Estabelecimento de um clinicamente relevantes

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

A, a cirurgia de catarata simulada clinicamente relevante, ex vivo epitelial modelo cicatrização de feridas aqui descrito foi desenvolvido para fornecer uma ferramenta para investigar os mecanismos que regulam a reparação de tecidos epiteliais, em resposta a uma lesão. Os principais recursos que foram destinados para na criação deste modelo incluiu uma condições) que prevêem que de perto replicados a resposta in vivo para ferindo em uma configuração de cultura, 2) facilidade de modular os elementos reguladores de reparação, e 3) capacidade de imagem do processo de reparação, na sua totalidade, em tempo real. O desafio, portanto, era criar um modelo de cultura em que foi possível estudar e manipular, reparação epitelial no microambiente nativo das células. A disponibilidade deste modelo ferida-reparação abre novas possibilidades para identificar os sinais de sinalização endógenas de matriz proteínas, citocinas e quimiocinas, que regulam o processo de reparação. Além disso, o modelo é ideal para examinar como umn epitélio é capaz de mover-se como uma folha colectivo para re-epithelialize área da ferida ^2,3, e para determinar a linhagem de células mesenquimais líder no bordo da ferida que funcionará em colectivo dirigir a migração do epitélio ferido ^4. Este modelo também fornece uma plataforma com a qual identificar terapêuticas que possam promover a cicatrização de feridas eficaz e evitar que a reparação de feridas aberrante ^5.

Há já uma série de modelos ferida de reparação disponíveis, tanto em cultura e in vivo, que forneceram a maioria do que se sabe sobre o processo de reparação ferida hoje. Em modelos animais de lesão, tais como a córnea ^6-12 e ^13-17 da pele, há a oportunidade para estudar a resposta do tecido do ferimento no contexto de todos os mediadores de reparo que podem estar envolvidos no processo, incluindo contribuições do vasculatura e no sistema nervoso. No entanto, existem limitações para manipular a expericondições mentais in vivo, e ainda não é possível realizar estudos de imagem da resposta de reparação in vivo, de forma contínua ao longo do tempo. Em contraste, a maioria dos modelos de cultura in vitro de reparação de feridas, tais como a ferida zero, pode ser facilmente manipulada e seguido ao longo do tempo, mas falta o contexto ambiental de estudar a cicatrização de feridas no tecido in vivo. Enquanto ex vivo em modelos oferecem a vantagem de estudar o processo de reparação da lesão de forma contínua ao longo do tempo no contexto da microambiente das células juntamente com a capacidade para modular os reguladores moleculares de reparação em qualquer ponto de tempo no processo, existem poucos modelos que se encaixam estes parâmetros.

Aqui é descrito um procedimento para gerar altamente reprodutível ex vivo epitelial culturas que reproduzem a resposta de um tecido epitelial a um ferimento fisiológico cura. Usando a lente de embrião de galinha como uma fonte de tecido, um ex vivo mock cirurgia de catarata é realizada. A lente é um tecido ideal para usar para esses estudos, uma vez que é auto-suficiente dentro de uma cápsula de membrana basal espessa, avascular, não inervados, e livre de qualquer estroma associada ^18,19. Na doença humana, a cirurgia da catarata aborda a perda de visão devido a opacificação da lente, e envolve a remoção da massa celular da fibra da lente, o qual compreende a maior parte da lente. Seguindo a visão cirurgia de catarata é restaurada através da inserção de uma lente intra-ocular artificial. O procedimento de cirurgia de catarata, através da remoção das células da fibra, induz uma resposta a uma lesão no epitélio do cristalino adjacente, que responde por re-epitelialização da área posterior da cápsula da lente que tinha sido ocupada pelas células de fibra. Na cirurgia de cataratas, como na maioria das respostas de reparação de ferida, há por vezes ocorre um resultado de fibrose aberrante para a resposta de cicatrização das feridas, associado com o aparecimento dos miofibroblastos, em que a lente é conhecido como posterior Capsule Opacificação ^20-22. Para gerar o modelo de cicatrização de feridas cirurgia de catarata, um procedimento de cirurgia de catarata é imitado em lentes removidas do olho de embrião de pinto para produzir uma lesão fisiológica. Remoção microcirúrgico da fibra lente células resulta em uma área de ferida circular muito consistente rodeado pelas células epiteliais da lente. Esta população de células permanece firmemente ligado à cápsula membrana basal da lente e é ferido pelo procedimento cirúrgico. As células epiteliais migrar para a área desnudo da membrana basal endógena para curar a ferida, liderada por uma população de células mesenquimais rico em vimentina conhecidas no processo de reparação como células líder ^um. Com este modelo, a resposta de um epitélio de lesão pode ser visualizada facilmente seguido e com o tempo no contexto do microambiente das células. As células são facilmente acessíveis a alteração da expressão ou activação de moléculas que se espera que desempenham um papel na reparação de feridas. Um poderoso recurso do thé o modelo é a capacidade de isolar e estudar alterações específicas do migração no âmbito da cicatrização de feridas. A capacidade para preparar um grande número de envelhecidos ex vivo de cura de feridas culturas combinadas para estudos é outra vantagem deste modelo. Assim, este sistema modelo proporciona uma oportunidade única de provocar uma separação mecanismos de reparo de feridas e terapêutica de teste para o seu efeito sobre o processo de cicatrização de feridas. O modelo de cirurgia de catarata ex vivo simulada deverá ter ampla aplicabilidade, fornecendo um recurso crítico para o estudo de mecanismos de reparação do prejuízo.

O protocolo a seguir está em conformidade com os Animal Care Institucional e Comitê de Uso orientações Thomas Jefferson University e com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Vision Research.

1. Configuração e Preparação de Lentes de Cultura Ex Vivo de Feridas

1. Coloque três pratos de 100 mm de petri em um estéril, capela de fluxo laminar. Encha duas das placas de Petri até meio com tampão Tris / dextrose (tampão TD; 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,7 mM de Na ₂ PO _4, 5 mM de D-glucose, 8,25 mM de Tris base, pH a 7,4 com HCl) à TA , deixando a terceira vazio. Meios de cultura de pré-aquecer (Media suplementado com 199, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina / estreptomicina) a ³⁷ ° C.
   Nota: O padrão de cura de feridas é o meio de cultura isento de soro, como ocorre in vivo; no entanto, as culturas de reparação da ferida podem ser cultivadas com sucesso em condições de meios definidos, que incluem soro ou outros factores.
2. Remover fértil d embrionárioay 15 clara de ovo pintainho leghorn da incubadora (realizada em 37,7 ° C com agitação suave)
3. Coloque o ovo selecionado na capela de fluxo laminar e limpo fora do shell com etanol a 70% a partir de um frasco de lavagem. Realizar todos os procedimentos a seguir em condições de assepsia na câmara de fluxo laminar, usando soluções e instrumentos estéreis.
4. Craque conteúdo dos ovos e colocar no vazio 100 milímetros placa de Petri. Decapitar embrião usando uma pinça e tesouras padrão finas. Coloque a cabeça de embrião de pinto em uma placa de Petri contendo tampão de TD e descartar adequadamente o restante do embrião. Opcionalmente manter as cabeças de embrião de pinto em tampão de TD por um curto período de tempo, não mais do que 15 min.
5. Coloque a cabeça de embrião de galinha em uma tampa de placa de Petri. Utilizando uma pinça de alta precisão, remova a lente junto com seu humor vítreo do olho ligados na seguinte sequência. Comprima a parte posterior do olho com a pinça para criar uma pequena abertura na parte posterior do olho.
6. Em seguida, segure o humor vítreo with fórceps e puxar suavemente no vítreo com um movimento de rolamento, o vítreo com a lente vai ser ligado desalojado do olho. Lugar da lente / vítreo na placa de Petri contendo tampão restante TD. Permitir que as lentes permaneçam em tampão TD durante o período de 30 min.
7. Mover a lente para uma nova tampa de placa de petri sob um microscópio de dissecação. Deste ponto em diante executar todas as etapas sob um microscópio de dissecação. Com uma pinça de alta precisão cuidadosamente afastar qualquer corpo ciliar (células pigmentadas) que foram desalojados com a lente usando a ponta da pinça, tomando cuidado para não danificar o tecido da lente.
   Nota: A remoção do corpo ciliar assegura que os tipos de células que não são endógenos às lentes não estão incluídos na cultura da reparação da ferida.
8. Separa-se a lente do humor vítreo com uma pinça de alta precisão por beliscar fora do corpo vítreo de sua associação com a cápsula posterior do cristalino.
9. Usando alta precisão forceps transferir a lente em uma pequena gotade tampão de TD (cerca de 200 ul) num prato de cultura de tecidos 35 milímetros.

2. realização de cirurgia de catarata Mock

1. Orientar a lente na gota de tampão de TD no prato de 35 mm com o aspecto anterior da lente voltada para cima.
   Nota: A anterior da lente pode ser facilmente identificados pela presença de um anel denso no tecido que regista a fronteira entre a região anterior e equatorial do epitélio da lente. Em contraste, há uma ausência de marcas sobre a parte posterior da cápsula da lente para que as células das fibras da lente estão ligados.
2. Usando duas pinças de alta precisão fazer uma pequena incisão (aproximadamente 850μm) no centro da cápsula anterior da lente, a espessura da membrana basal que circunda a lente de tecido, e a sua associada epitélio anterior do cristalino, por agarrar o tecido com uma pinça em cada mão e puxando suavemente em direções opostas.
3. Remover a massa celular da fibra, que constitui a maior parte do tecido da lente, dislodging-lo de suas ligações com o epitélio da lente e circundante cápsula do cristalino por hydro-eluição (uma abordagem usada em cirurgia de catarata clássico, modelado na Figura 1A).
4. Encher uma seringa de 1 mL com uma ponta de agulha de 27,5 L com 300 ul de tampão de TD. Inserir a ponta da agulha dentro da incisão feita na cápsula anterior do cristalino, e cerca de metade para a lente.
5. Pressione levemente a seringa injetar o tampão TD na massa celular fibra lente. Injectar entre 50 e 200 ul TD, e nunca mais de 300 ul. Observe a massa celular fibra soltando-se do epitélio e lente cápsula.
6. Utilizando uma pinça de alta precisão, retire a massa celular fibra soltos da lente através do local da incisão anterior.
   Nota: Este procedimento deixa a cápsula posterior do cristalino membrana basal ao qual as células de fibra tinha sido anexado desnudada de células, e um epitélio da lente ferido apenas adjacente a este site.

3. Preparing o Lens Ferido para Ex Cultura Vivo

1. Nivelar o saco capsular da lente, que resulta da cirurgia da catarata descrito acima no prato de cultura, o lado das células para cima, fazendo cinco cortes na face anterior do saco capsular.
2. Corte perpendicular ao local da incisão original através do equador do cristalino. Achate as resultantes cinco "retalhos" da cápsula do cristalino com epitélio anexado no lado da cultura cápsula prato para baixo, celular voltado para cima. Note-se a lente ex vivo feridos agora deve assumir uma forma em estrela ou flowerlike (ver Figura 1B).
3. Para fixar a cápsula para o prato, pressione suavemente para baixo com a pinça em cada ponto da estrela. Isso fará com que um pequeno recuo para as cinco dicas mais fora do explante e resultar em anexo sustentado para o prato.
   Nota: É possível danificar a cápsula durante este processo e por isso é importante para assegurar que a cápsula se o prato mais próximo possível das pontas das flaPS quanto possível, bem como para tornar a menor quantidade de pontos de fixação quanto possível (em geral duas, máximo de três por retalho).
4. Remover o tampão de TD no prato de 35 mm e substituí-la com 1,5 ml de meio de pré-aquecido. Cobrir o prato de 35mm com a sua tampa e lugar na incubadora (37 ° C, 5% CO _2).

4. Separação da Zona de Migração Central (CMZ), onde Re-epitelização da área ferida do Posterior Capsule Ocorre, do anexo original Zone (OAZ) de lente células epiteliais, para análise quantitativa.

Nota: As células começam a mover-se para a região de CMZ imediatamente em resposta à lesão. Por um dia em cultura células suficientes estão migrando através do CMZ para análise molecular e bioquímica, após a separação da CMZ eo OAZ por micro-dissecção ^23. Este protocolo envolve a remoção de uma aba (OAZ) de cada vez a partir da área ferida da cápsula.

1. Observar uma demarcatião, claramente visíveis ao microscópio de dissecação, e entre o OAZ CMZ (ver Figura 2A). Usando duas pinças de alta precisão, agarrar com as duas pinças na extremidade da linha OAZ / CMZ, apenas um lado para o outro, em ambos os lados da linha (ver figura 2A, B, seta).
2. Usando uma mão / um fórceps no lado da CMZ continuar a sustentar a cultura feridos, enquanto com a outra mão / pinça, puxe o OAZ ao longo da linha OAZ / CMZ. O CMZ facilmente se separa do OAZ ao longo desta linha. Continue ao longo desta linha em torno de toda a cultura até que as duas regiões são completamente separados.
3. Estude as fracções separadas OAZ e CMZ para a análise molecular, tais como ²⁴ ou bioquímica análise de RNA-Seq como western blot ou co-imunoprecipitação ^23,25.

Ex Vivo Modelo criado para estudar o processo de cicatrização da ferida no microambiente das células nativas

Para investigar os mecanismos envolvidos na regulação da cicatrização da ferida de um epitélio em microambiente das células nativas, um modelo de cirurgia de catarata clinicamente relevante ex vivo simulada foi criado. Este modelo é criada a partir de tecido da lente que oferece muitas vantagens, devido às suas propriedades intrínsecas: 1) A lente é um órgão auto-contido rodeado por uma membrana basal chamada espessura da cápsula da lente; 2) é avascular, 3) não inervado e 4) livre de estroma associado. Portanto, o processo de reparação examinado se limita às células que são inato para a lente adequada. Para criar este modelo, as lentes são removidas a partir de uma embrionária (E) dia 15 de embrião de galinha (Figura 1A). Uma pequena incisão é feita na cápsula da lente anterior e as suas células epiteliais da lente associados através do qual a massa de células fibra lente é removidapor hidro-eluição, um procedimento clássico de catarata que cria um ferimento fisiologicamente relevante (Figura 1A). O epitélio do cristalino, o qual está presente como uma monocamada de células contínua ao longo da anterior e equatoriais aspectos da cápsula da lente em torno da massa de células de fibras, juntamente com a sua população endógena de progenitores de células mesenquimais reparação rico-vimentina ^1, permanecem na lente durante o extracção de células de fibras (Figura 1A). Após a remoção da massa celular da fibra, cinco cortes são feitos na face anterior da cápsula da lente e o epitélio achatado do lado da célula para cima, de frente para o meio. Este procedimento permite a imagiologia da resposta do epitélio ferido por várias abordagens microscópicas, incluindo microscopia de lapso de tempo (Vídeo 1). Estes cortes adicionais na cápsula anterior do cristalino criar um explante estrela-forma da lente ferido com a ferida circular criado através da remoção da massa celular da fibra no center do explante (Figura 1B). Cirurgia pós-catarata e achatamento do tecido, o epitélio ferido está localizado nas pontas da estrela, o qual é referido como o anexo original zona (OAZ) (Figura 1A, B).

A remoção da massa celular da fibra a partir do seu local de ligação sobre a cápsula posterior da lente cria uma área de ferida altamente reprodutível sobre a membrana basal, rodeado pelo epitélio ferido (Figura 1B, C). A extremidade exposta da lente epitélio equatorial, apenas ao lado em que as células da fibra foram ligados, é o bordo de ataque da ferida. Imediatamente após a lesão, uma subpopulação de células mesenquimais reparação rico-vimentina é activado e migra para a borda da ferida do epitélio ^1. O epitélio do cristalino, com estas células mesenquimais de reparação na sua borda dianteira, move-se rapidamente para a região isenta de células do b endógenoasement cápsula de membrana, a Zona de Migração Central (CMZ), para começar a curar a ferida. Células epiteliais lente mover coletivamente, como uma folha, para a CMZ liderada pelas células mesenquimais ^um líder, que se estendem ao longo de saliências do substrato e dirigem o processo de cicatrização de feridas (F IGURA 1D, Video 1). A cicatrização da ferida progride, cobrindo uma área significativa da ferida (67%) por dia em uma cultura (Figura 1C), e é tipicamente completada dentro de 3 dias em cultura (Figura 1B, C).

Pode ser feita uma distinção física clara entre as regiões OAZ e CMZ já nos dias 1, que é demarcada como um vinco ou ruga entre estas duas zonas (Figura 2A, seta). Esse fenômeno fornece uma diretriz pela qual a separar essas áreas em qualquer ponto durante o processo de cicatrização da ferida. Usando uma pinça fina com ponta, as culturas podem ser micro-dissecados para SeparComeram as regiões Oaz CMZ e, a fim de analisar as diferenças moleculares entre estas zonas distintas (Figura 2B). Esta é uma abordagem potente que tem sido utilizada para identificar alterações específicas de migração associados reparação de feridas. Anteriormente, verificou-se que há um aumento na quinase de adesão focal (FAK) activação nas culturas ex vivo feridas durante o processo de ⁵ cura da ferida. A FAK desempenha um papel bem estabelecido na migração de células ^26-29. A capacidade para enriquecer para o OAZ vs CMZ feita agora possível verificar se este aumento na activação da FAK é específico para a região específica do migração CMZ. Para este estudo, as regiões Oaz CMZ e foram separadas no dia 1-3 (em todo o processo de cicatrização da ferida) e analisados ​​por alterações bioquímicas na activação de FAK (FAK pY397). Os resultados demonstraram que o aumento da activação de FAK foi associado com a região específica do migração CMZ (Figura 2C). Oex vivo sistema modelo descrito aqui fornece uma oportunidade única e de valor inestimável no qual a investigar os programas moleculares envolvidos na coordenação do processo de reparo de feridas.

Figura 1. Criação de um modelo ex vivo no qual a estudar o processo de cicatrização da ferida dentro nativa microambiente das células em resposta a um ferimento fisiológico. Cirurgia de catarata Mock foi realizada em lentes de pintainho E15. A massa celular fibra lente (branco) é removido através de uma incisão na cápsula anterior por hidro-eluição. Este processo deixa para trás as células epiteliais (verde) que permanecem firmemente aderente à cápsula da lente e uma membrana basal desnudada de células (BM) na qual as células vão migrar para curar a ferida (A). Cinco cortes são feitas para o epitélio aplainar para fora e criar uma estrela em forma ex vivo culto ure (B). As células epiteliais de lente residuais que preenchem os pontos da estrela são referidos como o anexo original zona (OAZ) (A, B). A BM desnudado no qual as células vão migrar é referida como a zona central de Migração (CMZ) (A, B). Imediatamente em resposta a uma lesão, as células começam a mover-se para a região de CMZ no desnudada de células BM (B). A área da ferida aberta é quantificada ao longo do tempo em (C). A cicatrização de feridas é normalmente preenchido por D3 em cultura (B, C). Em (B, C) ​​indica a T0 momento do ferimento, D1-3 indica Dias 1-3. Dentro do CMZ, duas populações de células podem ser distinguidas, as células epiteliais da lente e as células mesenquimais líder que localizam à extremidade da ferida, que se estendem ao longo de saliências do substrato (D). Este valor é reproduzido a partir Menko et al ^23.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Separação de regiões Oaz e CMZ para identificar alterações específicas de migração associados com a cura de feridas. Por volta do dia 1, as regiões Oaz CMZ e podem ser distinguidos uns dos outros por um vinco (seta), que pode ser utilizado como uma guia para separar estas zonas (A). Neste vinco, uma pinça de ponta fina pode ser usada para prender a borda da linha OAZ / CMZ. A cultura pode ser separada ao longo desta linha, permitindo o isolamento das regiões Oaz CMZ e (B). Micro-dissecção do OAZ CMZ e diariamente, desde o dia 1 (D1) - dia 3 (D3) foi realizada para determinar se as alterações específicas de migração na activação FAK ocorrer na região de reparação de feridas. Lisados ​​de cada região foram examinadas por análise de Western blot para qualquer ativação FAK (pFAK Y397) ou expressão de FAK total (C). Embora pequena mudança nos níveis totais de FAK foi observada, um aumento na activação de FAK foi associado com a região CMZ específicos de migração (C).

Vídeo 1. cicatrização de feridas no modelo de cirurgia de catarata ex vivo simulado é seguido por microscopia de lapso de tempo desde o tempo 0 após a lesão até dia 3. fechamento da ferida é visto a partir do centro da área da ferida.

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryonic lenses requires developing skills in the handling of small tissues that can be acquired with practice, as the embryonic lenses are only about 2mm in diameter. The cataract surgery procedure is performed under the dissecting microscope, and the critical technical steps include making a small incision in the anterior capsule, removing the fiber cell mass by hydro-elution, and making additional cuts in the anterior epithelium that make it possible to flatten the ex vivo post-cataract surgery lens tissue on the substrate to which it is pinned for study in culture. The microsurgical cataract surgery procedure produces a highly reproducible wound area, exposing a circular region of the tissue’s endogenous basement membrane onto which the injured epithelium migrates as it closes the wound. This model has been used to study mechanisms regulating wound repair of epithelia, including how the epithelial cells are able to move collectively into the wound area ³⁰ and the leader cell function of an endogenous vimentin-rich repair cell population of mesenchymal lineage at the wound edge^1,23.

This ex vivo wound model lends itself readily to live microscopic observation throughout the repair process including time-lapse imaging, and confocal image analysis following immuno-localization of proteins of interest. Making cuts in the anterior lens capsule so that the capsule with its attached injured epithelium can be flattened on the culture substrate makes such ease of observation possible. Including this critical step is essential for viewing the behavior of the response of the epithelial cells in the original zone of attachment and the movement of the injured epithelium onto the wounded area of the posterior capsule from the time of injury. A great advantage for biochemical or molecular biology analyses is that the cells that are associated with the basement membrane in the original attachment zone (OAZ) can be separated by micro-dissection from those cells migrating across the wounded area of the basement membrane (CMZ) at any time during the wound repair process.

The mock cataract surgery wound repair culture model was established using lenses from E15 chick embryos. Alternatively, wound repair cultures can be successfully prepared using this protocol from lenses removed at other stages of chick embryonic development, and from lenses isolated from both adult mice and rats. While studies to date have focused on wound repair in the chick embryo lens model, in part because of the ease in obtaining large numbers of age-matched tissue for experimental analysis, there is no reason that would prevent this protocol from being used with lenses isolated from any species. However, it is widely recognized in the literature that wound repair in the embryo often occurs more quickly and with less scarring than in the adult ^31-35. The wound repair cultures presented here are typically grown in the absence of serum to maintain conditions close to the in vivo microenvironment, suggesting that the factors that promote wound healing are provided by components of that environment including ones produced by the cells themselves. However, wound repair in this culture model also occurs effectively in defined media conditions, and can be modulated by including specific pharmaceutical inhibitors in the culture media ^5,23,30, or knocking down expression of proteins through an siRNA approach ²³. Note that inclusion of serum in the culture media induces movement of the cells from the cut edges on the outside of the flattened explant onto the tissue culture substrate, while in serum-free medium the cells remain associated with the capsule and migrate only onto the wounded area of the basement membrane of the lens capsule. The approach of adding serum to the media can be an advantage if one desires to examine the behavior of the wounded epithelium as it moves onto different substrates. To that end, there are other options that can be taken to alter the environment for wound repair that includes use of alternate tissue culture substrates on which to pin the tissue following the mock cataract surgery, such as substrates with defined rigidities as can be provided by collagen or acrylamide gels. While the ex vivo mock cataract surgery cultures can be facilely pinned to tissue culture plastic, collagen gels, or acrylamide gels, affixing the cultures to glass substrates has proven difficult. An important adaptation of this wound repair model to consider is its usefulness for re-injury studies. In this approach a scrape wound is inflicted on the healed lens epithelium after wound repair is completed, which removes an area of the lens epithelium from its underlying basement membrane capsule. This re-injury can be performed in either the original zone of attachment of the epithelium to the lens capsule or in the central migration zone where the epithelium has healed the initial wound area.

A great advantage to this wound-repair model is that the lens is an avascular tissue, not innervated without an associated stromal compartment, thus creating an ideal reductionist model of wound repair. As such, this model allows for examination of the native wound repair process under conditions in which only cells and microenvironment that are intrinsic to this epithelial tissue can modulate the repair process. In order to examine the role of cells that could be recruited following injury from neighboring vasculature or stromal compartments, it would be necessary to add such cells to the culture environment.

In previous culture wound models, the major limitation to investigating how an epithelial tissue responds to wounding is that most are limited to examining cells, often cell lines, plated on tissue culture plastic. Popular models using this approach, such as the scratch wound assay, have provided significant insight into how cells migrate to fill an area of the culture dish from where the cells have been removed. However, in these scratch wound studies the movement of cells onto the exposed area of the culture substrate occurs in the absence of many of the dynamic wound response signals that regulate wound healing in vivo. Therefore, the most important advantage of the mock cataract surgery culture model is that wound repair can be studied ex vivo within the cells’ native microenvironment and the endogenous signals originating from the underlying matrix, growth factors, cytokines and repair cell subpopulations. As this new wound repair model makes it possible to examine and manipulate the response of an epithelium to wounding in its native microenvironment, it is likely to have many applications, and holds great promise as an ideal system for revealing the molecular-mediators of wound-repair.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).