащую буфер TD. Разрешить линзы, чтобы остаться в TD буфера не более чем на 30 мин.
7. Перемещение объектива в новой крышкой чашки Петри при вскрытии микроскопом. С этого момента выполнения всех шагов при вскрытии микроскопом. С высокой точностью щипцы тщательно чистить от любой цилиарного тела (пигментные клетки), которые были выбиты с объективом, используя лезвие пинцетом, принимая осторожность, чтобы не повредить объектив ткани.
   Примечание: Удаление цилиарное тело гарантирует, что типы клеток, которые не эндогенным для объектива не включены в заживлении ран культуры.
8. Отделите объектив от стекловидного тела с высокой точностью щипцов, зажимая от стекловидного тела от его ассоциации с задней капсулы хрусталика.
9. Использование высокой точности щипцы передать объектив в маленькой каплиТД буфера (около 200 мкл) в 35-мм блюдо культуры ткани.

2. Выполнение Якобы хирургии катаракты

1. Расположите объектив в капле TD буфера в 35 мм блюдо с передней поверхности объектива вверх.
   Примечание: передней линзы легко идентифицированы по наличию плотным кольцом в ткани, что отмечает границу между передней и экваториальной области хрусталика эпителия. В отличие от этого, есть отсутствие маркировки на задней капсулы хрусталика, в которой клетки линзы волокна присоединены.
2. Использование двух Высокоточные пинцеты сделать небольшой разрез (примерно 850 мкм) в центре передней капсулы хрусталика, толстой базальной мембраны, которая окружает линзы ткани, и связанного с ним передней линзы эпителия, путем захвата ткани с одной щипцов в каждой руке и мягко дергая в противоположных направлениях.
3. Снимите массу волокна клеток, что составляет основную часть линзы ткани, dislodПеренять его от вложений в объектив эпителия и окружающих капсулы хрусталика гидро-элюции (подход, используемый в классическом хирургии катаракты, смоделированной на рисунке 1А).
4. Заполните 1 мл шприц с кончика иглы в 27,5 г с 300 мкл буфера TD. Вставьте кончик иглы в разрез, сделанный в передней капсуле хрусталика, и примерно на полпути в объектив.
5. Аккуратно нажмите на шприц для инъекций в TD буфер в массы линзы волокна клеток. Вводите между 50 и 200 мкл TD, и не более чем 300 мкл. Соблюдайте массу волокна клеток ослабив себя от эпителия и капсулы хрусталика.
6. Использование высокоточных пинцета, удалить остатков массы волокна клеток от объектива через переднюю сайта разреза.
   Примечание: Эта процедура оставляет задняя объектива базальной мембраны капсулы, в которой клетки волокна были присоединены лишена клеток и травмированного объектива эпителий просто, смежную с этого сайта.

3. Preparinг Раненый объектив для Ex Vivo культуры

1. Сведение объектива капсульный мешок, который образуется при хирургии катаракты, описанной выше на культуральную чашку, боковой клеток вверх, сделав пять разрезы в передней поверхности капсульного мешка.
2. Сокращение перпендикулярно к исходному разреза до экватора линзы. Свести результирующие пять "закрылки" по капсуле хрусталика с прикрепленным эпителия на стороне культура блюдо капсулы вниз, мобильный стороной вверх. Примечание экс естественных условиях раненого объектив должен теперь взять на звезды или flowerlike формы (рис 1B).
3. Для обеспечения капсулу на блюдо, нажмите мягко вниз с пинцетом в каждой точке звезды. Это позволит сделать небольшое углубление в пяти наиболее внешних концах эксплантата и привести к длительной привязанности к блюду.
   Примечание: Это можно повредить капсулу во время этой процедуры, и поэтому важно обеспечить капсулу на блюдо как можно ближе к кончикам FLAPS это возможно, а также сделать наименьшее количество точек крепления, насколько это возможно (как правило, два, максимум три за клапаном).
4. Снимите буфер TD от 35 мм блюдо и заменить его 1,5 мл подогретого СМИ. Накройте блюдо 35мм с крышкой и место в инкубаторе (37 ° С, 5% СО _2).

4. Разделение Центральной миграционной зоны (CMZ), где реэпителизацию раненых Площадь задней капсулы происходит, от оригинала Приложении зона (Oaz) объектива эпителиальных клеток, для количественного анализа.

Примечание: клетки начинают двигаться в область CMZ сразу в ответ на повреждение. По дня в культуре достаточное количество клеток мигрируют через CMZ для молекулярной и биохимического анализа, после разделения CMZ и Oaz по микро-рассечение ^23. Этот протокол включает в себя удаление одной створки (Oaz) одновременно с раненой области капсулы.

1. Соблюдайте Demarкатион, четко видны под микроскопом рассекает, между Oaz и CMZ (рис 2А). Использование двух высокоточных пинцета, захватить с обеих щипцов на краю OAZ / CMZ линии, один раз, прилегающей к другу, по обе стороны от линии (рис 2A, B, стрелка).
2. Использование одной рукой / один щипцы на стороне CMZ продолжать держаться раненого культуры, в то время как с другой стороны / щипцы, осторожно потяните Oaz по линии OAZ / CMZ. CMZ легко отделяется от Oaz вдоль этой линии. Продолжить вдоль этой линии вокруг всей культуре до двух регионах не полностью разделены.
3. Изучите разделенных Oaz и CMZ фракции для молекулярного анализа, такие как РНК-Seq ²⁴ или биохимического анализа, такие как вестерн-блоттинга или совместного иммунопреципитацией ^23,25.

Создано Экс Vivo Модель для изучения процесса заживления ран на родном микросреды клеток

Чтобы исследовать механизмы, участвующие в регуляции заживления эпителия в родном микросреды клеток, клинически значимых экс естественных макет модель хирургии катаракты была создана. Эта модель создана из ткани хрусталика, который предлагает множество преимуществ благодаря своим внутренним свойствам: 1) объектив автономный орган окружен густым базальной мембраны под названием капсулы хрусталика; 2) это аваскулярный, 3) не иннервируются и 4) бесплатно попутного стромы. Таким образом, процесс ремонта исследовали ограничена клетками, которые присуще линзы правильной. Чтобы создать эту модель, линзы удаляются из эмбриональной (E) день 15 куриного эмбриона (рис 1А). Небольшой надрез в передней капсулы хрусталика и связанных с ним линз эпителиальных клеток, через которые удаляется линза масса волокна клетокгидро-элюции, классический процедуры по удалению катаракты, что создает физиологически соответствующую ранения (Рис. 1А) Объектив эпителий, который присутствует в виде непрерывной монослой клеток по передней и экваториальных аспектов капсулы хрусталика, окружающих массу волокна клеток, вместе с его эндогенной популяции виментина богатых предшественников мезенхимальных клеток ремонта ^1, остаются в течение линзы добыча волоконно клеток (1А). После удаления массы волокна клеток, пять детали сделаны в передней поверхности капсулы хрусталика и эпителий плоский клеток стороной вверх, перед среду. Эта процедура позволяет визуализации ответа потерпевшей эпителия различных микроскопических подходов, в том числе покадровой микроскопии (видео) 1. Эти дополнительные разрезы в передней капсуле хрусталика создать звезду формы эксплантов раненого линзы с круговой раны, созданный путем удаления массы волокна клеток в CENтер эксплантов (Фиг.1В). После хирургии катаракты и уплощение тканей, ранения эпителий находится в точках звезды, которая именуется исходное вложение зона (OAZ) (рис 1а, б).

Удаление массы волокна клеток из его сайта связывания на задней капсуле хрусталика создает весьма воспроизводимый область раны на базальной мембране, в окружении раненым эпителия (Фигура 1В, С). Подвергается края линзы экваториальной эпителия, только рядом с, где были прикреплены клетки волокна, ведущий край раны. Сразу же после травмы, субпопуляции виментина богатых мезенхимальных ремонтных клеток активируется и мигрирует к краю раны эпителия ^1. Объектив эпителий, с этих мезенхимальных клеток в ремонтных их передней кромке, быстро переходит на область бесклеточной эндогенного бasement мембрана капсулы, Центральная зона миграции (CMZ), чтобы начать заживления раны. Эпителиальные клетки перемещаются объектив вместе, как лист, в CMZ во главе с лидером мезенхимальных клеток ^1, которые проходят выступы вдоль подложки и направляют процесс заживления ран (F igure 1D, Видео 1). Заживление ран прогрессирует, охватывающий значительную площадь раны (67%) на 1 день в культуре (рис 1в), и, как правило, завершена в течение 3 дней в культуре (фиг.1В, С).

Ясный физический различие может быть сделано между регионами Oaz и CMZ уже в 1-й день, который демаркированной как складки или морщины между этими двумя зонами (рис 2А, стрелка). Это явление обеспечивает руководство с помощью которого можно отделить эти области в любая точка в процессе заживления ран. Использование тонких щипцов наконечником, культуры может быть микро-рассеченные на Separели регионы Oaz и CMZ с целью анализа молекулярных различий между этими различными зонами (фиг.2В). Это мощный подход, который был использован для идентификации миграции конкретных изменений, связанных с заживлением-ремонта. Ранее было установлено, что существует увеличение Фокусное Адгезия киназы (FAK) активации в Экс Vivo раненых культур в процесс заживления раны ^5. ФСП имеет устоявшуюся роль в миграции клеток ^26-29. Возможность обогащения для Oaz против CMZ Теперь стало возможным исследовать ли это увеличение активации FAK является специфическим для конкретной миграции CMZ области. Для этого исследования, регионы Oaz и CMZ были разделены на 1 день - 3 (в течение всего процесса заживления ран) и анализировали на биохимических изменений в FAK активации (ФСП pY397). Результаты показали, что увеличение активации FAK был связан с миграцией конкретных CMZ области (фиг.2С).экс естественных условиях модель системы описывается здесь дает уникальную и бесценную возможность, в которой для расследования молекулярные программы, участвующие в координации процесса заживления ран.

Рисунок 1. Создание экс естественных условиях модели, в которой для изучения процесса заживления раны в течение родной микросреды клеток в ответ на физиологический ранения. Якобы хирургии катаракты была выполнена на E15 куриных линз. Масса линзы волокна клеток (белый) удаляется через разрез в передней капсулы Гидро-элюции. Этот процесс оставляет эпителиальных клеток (зеленые), которые остаются плотно прилегает к капсуле хрусталика и базальной мембраны клеток-оголенный (BM), на которые клетки мигрируют, чтобы исцелить раны (A). Пять разрезы, сделанные в эпителии выравниваться и создать звезду в форме экс естественных условиях культа Юр (б). Остаточные объектив эпителиальных клеток, которые заполняют точки звезды называются исходное вложение зона (Oaz) (A, B). Оголенный БМ, на которой клетки будут мигрировать называют центральной зоне миграции (CMZ) (A, B). Сразу в ответ на повреждение клетки начинают двигаться в область CMZ на клеточной оголенные BM (B). Открытая площадь раны количественно с течением времени в (С). Заживление ран обычно завершается D3 в культуре (B, C). В (В, С) Т0 обозначает время ранения, D1-3 обозначает Дни 1-3. В CMZ, две популяции клеток могут быть выделены, эпителиальные клетки хрусталика и лидер мезенхимальных клеток, которые локализуются в края раны, идущие выступы вдоль подложки (D). Эта цифра перепечатана из Menko др ^23.цель = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Разделение и Oaz CMZ регионах, чтобы определить миграционные конкретных изменений, связанных с заживлением ран. Днем 1, Oaz и CMZ области могут быть отличаются друг от друга по складке (стрелка), которые могут быть использованы в качестве ориентира, чтобы отделить эти зоны (А). В этом складки, точная наклоненная щипцы могут быть использованы для захвата края линии OAZ / смг. Культура может быть отделена вдоль этой линии, позволяющей выделение областей Oaz и CMZ (B). Микро-рассечение Oaz и CMZ ежедневно с 1-й день (D1) - 3-й день (D3) проводили для определения того, к миграции, изменения в FAK активации происходит в области заживления ран. Лизаты из каждого региона были рассмотрены Вестерн-блоттинга для любой FAK активации (pFAK Y397) или суммарном выражении ФСП (С). В то время как наблюдается небольшое изменение уровня общего FAK, повышение FAK активации была связана с миграцией конкретных CMZ области (С).

Видео 1. заживления ран в экс естественных макет модели хирургии катаракты сопровождается покадровой микроскопии время от 0 после травмы до дня 3. закрытие раны рассматривается от центра области раны.

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryonic lenses requires developing skills in the handling of small tissues that can be acquired with practice, as the embryonic lenses are only about 2mm in diameter. The cataract surgery procedure is performed under the dissecting microscope, and the critical technical steps include making a small incision in the anterior capsule, removing the fiber cell mass by hydro-elution, and making additional cuts in the anterior epithelium that make it possible to flatten the ex vivo post-cataract surgery lens tissue on the substrate to which it is pinned for study in culture. The microsurgical cataract surgery procedure produces a highly reproducible wound area, exposing a circular region of the tissue’s endogenous basement membrane onto which the injured epithelium migrates as it closes the wound. This model has been used to study mechanisms regulating wound repair of epithelia, including how the epithelial cells are able to move collectively into the wound area ³⁰ and the leader cell function of an endogenous vimentin-rich repair cell population of mesenchymal lineage at the wound edge^1,23.

This ex vivo wound model lends itself readily to live microscopic observation throughout the repair process including time-lapse imaging, and confocal image analysis following immuno-localization of proteins of interest. Making cuts in the anterior lens capsule so that the capsule with its attached injured epithelium can be flattened on the culture substrate makes such ease of observation possible. Including this critical step is essential for viewing the behavior of the response of the epithelial cells in the original zone of attachment and the movement of the injured epithelium onto the wounded area of the posterior capsule from the time of injury. A great advantage for biochemical or molecular biology analyses is that the cells that are associated with the basement membrane in the original attachment zone (OAZ) can be separated by micro-dissection from those cells migrating across the wounded area of the basement membrane (CMZ) at any time during the wound repair process.

The mock cataract surgery wound repair culture model was established using lenses from E15 chick embryos. Alternatively, wound repair cultures can be successfully prepared using this protocol from lenses removed at other stages of chick embryonic development, and from lenses isolated from both adult mice and rats. While studies to date have focused on wound repair in the chick embryo lens model, in part because of the ease in obtaining large numbers of age-matched tissue for experimental analysis, there is no reason that would prevent this protocol from being used with lenses isolated from any species. However, it is widely recognized in the literature that wound repair in the embryo often occurs more quickly and with less scarring than in the adult ^31-35. The wound repair cultures presented here are typically grown in the absence of serum to maintain conditions close to the in vivo microenvironment, suggesting that the factors that promote wound healing are provided by components of that environment including ones produced by the cells themselves. However, wound repair in this culture model also occurs effectively in defined media conditions, and can be modulated by including specific pharmaceutical inhibitors in the culture media ^5,23,30, or knocking down expression of proteins through an siRNA approach ²³. Note that inclusion of serum in the culture media induces movement of the cells from the cut edges on the outside of the flattened explant onto the tissue culture substrate, while in serum-free medium the cells remain associated with the capsule and migrate only onto the wounded area of the basement membrane of the lens capsule. The approach of adding serum to the media can be an advantage if one desires to examine the behavior of the wounded epithelium as it moves onto different substrates. To that end, there are other options that can be taken to alter the environment for wound repair that includes use of alternate tissue culture substrates on which to pin the tissue following the mock cataract surgery, such as substrates with defined rigidities as can be provided by collagen or acrylamide gels. While the ex vivo mock cataract surgery cultures can be facilely pinned to tissue culture plastic, collagen gels, or acrylamide gels, affixing the cultures to glass substrates has proven difficult. An important adaptation of this wound repair model to consider is its usefulness for re-injury studies. In this approach a scrape wound is inflicted on the healed lens epithelium after wound repair is completed, which removes an area of the lens epithelium from its underlying basement membrane capsule. This re-injury can be performed in either the original zone of attachment of the epithelium to the lens capsule or in the central migration zone where the epithelium has healed the initial wound area.

A great advantage to this wound-repair model is that the lens is an avascular tissue, not innervated without an associated stromal compartment, thus creating an ideal reductionist model of wound repair. As such, this model allows for examination of the native wound repair process under conditions in which only cells and microenvironment that are intrinsic to this epithelial tissue can modulate the repair process. In order to examine the role of cells that could be recruited following injury from neighboring vasculature or stromal compartments, it would be necessary to add such cells to the culture environment.

In previous culture wound models, the major limitation to investigating how an epithelial tissue responds to wounding is that most are limited to examining cells, often cell lines, plated on tissue culture plastic. Popular models using this approach, such as the scratch wound assay, have provided significant insight into how cells migrate to fill an area of the culture dish from where the cells have been removed. However, in these scratch wound studies the movement of cells onto the exposed area of the culture substrate occurs in the absence of many of the dynamic wound response signals that regulate wound healing in vivo. Therefore, the most important advantage of the mock cataract surgery culture model is that wound repair can be studied ex vivo within the cells’ native microenvironment and the endogenous signals originating from the underlying matrix, growth factors, cytokines and repair cell subpopulations. As this new wound repair model makes it possible to examine and manipulate the response of an epithelium to wounding in its native microenvironment, it is likely to have many applications, and holds great promise as an ideal system for revealing the molecular-mediators of wound-repair.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).