إنشاء ذات الصلة سريريا

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

و، جراحة الساد وهمية ذات الصلة سريريا، وقد وضعت خارج الحي الظهارية نموذج التئام الجروح الموصوفة هنا إلى توفير أداة للتحقيق في الآليات التي تنظم إصلاح الأنسجة الظهارية في استجابة لإصابة. السمات الرئيسية التي كانت تهدف لفي خلق هذا النموذج وشملت 1) توفير الظروف التي تتكرر بشكل وثيق الاستجابة في الجسم الحي لاصابة في إعداد ثقافة، 2) سهولة تحوير العناصر التنظيمية للإصلاح، و3) القدرة على صورة عملية الإصلاح، في مجملها، في الوقت الحقيقي. التحدي، لذلك، كان لخلق نموذج الثقافة التي كان من الممكن للدراسة، والتلاعب، وإصلاح الجرح الظهارية في المكروية في الخلايا الأم. توافر هذا النموذج الجرح إصلاح يفتح إمكانيات جديدة لتحديد العظة الإشارات الداخلية من مصفوفة البروتينات، السيتوكينات وكيموكينات التي تنظم عملية الإصلاح. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نموذج مثالي لدراسة كيف يمكن لن ظهارة قادرة على التحرك في ورقة جماعية لإعادة يغطي بالنسيج الظهاري-منطقة الجرح ^2،3، وتحديد نسب الخلايا زعيم الوسيطة على حافة الجرح التي تعمل في توجيه الهجرة الجماعية للظهارة أصيب ^4. يوفر هذا النموذج أيضا منبرا التي لتحديد العلاجات التي يمكن أن تعزز فعالية التئام الجروح ومنع ترميم الجروح الشاذة ^5.

وهناك بالفعل عدد من النماذج المتاحة الجرح إصلاح، سواء في الثقافة والحية، التي وفرت معظم ما هو معروف عن عملية ترميم الجروح اليوم. في نماذج إصابة الحيوانية، مثل القرنية ^{6-12 و13-17} الجلد، وهناك فرصة لدراسة استجابة الأنسجة لاصابة في سياق جميع الوسطاء الإصلاح التي يمكن أن تشارك في هذه العملية، بما في ذلك المساهمات من الأوعية الدموية والجهاز العصبي. ومع ذلك، هناك قيود على التلاعب من experiالظروف النفسية في الجسم الحي، وأنه ليس من الممكن بعد إجراء دراسات التصوير الاستجابة إصلاح في الجسم الحي، بشكل مستمر مع مرور الوقت. في المقابل، فإن معظم نماذج الثقافة في المختبر الجرح إصلاح، مثل الجرح الصفر، ويمكن التلاعب بها بسهولة، وتابعت مع مرور الوقت ولكنها تفتقر إلى الإطار البيئي دراسة التئام الجروح في الأنسجة في الجسم الحي. في حين أن النماذج خارج الجسم الحي توفر ميزة دراسة عملية إصلاح الضرر بشكل مستمر مع مرور الزمن في سياق المكروية في الخلايا إلى جانب القدرة على تعديل المنظمين الجزيئية للإصلاح في أي نقطة زمنية في هذه العملية، وهناك عدد قليل من النماذج التي تناسب هذه المعلمات.

هنا يتم وصف هذا الإجراء لتوليد تكرار للغاية خارج الحي الظهارية التئام الجروح الثقافات التي تتكاثر ردا على الأنسجة الظهارية لوجرح الفسيولوجية. باستخدام عدسة الفرخ الجنين كمصدر الأنسجة، وبحكم فيفو وزارة التجارةيتم إجراء جراحة الساد ك. العدسة هي الأنسجة مثالية لاستخدامها في هذه الدراسات أنه على مسافة سميكة كبسولة الغشاء القاعدي مكتفية ذاتيا، اوعائي، وليس معصب، وخالية من أي سدى المرتبطة ^18،19. في الأمراض التي تصيب البشر، وتتناول جراحة الساد فقدان البصر بسبب عتامة العدسة، وينطوي على إزالة كتلة الخلية الألياف العدسة، التي تضم الجزء الأكبر من العدسة. يتم استعادة التالية الساد رؤية عملية جراحية خلال إدخال عدسة داخل العين الاصطناعية. إجراء جراحة الساد، من خلال إزالة الخلايا الألياف، يحرض استجابة إصابة في الظهارة عدسة المجاورة، التي تستجيب عن طريق إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري للمنطقة الخلفية للكبسولة العدسة التي كانت محتلة من قبل خلايا الألياف. في جراحة الساد، كما هو الحال في معظم الردود ترميم الجروح، ويحدث هناك في بعض الأحيان نتيجة تليفي الشاذة للاستجابة التئام الجروح، ويرتبط مع ظهور myofibroblasts، والتي في عدسة يعرف الخلفي Capsuلو عتامة ^20-22. لتوليد جراحة الساد نموذج التئام الجروح، وتحاكي إجراء جراحة الساد في العدسات إزالتها من عين الفرخ الجنين لإنتاج إصابة الفسيولوجية. إزالة المجهرية من ألياف العدسة خلايا النتائج في منطقة الجرح دائري متسقة للغاية تحيط بها الخلايا الظهارية عدسة. لا تزال تعلق هذه الفئة من السكان خلية بحزم عدسة الطابق السفلي كبسولة غشاء وأصيبوا من جراء العملية الجراحية. الخلايا الظهارية تهاجر إلى منطقة الجرداء من الغشاء القاعدي الذاتية للشفاء الجرح، بقيادة عدد سكانها خلايا vimentin الغنية الوسيطة المعروفة في عملية الإصلاح كخلايا الزعيم ^1. مع هذا النموذج استجابة لظهارة للإصابة يمكن تصور بسهولة وجاءت مع الوقت في سياق المكروية الخلايا. الخلايا يمكن الوصول إليها بسهولة لإدخال تعديلات على التعبير أو تفعيل جزيئات المتوقع أن تلعب دورا في ترميم الجروح. وهناك ميزة قوية من الهو النموذج هو القدرة على عزل ودراسة التغيرات الهجرة محددة في إطار التئام الجروح. القدرة على إعداد عدد كبير من الذين تتراوح أعمارهم بين خارج الجسم الحي التئام الجروح الثقافات مطابقة للدراسات هو ميزة أخرى لهذا النموذج. وبالتالي، فإن هذا النظام النموذجي فرصة فريدة لندف بصرف النظر آليات إصلاح الجرح والعلاجات اختبار تأثيرها على عملية التئام الجروح. ومن المتوقع أن يكون تطبيق واسع نموذج جراحة الساد وهمية خارج الحي، وتوفير الموارد الحرجة لدراسة آليات إصلاح الضرر.

بروتوكول التالية يتوافق مع المبادئ التوجيهية المؤسسية رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام جامعة توماس جيفرسون ومع بيان ARVO لاستخدام الحيوانات في البحوث الرؤية.

1. إعداد والتحضير للعدسات للثقافة فيفو السابقين الجرح

1. وضع ثلاث 100 أطباق بتري ملم في العقيمة، غطاء تدفق الصفحي. ملء اثنين من أطباق بتري في منتصف الطريق مع العازلة تريس / سكر العنب (العازلة TD، 140 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 0.7 ملي نا ₂ PO _4، 5 ملي مد الجلوكوز، 8.25 ملي تريس قاعدة، ودرجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك) في RT ، وترك فارغا الثالث. وسائل الإعلام ثقافة ما قبل الدافئ (وسائل الإعلام تستكمل مع 199، 1٪ L-الجلوتامين و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين) إلى 37 ^{درجة مئوية.}
   ملاحظة: الجرح معيار الشفاء سائل الإعلام والثقافة وخالية من الدم، كما يحدث في الجسم الحي. ومع ذلك، يمكن أن تنمو الثقافات الجرح إصلاح بنجاح في ظروف محددة وسائل الاعلام التي تشمل المصل أو عوامل أخرى.
2. إزالة د الجنينية خصبةعبد المنعم يوسف 15 أبيض ليفورنو البيض فرخ من الحاضنة (التي عقدت في 37.7 درجة مئوية مع هزاز لطيف)
3. وضع البيض المحدد في غطاء تدفق الصفحي وخارج نظيف من قذيفة مع الايثانول 70٪ من زجاجة غسل. إجراء كافة الإجراءات أدناه تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي، وذلك باستخدام الحلول والأدوات المعقمة.
4. الكراك البيض ومكان المحتويات في فارغة 100 مم طبق بتري. قطع رأس الجنين باستخدام ملقط القياسية ومقص غرامة. وضع رئيس أجنة الدجاج في طبق بتري تحتوي العازلة TD والتخلص السليم من ما تبقى من الجنين. اختياريا حفاظ على رؤساء الفرخ الجنين في المخزن TD لفترة قصيرة من الزمن، لم يعد من 15 دقيقة.
5. وضع رئيس الفرخ الجنين على غطاء طبق بتري. باستخدام ملقط عالية الدقة، وإزالة العدسة المرفقة مع النكتة لها الزجاجي من العين في التسلسل التالي. قرصة الجزء الخلفي من العين مع ملقط لإنشاء فتحة صغيرة في الجزء الخلفي من العين.
6. ثم، فهم النكتة الزجاجي ثإيث ملقط والساحبة بلطف على الجسم الزجاجي مع تحريك المتداول، سيتم طردهم الزجاجي مع عدسة المرفقة من العين. مكان عدسة / زجاجي في ما تبقى من طبق بتري تحتوي العازلة TD. السماح للعدسات أن تبقى في المخزن TD مدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
7. تحريك العدسة لجديد غطاء طبق بتري تحت المجهر تشريح. من هذه النقطة على تنفيذ جميع الخطوات تحت المجهر تشريح. مع ملقط عالية الدقة فرشاة بعناية بعيدا أي الجسم الهدبي (الخلايا الصباغية) التي تم فكها مع العدسة باستخدام حافة ملقط، مع الحذر على عدم الإضرار الأنسجة العدسة.
   ملاحظة: إزالة الجسم الهدبي تضمن أنواع الخلايا التي ليست الذاتية للعدسة ليست مدرجة في الثقافة إصلاح الجرح.
8. فصل العدسة من النكتة الزجاجي مع ملقط عالية الدقة عن طريق معسر قبالة الجسم الزجاجي من ارتباطه مع كبسولة عدسة الخلفي.
9. باستخدام عالية الدقة ملقط نقل العدسة إلى قطرة صغيرةمن TD العازلة (حوالي 200 ميكرولتر) في صحن زراعة الأنسجة 35MM.

2. إجراء جراحة الساد موك

1. توجيه عدسة في قطرة من العازلة TD في 35 ملم الطبق مع الجانب الأمامي للعدسة مواجهة.
   ملاحظة: يتم تحديد الأمامي للعدسة بسهولة من خلال وجود حلقة كثيفة في الأنسجة التي تحيط الحدود بين الأمامية والمنطقة الاستوائية من ظهارة العدسة. في المقابل، هناك غياب علامات على الخلفي من كبسولة العدسة التي ترد خلايا ألياف العدسة.
2. باستخدام اثنين من ملقط عالية الدقة تجعل شق صغير (حوالي 850μm) في وسط الكبسولة الأمامية عدسة، والغشاء القاعدي الكثيف الذي يحيط نسيج العدسة، وما يرتبط بها من ظهارة العدسة الأمامي لها، من خلال استيعاب الأنسجة مع واحد ملقط في كل جهة، و التجاذبات بلطف في اتجاهات متعارضة.
3. إزالة كتلة الخلية الألياف، والتي تشكل الجزء الأكبر من النسيج العدسة، dislodجينج أنه من مرفقاتها إلى ظهارة العدسة والمحيطة عدسة الكبسولة التي كتبها المائية شطف (النهج المستخدمة في جراحة الساد الكلاسيكية، على غرار في الشكل 1A).
4. ملء حقنة 1 مل مع طرف إبرة 27.5 G مع 300 ميكرولتر من العازلة TD. إدراج رأس الإبرة في شق المحرز في عدسة الكبسولة الأمامية، وحوالي منتصف الطريق إلى العدسة.
5. خفض بلطف حقنة حقن عازلة TD في كتلة الخلايا الألياف العدسة. ضخ ما بين 50 و 200 TD ميكرولتر، وأبدا أكثر من 300 ميكرولتر. مراقبة الكتلة الخلوية الألياف تخفيف نفسها من الظهارة وعدسة الكبسولة.
6. باستخدام ملقط عالية الدقة، وإزالة خففت كتلة الخلايا الألياف من العدسة من خلال موقع شق الأمامي.
   ملاحظة: يترك هذا الإجراء العدسة الخلفي كبسولة الغشاء القاعدي الذي خلايا الألياف قد تعلق المعراة من الخلايا، وظهارة العدسة بجروح فقط المجاورة لهذا الموقع.

3. Preparinز العدسة الجرحى لفيفو السابقين الثقافة

1. تسطيح حقيبة المحفظة العدسة التي تنتج من جراحة الساد المذكورة أعلاه على طبق ثقافة، جنبا خلية يصل، بجعل خمسة تخفيضات في الجانب الأمامي من الحقيبة المحفظة.
2. قطع عمودي على موقع شق الأصلي وصولا إلى خط الاستواء من العدسة. تسطيح الناتجة خمسة "اللوحات" من عدسة كبسولة مع ظهارة تعلق على الجانب ثقافة طبق كبسولة أسفل، الجانب الخلية يصل. لاحظ عدسة الجرحى خارج الحي الآن يجب أن تأخذ على نجمة أو شكل flowerlike (انظر الشكل 1B).
3. لتأمين الكبسولة إلى الطبق، اضغط برفق إلى أسفل مع ملقط في كل نقطة من النجم. وهذا سيجعل المسافة البادئة صغيرة في النصائح الخمس الأكثر الخارجية للالنباتى ويؤدي إلى التعلق المستدام إلى الطبق.
   ملاحظة: من الممكن أن يدمر الكبسولة أثناء هذا الإجراء، ولذا فمن المهم تأمين الكبسولة إلى الطبق أقرب إلى نصائح من فلوريداملاحظة وقت ممكن، وكذلك لجعل أقل قدر من النقاط تأمين ممكن (عادة اثنين، بحد أقصى ثلاثة في رفرف).
4. إزالة المنطقة العازلة TD من الطبق 35MM واستبدالها 1.5 مل من وسائل الاعلام قبل تحسنت. تغطية صحن 35MM مع غطاء ووضعه في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO _2).

4. فصل المنطقة الهجرة الوسطى (CMZ)، حيث إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري في المنطقة الجرحى من الخلفي كبسولة يحدث، من مرفق الأصل المنطقة (OAZ) من الخلايا الظهارية عدسة، على التحليل الكمي.

ملاحظة: هذه الخلايا تبدأ في التحرك إلى المنطقة CMZ على الفور ردا على إصابة. قبل يوم واحد في الثقافة ما يكفي من الخلايا يهاجرون عبر CMZ للتحليل الجزيئية والكيمياء الحيوية، وبعد الانفصال من CMZ وOAZ كتبها micro-تشريح ^23. هذا البروتوكول ينطوي على إزالة واحد رفرف (OAZ) في وقت من منطقة الجرحى من الكبسولة.

1. مراقبة وديمارالموجبة، واضحة للعيان تحت المجهر تشريح، بين OAZ وCMZ (انظر الشكل 2A). باستخدام اثنين من ملقط عالية الدقة، فهم مع كل من ملقط على حافة خط OAZ / CMZ، واحد فقط المتاخمة للالبعض، على جانبي الخط (انظر الشكل 2A، B، السهم).
2. باستخدام يد واحدة / واحد ملقط على الجانب CMZ تواصل التمسك ثقافة الجرحى، في حين باليد الأخرى / ملقط، وسحب بلطف OAZ على طول الخط OAZ / CMZ. وCMZ يفصل بسهولة من OAZ على طول هذا الخط. مواصلة السير على هذا الخط في جميع أنحاء ثقافة بأكملها حتى يتم فصل المنطقتين تماما.
3. دراسة فصل OAZ وCMZ الكسور للتحليل الجزيئي مثل ²⁴ أو البيوكيميائية تحليل الحمض النووي الريبي يليها مثل لطخة غربية أو زملاء مناعي ^23،25.

فيفو السابقين نموذج أنشئت لدراسة عملية التئام الجروح في المكروية في الخلايا الأم

للتحقيق في الآليات التي تشارك في تنظيم التئام الجروح لظهارة داخل المكروية في الخلايا الأم، تم إنشاء نموذج جراحة الساد ذات الصلة سريريا خارج الحي وهمية. يتم إنشاء هذا النموذج من عدسة الأنسجة والذي يقدم العديد من المزايا وذلك بسبب خصائصه الجوهرية: 1) العدسة هي جهاز بذاتها يحيط بها الغشاء القاعدي سميكة تسمى كبسولة العدسة. 2) هو اوعائي، 3) لا معصب و4) خالية من سدى المرتبطة بها. ولذلك، فإن عملية الإصلاح فحص يقتصر على الخلايا التي تعتبر ملازمة للعدسة المناسبة. لإنشاء هذا النموذج، يتم إزالة العدسات من الجنينية (E) يوم 15 كتكوت الجنين (الشكل 1A). يتم إجراء شق صغير في كبسولة العدسة الأمامية والخلايا الظهارية عدسة المرتبطة بها التي يتم من خلالها إزالة العدسة كتلة الخلايا الأليافبواسطة المائية شطف، وهو إجراء إعتام عدسة العين الكلاسيكي الذي يخلق جرح ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (الشكل 1A). ظهارة العدسة، والتي هي موجودة كما أحادي الطبقة مستمرة من الخلايا على طول الأمامي والجوانب الاستوائية من كبسولة العدسة المحيطة كتلة الخلايا الألياف، جنبا إلى جنب مع السكان الذاتية المتمثلة في-vimentin الغنية الأسلاف خلية إصلاح الوسيطة ^1، يبقى في عدسة خلال استخراج خلايا الألياف (الشكل 1A). بعد إزالة كتلة الخلايا الألياف، يتم إجراء خمس تخفيضات في الجانب الأمامي للكبسولة العدسة وظهارة بالارض جانب الخلية يصل، في مواجهة المتوسطة. يتيح هذا الإجراء التصوير للاستجابة للظهارة أصيب النهج مجهرية مختلفة، بما في ذلك الفحص المجهري الوقت الفاصل بين (فيديو 1). هذه التخفيضات الإضافية في العدسة الأمامية كبسولة خلق يزدرع النجوم شكل العدسة أصيب الجرح دائري تم إنشاؤها عن طريق إزالة كتلة الخلايا الليفية في CEN(ثالثا) من يزدرع (الشكل 1B). جراحة الساد بعد وتسطيح للأنسجة، ويقع ظهارة الجرحى في نقطة من النجم، وهو ما يشار إليه باسم مرفق الأصل المنطقة (OAZ) (الشكل 1A، B).

إزالة كتلة الخلية الألياف من موقع حرصه على كبسولة العدسة الخلفي يخلق منطقة الجرح استنساخه للغاية على الغشاء القاعدي، وتحيط بها الظهارة الجرحى (الشكل 1B، C). الحافة المكشوفة من عدسة ظهارة الاستوائية، تماما المجاورة إلى حيث كانت تعلق على خلايا الألياف، هو على حافة الرائدة في الجرح. مباشرة بعد الإصابة، يتم تنشيط جزء من السكان من إصلاح الخلايا الوسيطة-vimentin الغني ويهاجر إلى حافة الجرح من ظهارة ^1. ظهارة العدسة، مع هذه الخلايا إصلاح الوسيطة على حافة الرائدة، ويتحرك بسرعة على المنطقة خالية من الخلايا لب الذاتيةasement كبسولة غشاء، المنطقة الوسطى الهجرة (CMZ)، ليبدأ شفاء الجرح. الخلايا الظهارية عدسة تتحرك بشكل جماعي، كما ورقة، في CMZ بقيادة خلايا اللحمة المتوسطة الزعيم ^1، التي تمتد على طول نتوءات الركيزة وتوجيه عملية التئام الجروح (F igure 1D، فيديو 1). تقدم التئام الجروح، وتغطي مساحة كبيرة من الجرح (67٪) بعد يوم 1 في الثقافة (الشكل 1C)، وعادة ما تكتمل في غضون 3 أيام في الثقافة (الشكل 1B، C).

يمكن التفريق الجسدي واضح بين المناطق OAZ وCMZ في وقت مبكر من يوم 1، التي رسمتها كما تجعد أو تجعد بين هاتين المنطقتين (الشكل 2A، السهم). وتوفر هذه الظاهرة توجيهي التي لفصل هذه المناطق في أي نقطة أثناء عملية التئام الجروح. باستخدام ملقط يميل غرامة، ويمكن أن يكون الثقافات تشريح الصغيرة لseparأكل المناطق OAZ وCMZ من أجل تحليل الاختلافات الجزيئية بين هذه المناطق المتميزة (الشكل 2B). هذا هو نهج القوية التي استخدمت لتحديد التغييرات الهجرة الخاصة المرتبطة الجرح إصلاح. في السابق، فقد وجد أن هناك زيادة في التنسيق التصاق كيناز (FAK) التنشيط في فيفو السابقين الثقافات بجروح خلال عملية الجرح ⁵ الشفاء. FAK لها دور راسخة في هجرة الخلايا ^26-29. القدرة على إثراء للOAZ مقابل جعل CMZ الآن من الممكن لدراسة ما إذا كانت هذه الزيادة في تفعيل FAK تقتصر على المنطقة CMZ الهجرة محددة. لهذه الدراسة، تم فصل المناطق OAZ وCMZ في يوم 1-3 (في جميع مراحل عملية التئام الجروح) وتحليلها من أجل التغيرات البيوكيميائية في FAK تفعيل (FAK pY397). وأظهرت النتائج أن الزيادة في تفعيل FAK ارتبط المنطقة CMZ الهجرة الخاصة (الشكل 2C). الفيفو السابقين نموذج النظام الموصوفة هنا يوفر فرصة فريدة من نوعها والتي لا تقدر بثمن والتي للتحقيق في برامج الجزيئية تشارك في تنسيق عملية إصلاح الجرح.

الشكل 1. إنشاء نموذج خارج الحي الذي لدراسة عملية التئام الجروح داخل المكروية في الخلايا الأم ردا على إصابة الفسيولوجية. تم إجراء جراحة الساد وهمية على E15 العدسات الفرخ. تتم إزالة كتلة الخلية الألياف عدسة (البيضاء) من خلال شق في كبسولة الأمامية التي كتبها المائية شطف. هذه العملية يترك وراءه الخلايا الظهارية (الخضراء) التي لا تزال ملتصقة بإحكام على كبسولة العدسة وقبو غشاء الخلية الجرداء (BM) على الخلايا التي سوف تهاجر لتضميد الجرح (A). يتم إجراؤها على ظهارة خمسة تخفيضات لشد خارج وخلق شكل نجمة عبادة خارج الجسم الحي لدى عودتهم (B). ويشار إلى الخلايا الظهارية عدسة المتبقية التي تملأ نقطة للنجم باسم مرفق الأصل المنطقة (OAZ) (A، B). وBM الجرداء على الخلايا التي سوف يهاجر يشار اليها على انها المنطقة الوسطى الهجرة (CMZ) (A، B). على الفور ردا على إصابة الخلايا تبدأ في التحرك إلى المنطقة CMZ على BM-الجرداء الخلية (B). وكميا منطقة الجرح المفتوح على مر الزمن في (C). عادة اكتمال التئام الجروح التي كتبها D3 في الثقافة (B، C). في (B، C) T0 يدل وقت جرح، D1-3 يدل على أيام 1-3. ضمن CMZ، يمكن أن اثنين من السكان الخلايا تمييزها، والخلايا الظهارية العدسة والخلايا زعيم الوسيطة التي توطين إلى حافة الجرح، وتمتد على طول نتوءات الركيزة (D). لقد طبع هذا الرقم من Menko وآخرون ^23.الهدف = "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. فصل المناطق OAZ وCMZ لتحديد التغييرات الهجرة الخاصة المرتبطة التئام الجروح، وبحلول يوم 1، المناطق OAZ وCMZ يمكن تمييزها عن بعضها البعض من خلال تجعد (السهم)، والتي يمكن استخدامها كدليل للفصل هذه المناطق (A). في هذه تجعد، ملقط يميل غرامة يمكن استخدامها لقبضة حافة خط OAZ / CMZ. يمكن فصل الثقافة على طول هذا الخط مما يسمح للعزل المناطق OAZ وCMZ (B). من يوم 1 (D1) الصغرى تشريح OAZ وCMZ يوميا، - يوم 3 (D3) قد أنجز لتحديد ما إذا تحدث تغييرات الهجرة الخاصة في تفعيل FAK في منطقة إصلاح الجرح. تم فحص لست] من كل منطقة عن طريق تحليل لطخة غربية إما تفعيل FAK (pFAK Y397) أو مجموع التعبير FAK (C). في حين لوحظ تغير طفيف في إجمالي مستويات FAK، كان مرتبطا بزيادة في تفعيل FAK مع المنطقة CMZ الهجرة الخاصة (C).

فيديو 1. يتبع التئام الجروح في نموذج جراحة الساد وهمية خارج الحي الزمن الفاصل بين المجهري من الوقت 0 بعد الاصابة حتى اليوم 3. الجرح إغلاق ينظر من وسط منطقة الجرح.

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryonic lenses requires developing skills in the handling of small tissues that can be acquired with practice, as the embryonic lenses are only about 2mm in diameter. The cataract surgery procedure is performed under the dissecting microscope, and the critical technical steps include making a small incision in the anterior capsule, removing the fiber cell mass by hydro-elution, and making additional cuts in the anterior epithelium that make it possible to flatten the ex vivo post-cataract surgery lens tissue on the substrate to which it is pinned for study in culture. The microsurgical cataract surgery procedure produces a highly reproducible wound area, exposing a circular region of the tissue’s endogenous basement membrane onto which the injured epithelium migrates as it closes the wound. This model has been used to study mechanisms regulating wound repair of epithelia, including how the epithelial cells are able to move collectively into the wound area ³⁰ and the leader cell function of an endogenous vimentin-rich repair cell population of mesenchymal lineage at the wound edge^1,23.

This ex vivo wound model lends itself readily to live microscopic observation throughout the repair process including time-lapse imaging, and confocal image analysis following immuno-localization of proteins of interest. Making cuts in the anterior lens capsule so that the capsule with its attached injured epithelium can be flattened on the culture substrate makes such ease of observation possible. Including this critical step is essential for viewing the behavior of the response of the epithelial cells in the original zone of attachment and the movement of the injured epithelium onto the wounded area of the posterior capsule from the time of injury. A great advantage for biochemical or molecular biology analyses is that the cells that are associated with the basement membrane in the original attachment zone (OAZ) can be separated by micro-dissection from those cells migrating across the wounded area of the basement membrane (CMZ) at any time during the wound repair process.

The mock cataract surgery wound repair culture model was established using lenses from E15 chick embryos. Alternatively, wound repair cultures can be successfully prepared using this protocol from lenses removed at other stages of chick embryonic development, and from lenses isolated from both adult mice and rats. While studies to date have focused on wound repair in the chick embryo lens model, in part because of the ease in obtaining large numbers of age-matched tissue for experimental analysis, there is no reason that would prevent this protocol from being used with lenses isolated from any species. However, it is widely recognized in the literature that wound repair in the embryo often occurs more quickly and with less scarring than in the adult ^31-35. The wound repair cultures presented here are typically grown in the absence of serum to maintain conditions close to the in vivo microenvironment, suggesting that the factors that promote wound healing are provided by components of that environment including ones produced by the cells themselves. However, wound repair in this culture model also occurs effectively in defined media conditions, and can be modulated by including specific pharmaceutical inhibitors in the culture media ^5,23,30, or knocking down expression of proteins through an siRNA approach ²³. Note that inclusion of serum in the culture media induces movement of the cells from the cut edges on the outside of the flattened explant onto the tissue culture substrate, while in serum-free medium the cells remain associated with the capsule and migrate only onto the wounded area of the basement membrane of the lens capsule. The approach of adding serum to the media can be an advantage if one desires to examine the behavior of the wounded epithelium as it moves onto different substrates. To that end, there are other options that can be taken to alter the environment for wound repair that includes use of alternate tissue culture substrates on which to pin the tissue following the mock cataract surgery, such as substrates with defined rigidities as can be provided by collagen or acrylamide gels. While the ex vivo mock cataract surgery cultures can be facilely pinned to tissue culture plastic, collagen gels, or acrylamide gels, affixing the cultures to glass substrates has proven difficult. An important adaptation of this wound repair model to consider is its usefulness for re-injury studies. In this approach a scrape wound is inflicted on the healed lens epithelium after wound repair is completed, which removes an area of the lens epithelium from its underlying basement membrane capsule. This re-injury can be performed in either the original zone of attachment of the epithelium to the lens capsule or in the central migration zone where the epithelium has healed the initial wound area.

A great advantage to this wound-repair model is that the lens is an avascular tissue, not innervated without an associated stromal compartment, thus creating an ideal reductionist model of wound repair. As such, this model allows for examination of the native wound repair process under conditions in which only cells and microenvironment that are intrinsic to this epithelial tissue can modulate the repair process. In order to examine the role of cells that could be recruited following injury from neighboring vasculature or stromal compartments, it would be necessary to add such cells to the culture environment.

In previous culture wound models, the major limitation to investigating how an epithelial tissue responds to wounding is that most are limited to examining cells, often cell lines, plated on tissue culture plastic. Popular models using this approach, such as the scratch wound assay, have provided significant insight into how cells migrate to fill an area of the culture dish from where the cells have been removed. However, in these scratch wound studies the movement of cells onto the exposed area of the culture substrate occurs in the absence of many of the dynamic wound response signals that regulate wound healing in vivo. Therefore, the most important advantage of the mock cataract surgery culture model is that wound repair can be studied ex vivo within the cells’ native microenvironment and the endogenous signals originating from the underlying matrix, growth factors, cytokines and repair cell subpopulations. As this new wound repair model makes it possible to examine and manipulate the response of an epithelium to wounding in its native microenvironment, it is likely to have many applications, and holds great promise as an ideal system for revealing the molecular-mediators of wound-repair.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).