הקמת קלינית רלוונטי

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

ניתוח הקטרקט הרלוונטי מבחינה קלינית, מדומה, לשעבר vivo מודל ריפוי פצעי אפיתל המתואר כאן פותח כדי לספק כלי לחקר המנגנונים המווסתים את התיקון של רקמות האפיתל בתגובה לפציעה. תכונות עיקריות שנועדו ביצירת מודל זה כלול 1 תנאים) ובלבד שמשוכפלים מקרוב את התגובה בvivo לנפצע בהגדרת תרבות, 2) להקל בויסות אלמנטי הרגולציה של תיקון, ו- 3) יכולת תמונת תהליך התיקון, בשלמותו, בזמן אמת. האתגר, לכן, היה ליצור מודל תרבות שבה ניתן היה ללמוד, ולטפל, לתקן פצע אפיתל במייקרו-הסביבה האם של התאים. הזמינות של מודל פצע-תיקון זה פותחת אפשרויות חדשות לזיהוי רמזי איתות אנדוגני ממטריצת חלבונים, ציטוקינים וכמוקינים המסדירים את תהליך התיקון. בנוסף, המודל אידיאלי לבחינה איךn האפיתל הוא מסוגל לנוע כגיליון קולקטיבי מחדש epithelialize אזור פצע ^2,3, ולקביעת השושלת של תאי מנהיג mesenchymal בשולי הפצע שפועלים בהכוונת ההגירה הקולקטיבית של האפיתל נפצע ^4. מודל זה גם מספק פלטפורמה שעם לזהות תרופות שיכולים לקדם את ריפוי פצע יעיל ולמנוע תיקון פצע חריג ^5.

יש כבר מספר דגמי פצע-תיקון זמינים, הן בתרבות וin vivo, שספק את רוב מה שידוע על תהליך תיקון הפצע היום. במודלים של בעלי חיים פציעה, כגון קרנית ^6-12 ועור ^13-17, יש את ההזדמנות ללמוד את התגובה של הרקמה לפציעתם בהקשר של כל מתווכי התיקון שיכול להיות מעורב בתהליך, כוללים תרומות מ מערכת עצבים כלי דם ו. עם זאת, יש מגבלות למניפולציה של ההתנסותתנאים נפשיים in vivo, וזה עדיין לא ניתן לבצע מחקרי הדמיה של תגובת תיקון in vivo, רציף ולאורך זמן. לעומת זאת, רוב דגמי תרבות במבחנה פצע-תיקון, כגון פצע השריטה, ניתן להשפיע בקלות ואחריו לאורך זמן, אבל חסרים את ההקשר הסביבתי של לימוד ריפוי פצעים ברקמות in vivo. בעוד מודלים vivo לשעבר מציעים את היתרון של לימוד תהליך תיקון פגיעה ברציפות לאורך זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים בשילוב עם היכולת לווסת את הרגולטורים המולקולריים של תיקון בכל נקודה בתהליך זמן, יש כמה דגמים שמתאימים אלה פרמטרים.

כאן מתואר הליך כדי ליצור vivo לשעבר פצע אפיתל מאוד לשחזור ריפוי תרבויות שלשכפל התגובה של רקמת האפיתל לפציעה פיזיולוגית. שימוש בעדשה עובר אפרוח כמקור רקמות, vivo לשעבר MOCניתוח קטרקט k מתבצע. העדשה היא רקמה אידיאלית לשימוש עבור מחקרים אלה שכן הוא בתוך כמוסת קרום במרתף עבה עצמאי, avascular, לא innervated, וללא כל סטרומה קשורה ^18,19. במחלות של בני אדם, ניתוח קטרקט מתייחס לאובדן ראייה עקב עננות של העדשה, וכרוך בהסרת מסת תאי עדשת סיבים, הכוללת את חלק הארי של העדשה. חזון ניתוח קטרקט בעקבות משוחזר באמצעות ההחדרה של עדשה תוך-עינית מלאכותית. ניתוח הקטרקט, באמצעות הסרת תאי סיבים, גורם תגובת פציעה באפיתל העדשה הסמוכה, שמגיב בepithelialization מחדש של האזור האחורי של הקפסולה העדשה שנכבש על ידי תאי הסיבים. בניתוח קטרקט, כמו ברוב תגובות תיקון הפצע, יש לפעמים מתרחש תוצאה חריגה fibrotic לתגובת ריפוי הפצע, הקשורים בהופעתה של myofibroblasts, אשר בעדשה ידועה כאחורי Capsule העננות ^20-22. על מנת ליצור את מודל ריפוי פצע ניתוח קטרקט, ניתוח קטרקט הוא חיקה בעדשות הוסרו מן העין עובר אפרוח לייצר פגיעה פיזיולוגית. הסרת מייקר תוצאות תאי עדשת סיבים באזור פצע עגול מאוד עקבי מוקף תאי אפיתל העדשה. אוכלוסיית תא זה נשארה מחובר היטב לכמוסת הקרום במרתף עדשה והוא נפגע על ידי ההליך כירורגי. תאי האפיתל להעביר על האזור הערום של הקרום במרתף אנדוגני לרפא את הפצע, בראשות אוכלוסייה של תאי mesenchymal vimentin העשיר הידועים בתהליך תיקון תאי מנהיג ^1. בעזרת מודל זה התגובה של האפיתל לפציעה ניתן דמיין בקלות ואחריו עם זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים. התאים נגישים לשינויים בביטוי או ההפעלה של המולקולות צפויות לשחק תפקיד בתיקון פצע. תכונה חזקה של ההוא מודל הוא היכולת לבודד ולחקור שינויי הגירה ספציפית במסגרת ריפוי פצעים. היכולת להכין מספר גדול של תרבויות בגילים תואמות vivo לשעבר ריפוי פצע ללימודים היא יתרון נוסף של מודל זה. לפיכך, מערכת מודל זה מספקת הזדמנות ייחודית ללהפריד מנגנוני תיקון פצע ותרופות מבחן להשפעתם על תהליך ריפוי פצע. מודל ניתוח קטרקט המדומה vivo לשעבר צפוי להיות תחולה רחבה, מתן משאבים קריטיים לחקר מנגנונים של תיקון פציעה.

הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת תומס ג'פרסון ועם הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון.

1. התקנה והכנת עדשות לתרבות Ex Vivo פצע

1. הנח שלוש 100 מ"מ צלחות פטרי ב, זרימה למינרית סטרילי. מלא שתי צלחות פטרי באמצע הדרך עם חיץ טריס / דקסטרוז (חיץ TD, 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 0.7 מ"מ Na ₂ PO _4, 5 מ"מ D-גלוקוז, 8.25 מ"מ טריס בסיס, pH 7.4 עם HCl) ב RT , עוזב את ריק שלישי. תקשורת ותרבות טרום חמה (199 מדיה בתוספת, 1% L- גלוטמין ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) עד 37 ^{מעלות צלסיוס}
   הערה: הפצע הסטנדרטי ריפוי תקשורת והתרבות הוא סרום ללא, כפי שקורה בvivo; עם זאת, ניתן לגדל תרבויות פצע-תיקון בהצלחה בתנאים שהוגדרו בתקשורת הכוללים סרום או גורמים אחרים.
2. הסר ד העוברי הפורהאיי 15 ביצת אפרוח ליבורנו לבנה מחממה (מוחזק ב37.7 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה)
3. מקום שנבחרה ביצה בזרימה למינרית ומחוץ נקי של פגז עם אתנול 70% מבקבוק לשטוף. לנהל את כל ההליכים המפורטים להלן בתנאים אספטיים בזרימה למינרית, תוך שימוש בפתרונות וכלים סטריליים.
4. לפצח תוכן ביצה ומקום לצלחת פטרי 100 מ"מ הריקים. לערוף עובר באמצעות מלקחיים סטנדרטיים ומספריים עדינים. מניחים את ראש עובר אפרוח בצלחת פטרי המכילה מאגר TD ולהשליך כיאות את השארית של העובר. לחלופין לשמור על הראשים עוברים אפרוח במאגר TD לתקופה קצרה של זמן, לא יותר מ -15 דקות.
5. מניחים את ראש עובר אפרוח על מכסה צלחת פטרי. בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את העדשה יחד עם ההומור שלה מצורף זגוגית מהעין ברצף הבא. לצבוט את החלק האחורי של העין עם המלקחיים כדי ליצור פתח קטן בחלק האחורי של העין.
6. לאחר מכן, לתפוס את הומור זגוגי wמלקחיים ה- i ובעדינות למשוך על הזגוגית בתנועת גלגול, הזגוגית עם העדשה מצורפת, וחילצה מן העין. עדשת מקום / זגוגית בצלחת פטרי שנותרה המכילה מאגר TD. לאפשר העדשות להישאר במאגר TD לא יותר מ -30 דקות.
7. הזז את העדשה למכסה צלחת פטרי חדש תחת מיקרוסקופ לנתח. בשלב זה לבצע את כל הפעולות תחת מיקרוסקופ לנתח. עם מלקחיים דיוק גבוהים לצחצח בזהירות כל גוף הריסים (תאי פיגמנט) שחלצו עם העדשה באמצעות קצה המלקחיים, לוקח זהירות שלא לפגוע ברקמת העדשה.
   הערה: הסרת גוף הריסים מבטיחה כי סוגי תאים שאינם אנדוגני לעדשה אינם כלולים בתרבות תיקון פצע.
8. הפרד את העדשה מהזגוגית עם מלקחיים דיוק גבוהים על ידי צובט את הגוף הזגוגי מהקשר שלה עם הקפסולה העדשה האחורית.
9. באמצעות דיוק גבוה מלקחיים להעביר את העדשה לירידה קטנהשל חיץ TD (כ -200 μl) בצלחת תרבית רקמת 35mm.

2. ניתוח קטרקט מוק הבמה

1. לכוון את העדשה בירידה של חיץ TD בצלחת 35 מ"מ עם ההיבט הקדמי של העדשה פונה כלפי מעלה.
   הערה: הקדמי של העדשה מזוהה בקלות על ידי הנוכחות של טבעת צפופה ברקמה שמציינת את הגבול בין קדמי ואזור קו המשווה של האפיתל העדשה. לעומת זאת, יש העדר סימונים על האחורי של הקפסולה העדשה שתאי עדשת הסיבים מחוברים.
2. שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים לעשות חתך קטן (כ 850μm) במרכז הקפסולה הקדמית העדשה, הקרום במרתף העבה המקיף את רקמת העדשה, ואפיתל העדשה קדמית הקשורים אליו, תוך כדי אחיזה ברקמה עם מלקחיים בכל יד ו בעדינות מושך בכיוונים מנוגדים.
3. הסר את מסת תאי סיבים, מה שהופך את חלק הארי של רקמת עדשה, dislodגינג מנספחיו לאפיתל העדשה ומקיפה כמוסת עדשה על ידי הידרו-elution (גישה המשמשת בניתוחי קטרקט קלאסיים, דגם באיור 1 א).
4. ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם קצה מחט 27.5 G עם 300 μl של חיץ TD. הכנס את קצה המחט לתוך החתך שנעשה בכמוסת העדשה הקדמית, ובערך באמצע הדרך לעדשה.
5. בעדינות לדכא את מזרק הזרקת חיץ TD למסת תאי סיבי עדשה. להזריק בין 50 ל 200 TD μl, ולא יותר מ -300 μl. שים לב למסת תאי סיבי התרופפות עצמו מכמוסת האפיתל ועדשה.
6. בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את מסת תאי סיבים משוחררת מהעדשה דרך אתר החתך הקדמי.
   הערה: הליך זה יוצא הקפסולה העדשה האחורית קרום במרתף כדי שתאי הסיבים היו קשורים ערום של תאים, ואפיתל עדשה נפצע רק בסמוך לאתר זה.

3. ומתכונניםז העדשות הפצועים לאקס תרבות Vivo

1. לשטח את שקית קופסית העדשה, הנובעת מניתוח הקטרקט שתואר לעיל על צלחת התרבות, צד עד תא, על ידי ביצוע חמישה חתכים בהיבט הקדמי של תיק קופסית.
2. חותך בניצב לאתר החתך המקורי ועד לקו המשווה של הכדור. שטחו את חמישה "הדשים" התוצאה של כמוסת עדשה עם אפיתל המצורף בצד כמוסת צלחת התרבות למטה, בצד עד תא. שים לב לעדשה נפצעה vivo לשעבר עכשיו צריך לקחת על כוכב או צורה דמוית פרחים (ראה איור 1).
3. כדי להבטיח את הקפסולה לצלחת, עיתונות ברכות למטה עם המלקחיים בכל נקודה של הכוכב. זה יהפוך את כניסה קטנה בחמשת הטיפים מחוץ ביותר של explant ולגרום לקובץ מצורף מתמשך לצלחת.
   הערה: ניתן לפגוע בכמוסה במהלך הליך זה ולכן חשוב להבטיח את הקפסולה לצלחת הקרובה לטיפים של פלורידהנ.ב. ככל האפשר, כמו גם להפוך את הכמות המינימאלית של נקודות הבטחת ככל האפשר (בדרך כלל שתיים, מקסימום שלושה לדש).
4. הסר את חיץ TD מצלחת 35mm ולהחליף אותו עם 1.5 מיליליטר של תקשורת מחוממת מראש. מכסה את צלחת 35mm עם המכסה שלה ומקום בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2).

4. הפרדה של מרכז הגירת האזור (CMZ), שבו מחדש epithelialization של האזור הפצוע בקפסולה אחורית מתרחש, מהקובץ המצורף המקורי האזור (OAZ) של תאי אפיתל העדשה, לניתוח כמותי.

הערה: התאים מתחילים לנוע לאזור CMZ מייד בתגובה לפציעה. ביום אחד בתרבות מספיק תאים נודדים ברחבי CMZ לניתוח מולקולרי וביוכימיים, הבאים הפרדת CMZ וOAZ על ידי מיקרו לנתיחה ^23. פרוטוקול זה כרוך ההסרה של כנף אחת (OAZ) בכל פעם מהאזור הפצוע של הקפסולה.

1. שים לב Demarקטיון, נראה בבירור מתחת למיקרוסקופ לנתח, בין OAZ וCMZ (ראה איור 2 א). שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים, לתפוס בשני המלקחיים בקצה קו OAZ / CMZ, אחד רק בסמוך לאחר, משני צדי הקו (ראה איור 2 א, ב, חץ).
2. שימוש ביד אחת / אחד מלקחיים בצד CMZ להמשיך להחזיק בתרבות הפצועה, בעוד עם היד / מלקחיים אחרים, משוך בעדינות את OAZ לאורך קו OAZ / CMZ. CMZ קלות מפריד מOAZ לאורך הקו הזה. תמשיך לאורך הקו הזה מסביב לכל התרבות עד שני האזורים מופרדים לחלוטין.
3. ללמוד את השברים המופרדים OAZ וCMZ לניתוח מולקולרי כמו ²⁴ או ביוכימיים ניתוח RNA-Seq כגון כתם מערבי או שיתוף immunoprecipitation ^23,25.

Ex Vivo דגם נוצר כדי ללמוד את תהליך ריפוי הפצע במייקרו-הסביבה האם של התאים

לחקור מנגנונים מעורבים בויסות ריפוי פצע של האפיתל במייקרו-הסביבה המקומית של התאים, מודל ניתוח קטרקט רלוונטי קליני vivo לשעבר מדומה נוצר. מודל זה נוצר מרקמת עדשה המציעה יתרונות רבים בשל המאפיינים הפנימיים שלה: 1) העדשה היא איבר עצמאי מוקף קרום במרתף עבה נקרא הקפסולה העדשה; 2) זה avascular, 3) לא innervated ו -4) ללא סטרומה קשורה. לכן, תהליך התיקון בדק מוגבל לתאים שהם מולדים לעדשה הנכונה. כדי ליצור מודל זה, עדשות יוסרו מעוברי (E) יום 15 עוברים אפרוח (איור 1 א). חתך קטן נעשה בכמוסה הקדמית העדשה ותאי אפיתל העדשה הקשורים אליו שדרכו מסת תאי סיבי העדשה מוסרתעל ידי הידרו-elution, הליך קטרקט קלאסי שיוצר פציעה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית (איור 1 א). אפיתל העדשה, אשר שוהה כmonolayer רציף של תאים לאורך קדמי והיבטים משווניים של הקפסולה העדשה המקיפים את מסת תאי סיבים, יחד עם אוכלוסיית אנדוגני של אבות תא תיקון mesenchymal vimentin עשיר ^1, להישאר בעדשה ב מיצוי של תאי סיבים (איור 1 א). בעקבות הסרת מסת תאי סיבים, חמישה חתכים נעשים בהיבט הקדמי של הקפסולה העדשה והאפיתל שטוח תא בצד למעלה, מול בינוני. הליך זה מאפשר הדמיה של התגובה של האפיתל נפגע על ידי גישות מיקרוסקופיות שונות, כוללים מיקרוסקופיה הזמן לשגות (וידאו 1). קיצוצים נוספים אלה בכמוסת העדשה הקדמית ליצור explant כוכבים צורת העדשה הפצועה עם הפצע העגול נוצר על ידי הסרת מסת תאי סיבים בCENter של explant (איור 1). ניתוח והשטחה של הרקמות לאחר קטרקט, האפיתל נפצע ממוקם בנקודות של הכוכב, שנקרא הקובץ המצורף המקורי האזור (OAZ) (איור 1 א ', ב').

הסרת מסת תאי סיבים מהאתר המצורף בכמוסת העדשה האחורית יוצרת אזור מאוד לשחזור פצע על הקרום במרתף, מוקף באפיתל נפצע (איור 1, ג). הקצה החשוף של האפיתל המשווני העדשה, רק בסמוך למקום שבי תאי הסיבים צורפו, הוא חוד החנית של הפצע. מייד לאחר פציעה, תת-אוכלוסייה של תאי תיקון mesenchymal vimentin עשיר מופעלת ונודדת לשולי הפצע של האפיתל ^1. אפיתל העדשה, עם תאי תיקון mesenchymal אלה בקצה המוביל שלהם, במהירות נע על אזור התא ללא של ב אנדוגניכמוסת קרום asement, מרכז הגירת האזור (CMZ), להתחיל ריפוי הפצע. תאי אפיתל העדשה לעבור באופן קולקטיבי, כמו סדין, לCMZ בראשות מנהיג תאי mesenchymal ^1, המרחיבים בליטות לאורך המצע ולכוון את תהליך ריפוי הפצע (F igure 1D, 1 וידאו). ריפוי פצעים מתקדם, המשתרע על שטח משמעותי של הפצע (67%) ביום 1 בתרבות (איור 1 ג), ומסתיימת בדרך כלל בתוך 3 ימים בתרבות (איור 1, ג).

הבחנה פיזית ברורה יכולה להתבצע בין אזורי OAZ וCMZ כבר ביום 1, אשר סומן כקמט או קמט בין שני אזורים אלה (איור 2 א, חץ). תופעה זו מספקת קו מנחה שעל ידי להפריד אזורים אלה ב כל נקודה בתהליך ריפוי פצע. בעזרת מלקחיים קנס היטה, התרבויות יכולות להיות מיקרו-גזור לseparאכלתי אזורי OAZ וCMZ כדי לנתח הבדלים מולקולריים בין האזורים אלה שונים (איור 2). זוהי גישה רבת עוצמה שנעשתה שימוש כדי לזהות שינויי הגירה ספציפית הקשורים לפצע-תיקון. בעבר, נמצא כי קיימת עלייה במיקוד ההדבקה קינאז הפעלה (FAK) בתרבויות נפצעו vivo לשעבר במהלך תהליך ריפוי הפצע ^5. יש FAK תפקיד מבוסס היטב בתא ההגירה ^26-29. היכולת להעשיר לOAZ לעומת CMZ איפשר עכשיו לבחון האם עלייה זו בהפעלת FAK היא ספציפית לאזור CMZ ההגירה הספציפית. במחקר זה, אזורי OAZ וCMZ הופרדו ביום 1 - 3 (לאורך כל תהליך ריפוי הפצע) ונותחו לשינויים ביוכימיים בהפעלת FAK (FAK pY397). התוצאות הראו כי העלייה בהפעלת FAK הייתה קשורה באזור CMZ הגירה הספציפית (איור 2 ג).vivo לשעבר מערכת מודל שתוארה כאן מספקת הזדמנות ייחודית ורבה ערך אשר בלחקור את התוכניות מולקולריות מעורבות בתיאום תהליך תיקון פצע.

איור 1. יצירת מודל vivo לשעבר שבו ללמוד את תהליך ריפוי הפצע בתוך מייקרו-הסביבה המקומית של התאים בתגובה לפציעתם פיזיולוגית. ניתוח קטרקט מוק בוצע על עדשות חומוס E15. מסת תאי עדשת סיבים (הלבנה) מוסרת באמצעות חתך בכמוסה הקדמית על ידי הידרו-elution. תהליך זה משאיר מאחורי תאי אפיתל (ירוקה) שיישארו בחוזקה חסיד לכמוסת העדשה וקרום תא ערומה מרתף (BM) על שתאים יעברו ללרפא את הפצע (). חמישה חתכים נעשים לאפיתל לשטח וליצור כוכב לכת דמוית vivo לשעבר יור (B). תאי אפיתל עדשת השייר שממלאים את הנקודות של הכוכב מכונים את הקובץ המצורף המקורי האזור (OAZ) (A, B). BM הערום על שתאים יעברו נקראים מרכז הגירת האזור (CMZ) (A, B). מייד בתגובה לפציעה, תאים מתחילים לנוע לאזור CMZ על BM-ערום התא (B). אזור הפצע הפתוח הוא לכמת לאורך זמן ב( C). ריפוי פצעים הושלם בדרך כלל על ידי D3 בתרבות (B, C). ב( B, C) ​​T0 מציין זמן של פציעה, D1-3 מציין הימים 1-3. בתוך CMZ, שתי אוכלוסיות של תאים יכולות להיות מכובדות, תאי אפיתל עדשה ותאי מנהיג mesenchymal שלמקם את שולי פצע, הארכת בליטות לאורך המצע (ד '). נתון זה הודפס מMenko et al ^23.target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. הפרדה של אזורי OAZ וCMZ לזהות שינויי הגירה ספציפית הקשורים לריפוי פצעים. ביום 1, ניתן להבחין אזורי OAZ וCMZ זה מזה בקמט (חץ), שיכול לשמש כמדריך להפריד אזורים אלה (). בקפל זה, ניתן להשתמש במלקחיים קנס היטה לאחיזה בקצה קו OAZ / CMZ. התרבות יכולה להיות מופרדת לאורך קו זה מאפשר בידוד של אזורי OAZ וCMZ (B). מיקרו-נתיחה של OAZ וCMZ יומי, מיום 1 (D1) - יום 3 (D3) בוצע על מנת לקבוע אם שינויי הגירה ספציפית בהפעלת FAK להתרחש באזור של תיקון פצע. Lysates מכל אזור נבדק על ידי ניתוח המערבי כתם לאו הפעלת FAK (pFAK Y397) או סך הכל ביטוי FAK (C). בעוד שינוי קטן ברמות FAK הכוללת נצפה, עלייה בהפעלת FAK הייתה קשורה באזור ההגירה הספציפית CMZ (C).

וידאו 1. ריפוי פצעים במודל ניתוח קטרקט המדומה לשעבר vivo ואחריו מיקרוסקופיה זמן לשגות מעת 0 לאחר פציעה ועד ליום 3. סגירת פצעים נתפס ממרכז אזור הפצע.

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryonic lenses requires developing skills in the handling of small tissues that can be acquired with practice, as the embryonic lenses are only about 2mm in diameter. The cataract surgery procedure is performed under the dissecting microscope, and the critical technical steps include making a small incision in the anterior capsule, removing the fiber cell mass by hydro-elution, and making additional cuts in the anterior epithelium that make it possible to flatten the ex vivo post-cataract surgery lens tissue on the substrate to which it is pinned for study in culture. The microsurgical cataract surgery procedure produces a highly reproducible wound area, exposing a circular region of the tissue’s endogenous basement membrane onto which the injured epithelium migrates as it closes the wound. This model has been used to study mechanisms regulating wound repair of epithelia, including how the epithelial cells are able to move collectively into the wound area ³⁰ and the leader cell function of an endogenous vimentin-rich repair cell population of mesenchymal lineage at the wound edge^1,23.

This ex vivo wound model lends itself readily to live microscopic observation throughout the repair process including time-lapse imaging, and confocal image analysis following immuno-localization of proteins of interest. Making cuts in the anterior lens capsule so that the capsule with its attached injured epithelium can be flattened on the culture substrate makes such ease of observation possible. Including this critical step is essential for viewing the behavior of the response of the epithelial cells in the original zone of attachment and the movement of the injured epithelium onto the wounded area of the posterior capsule from the time of injury. A great advantage for biochemical or molecular biology analyses is that the cells that are associated with the basement membrane in the original attachment zone (OAZ) can be separated by micro-dissection from those cells migrating across the wounded area of the basement membrane (CMZ) at any time during the wound repair process.

The mock cataract surgery wound repair culture model was established using lenses from E15 chick embryos. Alternatively, wound repair cultures can be successfully prepared using this protocol from lenses removed at other stages of chick embryonic development, and from lenses isolated from both adult mice and rats. While studies to date have focused on wound repair in the chick embryo lens model, in part because of the ease in obtaining large numbers of age-matched tissue for experimental analysis, there is no reason that would prevent this protocol from being used with lenses isolated from any species. However, it is widely recognized in the literature that wound repair in the embryo often occurs more quickly and with less scarring than in the adult ^31-35. The wound repair cultures presented here are typically grown in the absence of serum to maintain conditions close to the in vivo microenvironment, suggesting that the factors that promote wound healing are provided by components of that environment including ones produced by the cells themselves. However, wound repair in this culture model also occurs effectively in defined media conditions, and can be modulated by including specific pharmaceutical inhibitors in the culture media ^5,23,30, or knocking down expression of proteins through an siRNA approach ²³. Note that inclusion of serum in the culture media induces movement of the cells from the cut edges on the outside of the flattened explant onto the tissue culture substrate, while in serum-free medium the cells remain associated with the capsule and migrate only onto the wounded area of the basement membrane of the lens capsule. The approach of adding serum to the media can be an advantage if one desires to examine the behavior of the wounded epithelium as it moves onto different substrates. To that end, there are other options that can be taken to alter the environment for wound repair that includes use of alternate tissue culture substrates on which to pin the tissue following the mock cataract surgery, such as substrates with defined rigidities as can be provided by collagen or acrylamide gels. While the ex vivo mock cataract surgery cultures can be facilely pinned to tissue culture plastic, collagen gels, or acrylamide gels, affixing the cultures to glass substrates has proven difficult. An important adaptation of this wound repair model to consider is its usefulness for re-injury studies. In this approach a scrape wound is inflicted on the healed lens epithelium after wound repair is completed, which removes an area of the lens epithelium from its underlying basement membrane capsule. This re-injury can be performed in either the original zone of attachment of the epithelium to the lens capsule or in the central migration zone where the epithelium has healed the initial wound area.

A great advantage to this wound-repair model is that the lens is an avascular tissue, not innervated without an associated stromal compartment, thus creating an ideal reductionist model of wound repair. As such, this model allows for examination of the native wound repair process under conditions in which only cells and microenvironment that are intrinsic to this epithelial tissue can modulate the repair process. In order to examine the role of cells that could be recruited following injury from neighboring vasculature or stromal compartments, it would be necessary to add such cells to the culture environment.

In previous culture wound models, the major limitation to investigating how an epithelial tissue responds to wounding is that most are limited to examining cells, often cell lines, plated on tissue culture plastic. Popular models using this approach, such as the scratch wound assay, have provided significant insight into how cells migrate to fill an area of the culture dish from where the cells have been removed. However, in these scratch wound studies the movement of cells onto the exposed area of the culture substrate occurs in the absence of many of the dynamic wound response signals that regulate wound healing in vivo. Therefore, the most important advantage of the mock cataract surgery culture model is that wound repair can be studied ex vivo within the cells’ native microenvironment and the endogenous signals originating from the underlying matrix, growth factors, cytokines and repair cell subpopulations. As this new wound repair model makes it possible to examine and manipulate the response of an epithelium to wounding in its native microenvironment, it is likely to have many applications, and holds great promise as an ideal system for revealing the molecular-mediators of wound-repair.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).