Création d'une importance clinique

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

La chirurgie de la cataracte cliniquement pertinente, maquette, modèle de cicatrisation des plaies ex vivo épithéliale décrit ici a été développé pour fournir un outil pour étudier les mécanismes qui régulent la réparation des tissus épithéliaux en réponse à une blessure. Principales caractéristiques qui visaient pour la création de ce modèle comprenaient 1) offrant des conditions qui reproduites étroitement la réponse in vivo pour blessant dans un cadre de culture, 2) la facilité de moduler les éléments de régulation de la réparation, et 3) capacité à l'image du processus de réparation, dans sa totalité, en temps réel. Le défi était donc de créer un modèle de culture dans lequel il a été possible d'étudier et manipuler, épithéliale réparation de blessure dans microenvironnement natif des cellules. La disponibilité de ce modèle plaie réparation ouvre de nouvelles possibilités pour identifier les signaux de signalisation endogènes de la matrice des protéines, des cytokines et des chimiokines qui régissent le processus de réparation. En outre, le modèle est idéal pour examiner comment unn épithélium est capable de se déplacer comme une feuille collective réépithélialisation de la plaie ^2,3, et pour la détermination de la lignée de cellules mésenchymateuses de tête au niveau du bord de la plaie qui fonctionne dans la direction de la migration de l'épithélium collective ⁴ blessé. Ce modèle fournit également une plate-forme permettant d'identifier des thérapeutiques qui pourraient favoriser la cicatrisation efficace et prévenir la blessure aberrante réparation ^5.

Il existe déjà un certain nombre de modèles disponibles plaie réparation, à la fois dans la culture et in vivo, qui ont fourni la plupart de ce qui est connu sur le processus de réparation de la plaie aujourd'hui. Dans les modèles de blessures animaux, tels que la cornée et la peau ^{6-12 13-17,} il ya la possibilité d'étudier la réponse du tissu à blessant dans le contexte de tous les médiateurs de réparation qui pourraient être impliqués dans le processus, y compris les contributions de la vasculaire et le système nerveux. Cependant, il ya des limites à la manipulation de l 'expérienceconditions mentales in vivo, et il est pas encore possible de mener des études d'imagerie de la réponse de réparation in vivo, de façon continue au fil du temps. En revanche, la plupart des modèles de culture in vitro plaie réparation, telles que la plaie de zéro, peuvent être facilement manipulés et suivis dans le temps, mais manquent le contexte de l'environnement de l'étude de la cicatrisation des plaies dans les tissus in vivo. Bien ex vivo modèles offrent l'avantage d'étudier le processus blessures de réparation continue dans le temps dans le cadre du microenvironnement des cellules associée à la capacité de moduler les régulateurs moléculaires de réparation à tout point de temps dans le processus, il ya quelques modèles qui correspondent à ceux-ci paramètres.

Ici, on décrit un procédé hautement reproductible pour générer ex vivo de cicatrisation epitheliale cultures qui reproduisent la réponse d'un tissu épithélial à une blessure physiologique. Utilisation de la lentille d'embryon de poulet comme source de tissus, un ex vivo mock chirurgie de la cataracte est effectuée. La lentille est un tissu idéal à utiliser pour ces études car il est auto-contenue dans une capsule de la membrane basale épaisse, avasculaire, pas innervé, et libre de toute stroma associé ^18,19. Dans la maladie humaine, la chirurgie de la cataracte traite une perte de vision due à l'opacification de la lentille, et implique l'élimination de la masse de cellules de la fibre de verre, qui comprend la plus grande partie de la lentille. A la suite de la chirurgie de la cataracte vision est restaurée par l'insertion d'une lentille intraoculaire artificielle. La procédure de chirurgie de la cataracte, par élimination des cellules de la fibre, induit une réponse de lésion de l'épithélium de la lentille adjacente, qui répond en ré-épithélialisation de la zone postérieure de la capsule du cristallin qui a été occupée par les cellules de la fibre. En chirurgie de la cataracte, comme dans la plupart des réponses plaie de réparation, il se produit parfois un résultat aberrant fibrotique à la réponse de cicatrisation de la plaie, associée à l'apparition de myofibroblastes, qui, dans la lentille postérieure est connu comme Capsule opacification ^20-22. Pour générer le modèle de cicatrisation de la plaie de la chirurgie de la cataracte, une procédure de chirurgie de la cataracte est imité dans les lentilles retirés de l'œil d'embryon de poulet pour produire une blessure physiologique. Enlèvement de microchirurgie de fibres de verre résultats des cellules dans une zone de la plaie circulaire très cohérent entouré par les cellules epitheliales du cristallin. Cette population de cellules reste fermement attachée à la capsule de la lentille membrane basale et est blessé par la procédure chirurgicale. Les cellules épithéliales migrent sur ​​la zone dénudée de la membrane basale endogène de guérir la plaie, dirigé par une population de cellules mésenchymateuses vimentine riche connus dans le processus de réparation en tant que cellules de ¹ chef. Avec ce modèle, la réponse d'un épithélium de blessure peut être facilement visualisé et suivie avec le temps dans le cadre de la micro-environnement des cellules. Les cellules sont facilement accessibles à des modifications de l'expression ou l'activation de molécules susceptibles de jouer un rôle dans la cicatrisation des plaies. Une puissante fonctionnalité de eest le modèle est la capacité à isoler et à étudier les changements spécifiques à la migration dans le cadre de la cicatrisation des plaies. La possibilité de préparer un grand nombre de plaies appariés ex vivo pour la guérison de cultures âgées études est un autre avantage de ce modèle. Ainsi, ce système de modèle fournit une occasion unique de démêler les mécanismes de la cicatrisation des plaies et de la thérapeutique de test pour leur effet sur le processus de cicatrisation des plaies. L'ex vivo maquette modèle de chirurgie de la cataracte est prévu d'avoir une large applicabilité, fournissant une ressource essentielle pour les mécanismes de réparation des lésions de l'étude.

Le protocole suivant est conforme aux institutionnels en soins des animaux et l'utilisation des lignes directrices du Comité de l'Université Thomas Jefferson et à la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans Vision Research.

1. Configuration et préparation des Objectifs de la Culture ex vivo des plaies

1. Passer trois plats 100 mm de Pétri dans, une hotte à flux laminaire stérile. Remplir deux des boîtes de Pétri à moitié avec du tampon Tris / dextrose (tampon TD; 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,7 mM de Na ₂ PO _4, 5 mM de D-glucose, 8,25 mM de base Tris, pH à 7,4 avec HCl) à la température ambiante , laissant le troisième vide. Des milieux de culture pré-chaud (Media 199 additionné de 1% de L-glutamine et 1% de pénicilline / streptomycine) à 37 ^o C.
   Remarque: La blessure norme guérison milieux de culture est sans sérum, comme cela se produit in vivo; toutefois, les cultures de réparation de plaie peuvent être cultivées avec succès dans des conditions définies de médias qui comprennent le sérum ou d'autres facteurs.
2. Retirer fertile d embryonnaireay 15 White Leghorn poussin oeuf de l'incubateur (tenue à 37,7 ° C avec doux balancement)
3. Placez l'oeuf sélectionné dans la hotte à flux laminaire et à l'extérieur de la coque propre avec 70% d'éthanol à partir d'une bouteille de lavage. Effectuer toutes les procédures ci-dessous dans des conditions aseptiques dans la hotte à flux laminaire, en utilisant des solutions et des instruments stériles.
4. Crack oeufs et placer le contenu dans la boîte de 100 mm de Pétri vide. Décapitez embryon en utilisant une pince standard et des ciseaux fins. Placez la tête d'embryon de poulet dans une boîte de Pétri contenant un tampon de TD et jetez le reste de l'embryon. Eventuellement garder les têtes d'embryon de poulet dans un tampon TD pour une courte période de temps, pas plus de 15 min.
5. Placez la tête d'embryon de poulet sur un couvercle de boîte de Pétri. En utilisant des pinces de haute précision, retirez l'objectif avec son humeur vitrée de l'œil fixé dans la séquence suivante. Pincez l'arrière de l'œil avec la pince pour créer une petite ouverture dans le fond de l'œil.
6. Ensuite, saisir l'humeur vitrée wvec pinces et tirez doucement sur le corps vitré avec un mouvement de roulis, le vitré avec l'objectif fixé seront délogés de l'œil. Fixer la lentille / vitré dans la boîte de Pétri contenant un tampon restante de TD. Laisser les lentilles de rester dans un tampon TD pour pas plus de 30 min.
7. Déplacer la lentille dans une nouvelle boîte de Pétri de couvercle sous un microscope à dissection. De ce point sur toutes les actions nécessaires sous un microscope de dissection. Avec des pinces de haute précision brosser soigneusement toute corps ciliaire (cellules pigmentées) qui ont été délogés avec la lentille en utilisant le bord de la pince, en prenant garde de ne pas endommager les tissus de la lentille.
   Remarque: Le retrait du corps ciliaire garantit que les types de cellules qui ne sont pas endogènes à la lentille ne sont pas inclus dans la culture plaie de réparation.
8. Séparer la lentille à partir de l'humeur vitrée avec des pinces de haute précision par pincement le corps vitré à partir de sa liaison avec la capsule postérieure du cristallin.
9. Utilisation de haute précision Pince transférer la lentille dans une petite gouttede tampon TD (environ 200 ul) dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm.

2. Réalisation de chirurgie de la cataracte Mock

1. Orienter la lentille dans la goutte de tampon TD dans la boîte de 35 mm avec la face antérieure de la lentille vers le haut.
   Remarque: La antérieure de la lentille est facilement identifié par la présence d'un anneau dense dans le tissu qui prend note de la frontière entre la partie antérieure et région équatoriale de l'épithélium de la lentille. En revanche, il existe une absence de marquage sur la partie postérieure de la capsule du cristallin à laquelle les cellules de fibres de verre sont fixés.
2. L'utilisation de deux pinces de haute précision font une petite incision (environ 850μm) dans le centre de la capsule antérieure du cristallin, la membrane basale épaisse qui entoure le tissu de lentille, et son épithélium de lentille antérieure associée, en saisissant le tissu avec une pince dans chaque main et tirant doucement dans des directions opposées.
3. Retirer la masse cellulaire de la fibre, ce qui constitue l'essentiel du tissu de lentille, dislodging il de ses attaches à l'épithélium de la lentille et entourant capsule du cristallin par hydro-élution (une approche utilisée dans la chirurgie de la cataracte classique, calqué sur la figure 1A).
4. Remplir une seringue de 1 ml avec une pointe d'aiguille de 27,5 G avec 300 pi de tampon TD. Insérer la pointe de l'aiguille dans l'incision pratiquée dans la capsule antérieure du cristallin, et à mi-chemin dans l'objectif.
5. Appuyer doucement la seringue injecter le tampon de TD dans la masse cellulaire de la fibre de verre. Injecter entre 50 et 200 pi TD, et jamais plus de 300 pi. Respecter la masse cellulaire de la fibre se desserrer de l'épithélium et capsule du cristallin.
6. En utilisant des pinces de haute précision, retirer la masse cellulaire des fibres desserré de la lentille à travers le site de l'incision antérieure.
   Remarque: Cette procédure laisse la lentille de la capsule postérieure de la membrane basale à laquelle les cellules des fibres avaient été attachés dénudée de cellules, et un épithélium de lentille blessé juste à côté de ce site.

3. Preparing Lens blessés pour Culture ex vivo

1. Aplatir le sac capsulaire du cristallin qui résulte de l'opération de la cataracte décrit ci-dessus sur la boîte de culture, jusqu'à côté de la cellule, en faisant cinq découpes dans la face antérieure du sac capsulaire.
2. Couper perpendiculaire au site de l'incision initiale par rapport à l'équateur de la lentille. Aplatir les résultants cinq «volets» de capsule du cristallin par un épithélium attachée sur le côté plat de la culture de la capsule vers le bas, la cellule vers le haut. Notez la lentille ex vivo blessés aujourd'hui devrait prendre sur une étoile ou une forme en fleur (voir la figure 1B).
3. Pour sécuriser la capsule à l'antenne, appuyez doucement vers le bas avec la pince à chaque point de l'étoile. Cela fera une petite empreinte sur les cinq conseils les plus à l'extérieur de l'expiant et aboutir à la fixation soutenue à l'antenne.
   Remarque: Il est possible d'endommager la capsule lors de cette procédure et il est donc important d'assurer la capsule à l'antenne au plus près les conseils de la flaps que possible, ainsi que de faire le moins de points de fixation que possible (généralement deux, maximum de trois par lambeau).
4. Retirez le tampon de TD à partir du plat 35mm et le remplacer par 1,5 ml de milieu préchauffées. Couvrir le plat 35mm avec son couvercle et le placer dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO _2).

4. Séparation de la Zone Central Migration (CMZ), où Re-épithélialisation de la zone de blessés de la Capsule Postérieure se produit, à partir de la pièce jointe d'origine Zone (OAZ) de cellules épithéliales d'objectif, pour l'analyse quantitative.

Remarque: Les cellules commencent à se déplacer dans la région CMZ immédiatement en réponse à une blessure. Par jour dans la culture suffisamment de cellules migrent à travers le CMZ pour l'analyse moléculaire et biochimique, après la séparation de la CMZ et OAZ par micro-dissection ^23. Ce protocole implique l'élimination d'un volet (OAZ) à la fois à partir de la zone blessée de la capsule.

1. Observer un demarcation, clairement visible sous le microscope de dissection, entre le OAZ et CMZ (voir Figure 2A). En utilisant deux pinces de haute précision, saisir avec les deux pinces sur le bord de la ligne OAZ / CMZ, un juste à côté de l'autre, de chaque côté de la ligne (voir Figure 2A, B, flèche).
2. En utilisant une main / une pince sur le côté CMZ continuent à tenir sur la culture blessés, tandis que de l'autre main / pince, tirez doucement le long de la ligne OAZ OAZ / CMZ. Le CMZ sépare facilement de la OAZ long de cette ligne. Continuez le long de cette ligne tout autour de la culture jusqu'à ce que les deux régions sont complètement séparés.
3. Étudier les Oaz et CMZ fractions séparées pour l'analyse moléculaire telles que ²⁴ ou biochimique analyse de l'ARN-Seq tels que Western blot ou co-immunoprécipitation ^23,25.

Ex Vivo modèle créé pour étudier le processus de cicatrisation des plaies dans microenvironnement natif des cellules

Pour étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la cicatrisation d'un épithélium sein microenvironnement natif des cellules, un ex vivo maquette modèle de chirurgie de la cataracte cliniquement pertinente a été créé. Ce modèle est créé à partir de tissus de verre qui offre de nombreux avantages en raison de ses propriétés intrinsèques: 1) la lentille est un organe autonome entouré par une membrane basale épaisse appelé la capsule du cristallin; 2) il est avasculaire, 3) non innervé et 4) exempt de stroma associé. Par conséquent, le processus de réparation examiné est limitée à des cellules qui sont innée de la lentille correspondant. Pour créer ce modèle, les lentilles sont supprimés à partir d'un embryon (E) 15 jours d'embryon de poulet (figure 1A). Une petite incision est faite dans la capsule antérieure du cristallin et les cellules epitheliales du cristallin associées à travers laquelle la masse de cellules de la fibre de verre est enlevéepar hydro-élution, une procédure de cataracte classique qui crée une blessure physiologiquement pertinente (Figure 1A). L'épithélium de la lentille, qui est présent sous forme d'une monocouche continue de cellules le long de la partie antérieure et des aspects équatoriales de la capsule de la lentille autour de la masse cellulaire de la fibre, en même temps que sa population endogène de progéniteurs de cellules mésenchymateuses de réparation vimentine riche ^1, restent dans la lentille au cours de la extraction des cellules de la fibre (figure 1A). Après l'élimination de la masse cellulaire de la fibre, cinq coupes sont faites dans la face antérieure de la capsule du cristallin et l'épithélium cellulaire aplatis vers le haut, en regard du support. Cette procédure permet l'imagerie de la réponse de l'épithélium lésé par diverses méthodes microscopiques, y compris microscopie time-lapse (Vidéo 1). Ces coupes supplémentaires dans la capsule antérieure du cristallin créent un explant étoiles-forme de la lentille blessé avec la plaie circulaire créé par la suppression de la masse cellulaire des fibres dans le center de l'explant (figure 1B). Post-chirurgie de la cataracte et l'aplatissement du tissu, l'épithélium blessés se trouve dans les points de l'étoile, qui est considéré comme la pièce jointe d'origine Zone (OAZ) (figure 1A, B).

L'élimination de la masse cellulaire de la fibre à partir de son site de fixation sur la capsule postérieure du cristallin crée une zone de plaie hautement reproductible sur la membrane basale, entouré par l'épithélium blessés (Figure 1B, C). Le bord exposé de la lentille épithélium équatorial, juste à côté de l'endroit où les cellules ont été fixées de fibres, est le bord d'attaque de la plaie. Immédiatement après une blessure, une sous-population de cellules de réparation mésenchymateuses vimentine riche est activé et migre vers le bord de la plaie de l'épithélium ^1. L'épithélium de la lentille, avec ces cellules mésenchymateuses de réparation à leur bord d'attaque, se déplace rapidement sur la zone exempte de cellules du b endogèneasement capsule à membrane, la Zone Central Migration (CMZ), pour commencer la guérison de la plaie. les cellules épithéliales de l'objectif se déplacent collectivement, comme une feuille, dans la CMZ dirigée par les cellules mésenchymateuses chef ^1, qui étendent saillies le long du substrat et de diriger le processus de cicatrisation des plaies (F IGURE 1D, Vidéo 1). La cicatrisation des plaies progresse, couvrant une surface significative de la plaie (67%) par jour dans une culture (Figure 1C), et est généralement achevée dans les 3 jours de culture (Figure 1B, C).

Une distinction physique claire peut être faite entre les régions et Oaz CMZ dès le jour 1, qui est délimitée comme un pli, ni ride, entre ces deux zones (Figure 2A, flèche). Ce phénomène constitue une ligne directrice permettant de séparer ces domaines au tout moment pendant le processus de cicatrisation des plaies. En utilisant une pince fine à bout, les cultures peuvent être micro-disséqués pour séparmangé les régions Oaz et CMZ afin d'analyser les différences moléculaires entre ces zones distinctes (figure 2B). Ceci est une approche puissante qui a été utilisé pour identifier les changements spécifiques à la migration associés à la blessure de réparation. Auparavant, il a été constaté qu'il ya une augmentation de la kinase d'adhésion focale (FAK) activation dans les ex vivo cultures blessés au cours de la cicatrisation des ⁵ guérison. FAK a un rôle bien établi dans la migration cellulaire ^26-29. La capacité d'enrichir de l'OAZ vs CMZ maintenant a permis d'examiner si cette augmentation de l'activation FAK est spécifique à la région CMZ propre aux migrations. Pour cette étude, les régions Oaz et CMZ ont été séparés le jour 1 - 3 (tout au long du processus de cicatrisation) et analysés pour des changements biochimiques dans l'activation FAK (FAK pY397). Les résultats ont démontré que l'augmentation de l'activation de FAK était associée à la région spécifique CMZ-migration (figure 2C). Leex vivo système modèle décrit ici offre une occasion unique et inestimable dans lequel pour enquêter sur les programmes moléculaires impliqués dans la coordination du processus de réparation des plaies.

Figure 1. Création d'un modèle ex vivo dans lequel pour étudier le processus de cicatrisation de la plaie à l'intérieur de micro-environnement natif des cellules en réponse à une blessure physiologique. Chirurgie de la cataracte Mock E15 a été réalisée sur des lentilles de poulet. La masse de cellules de fibre de verre (blanc) est enlevé par une incision dans la capsule antérieure par hydro-élution. Ce processus laisse les cellules épithéliales (en vert) qui restent fortement adhérente à la capsule du cristallin et une membrane basale cellule-dénudé (BM) sur lequel les cellules migrent à guérir la plaie (A). Cinq coupes sont faites à l'épithélium à aplatir et de créer une forme d'étoile ex vivo culte ure (B). Les cellules épithéliales résiduelles lentille qui remplissent les points de l'étoile sont désignées comme la pièce jointe d'origine Zone (OAZ) (A, B). La BM dénudée sur laquelle les cellules vont migrer est appelé la zone centrale migrations (CMZ) (A, B). Immédiatement à la suite d'une blessure, les cellules commencent à se déplacer dans la région CMZ sur la BM dénudée cellulaire (B). La zone de la plaie ouverte est quantifié dans le temps (C). La cicatrisation des plaies est généralement complétée par D3 en culture (B, C). En (B, C) ​​T0 désigne moment de la blessure, D1-3 dénote Jours 1-3. De la CMZ, deux populations de cellules peuvent être distingués, les cellules épithéliales de la lentille et les cellules mésenchymateuses de tête qui localisent au bord de la plaie, l'extension des saillies le long du substrat (D). Ce chiffre est reproduit à partir Menko et al ^23.target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Séparation des régions Oaz CMZ et à identifier les changements spécifiques de migration associés à la cicatrisation des plaies. Le jour 1, les régions Oaz CMZ et peuvent être distinguées les unes des autres par un pli (flèche), qui peut être utilisé comme un guide pour séparer ces zones (A). A ce pli, pince fine à bout peuvent être utilisés pour saisir le bord de la ligne OAZ / CMZ. La culture peut être séparé le long de cette ligne permettant l'isolement des régions Oaz et CMZ (B). Micro-dissection de la CMZ OAZ et par jour, de 1 (D1) - jour 3 (D3) a été effectuée pour déterminer si des changements spécifiques à la migration dans l'activation FAK se produisent dans la région de la réparation des plaies. Lysats de chaque région ont été examinés par analyse de Western blot pour une activation en FAK (pFAK Y397) ou totale de l'expression de FAK (C). Bien que peu de changement dans les niveaux de FAK totaux a été observée, une augmentation de l'activation FAK a été associée à la région spécifique CMZ-migration (C).

Vidéo 1. Cicatrisation des plaies dans la ex vivo maquette modèle de chirurgie de la cataracte est suivie par microscopie time-lapse de temps 0 après une blessure jusqu'au jour 3. Fermeture de la plaie est vu depuis le centre de la zone de la plaie.

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryonic lenses requires developing skills in the handling of small tissues that can be acquired with practice, as the embryonic lenses are only about 2mm in diameter. The cataract surgery procedure is performed under the dissecting microscope, and the critical technical steps include making a small incision in the anterior capsule, removing the fiber cell mass by hydro-elution, and making additional cuts in the anterior epithelium that make it possible to flatten the ex vivo post-cataract surgery lens tissue on the substrate to which it is pinned for study in culture. The microsurgical cataract surgery procedure produces a highly reproducible wound area, exposing a circular region of the tissue’s endogenous basement membrane onto which the injured epithelium migrates as it closes the wound. This model has been used to study mechanisms regulating wound repair of epithelia, including how the epithelial cells are able to move collectively into the wound area ³⁰ and the leader cell function of an endogenous vimentin-rich repair cell population of mesenchymal lineage at the wound edge^1,23.

This ex vivo wound model lends itself readily to live microscopic observation throughout the repair process including time-lapse imaging, and confocal image analysis following immuno-localization of proteins of interest. Making cuts in the anterior lens capsule so that the capsule with its attached injured epithelium can be flattened on the culture substrate makes such ease of observation possible. Including this critical step is essential for viewing the behavior of the response of the epithelial cells in the original zone of attachment and the movement of the injured epithelium onto the wounded area of the posterior capsule from the time of injury. A great advantage for biochemical or molecular biology analyses is that the cells that are associated with the basement membrane in the original attachment zone (OAZ) can be separated by micro-dissection from those cells migrating across the wounded area of the basement membrane (CMZ) at any time during the wound repair process.

The mock cataract surgery wound repair culture model was established using lenses from E15 chick embryos. Alternatively, wound repair cultures can be successfully prepared using this protocol from lenses removed at other stages of chick embryonic development, and from lenses isolated from both adult mice and rats. While studies to date have focused on wound repair in the chick embryo lens model, in part because of the ease in obtaining large numbers of age-matched tissue for experimental analysis, there is no reason that would prevent this protocol from being used with lenses isolated from any species. However, it is widely recognized in the literature that wound repair in the embryo often occurs more quickly and with less scarring than in the adult ^31-35. The wound repair cultures presented here are typically grown in the absence of serum to maintain conditions close to the in vivo microenvironment, suggesting that the factors that promote wound healing are provided by components of that environment including ones produced by the cells themselves. However, wound repair in this culture model also occurs effectively in defined media conditions, and can be modulated by including specific pharmaceutical inhibitors in the culture media ^5,23,30, or knocking down expression of proteins through an siRNA approach ²³. Note that inclusion of serum in the culture media induces movement of the cells from the cut edges on the outside of the flattened explant onto the tissue culture substrate, while in serum-free medium the cells remain associated with the capsule and migrate only onto the wounded area of the basement membrane of the lens capsule. The approach of adding serum to the media can be an advantage if one desires to examine the behavior of the wounded epithelium as it moves onto different substrates. To that end, there are other options that can be taken to alter the environment for wound repair that includes use of alternate tissue culture substrates on which to pin the tissue following the mock cataract surgery, such as substrates with defined rigidities as can be provided by collagen or acrylamide gels. While the ex vivo mock cataract surgery cultures can be facilely pinned to tissue culture plastic, collagen gels, or acrylamide gels, affixing the cultures to glass substrates has proven difficult. An important adaptation of this wound repair model to consider is its usefulness for re-injury studies. In this approach a scrape wound is inflicted on the healed lens epithelium after wound repair is completed, which removes an area of the lens epithelium from its underlying basement membrane capsule. This re-injury can be performed in either the original zone of attachment of the epithelium to the lens capsule or in the central migration zone where the epithelium has healed the initial wound area.

A great advantage to this wound-repair model is that the lens is an avascular tissue, not innervated without an associated stromal compartment, thus creating an ideal reductionist model of wound repair. As such, this model allows for examination of the native wound repair process under conditions in which only cells and microenvironment that are intrinsic to this epithelial tissue can modulate the repair process. In order to examine the role of cells that could be recruited following injury from neighboring vasculature or stromal compartments, it would be necessary to add such cells to the culture environment.

In previous culture wound models, the major limitation to investigating how an epithelial tissue responds to wounding is that most are limited to examining cells, often cell lines, plated on tissue culture plastic. Popular models using this approach, such as the scratch wound assay, have provided significant insight into how cells migrate to fill an area of the culture dish from where the cells have been removed. However, in these scratch wound studies the movement of cells onto the exposed area of the culture substrate occurs in the absence of many of the dynamic wound response signals that regulate wound healing in vivo. Therefore, the most important advantage of the mock cataract surgery culture model is that wound repair can be studied ex vivo within the cells’ native microenvironment and the endogenous signals originating from the underlying matrix, growth factors, cytokines and repair cell subpopulations. As this new wound repair model makes it possible to examine and manipulate the response of an epithelium to wounding in its native microenvironment, it is likely to have many applications, and holds great promise as an ideal system for revealing the molecular-mediators of wound-repair.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).