Используя антиген капсида-РЕГИСТРАЦИИ Стратегию развития подходов аденовируса серотипа 5-Vectored вакцин

Здесь мы приводим протокол для создания типа двухвалентный аденовирус 5 (Ad5) вектор доказательство из-принцип Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ с использованием стратегии антиген капсида-регистрации. Этот вектор был продемонстрирован демонстрируют качественное пригодность, возможность избежать Ad5-положительные сыворотки в пробирке, и антигенность, а также иммуногенность к объединенной антигенов.

Аденовируса серотипа 5 (Ad5) была значительно изменена с традиционными методами трансгенных по разработке вакцин. Сокращение полезного действия этих традиционно модифицированных векторов Ad5 в клинических испытаниях может быть, прежде всего, коррелирует с Ad5 уже существующей иммунитета (PEI) среди большинства населения. Способствовать развитию вакцины Ad5-векторная по решению обеспокоенность Ad5 PEI, была использована инновационная стратегия антиген капсида-Включение. По заслугам этой стратегии, Ad5-векторная мы сначала построили трансфер Hexon плазмиды _{HVR1-Kwas-HVR5-6} / Его pH5S субклонированием гипервариабельный область (HVR) 1 из Hexon в построенной ранее трансфер плазмиды _HVR5-6 / Его pH5S, который имел Его ₆ тега включены в HVR5. Этот фрагмент ДНК, содержащий HVR1 ВИЧ эпитоп ELDKWAS был синтезирован. _{HVR1-Kwas-HVR5-6} / Его pH5S тогда линеаризуется и котрансформируют с линеаризованной плазмиды основой pAd5 / ΔH5 (GL),для гомологичной рекомбинации. Это рекомбинации плазмиды pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ трансфицировали в клетки, чтобы генерировать вирусный вектор Ad5 / _{H5-HVR1-Kwas-HVR5-6} Его. Этот вектор был проверен, чтобы иметь качественный пригодность указанную вирусной физическое титра (VP / мл), инфекционный титр (IP / мл) и соответствующее отношение / IP VP. Оба эпитоп ВИЧ и его ₆ тега были экспонированы на поверхности капсида на Ad5, и сохранил эпитоп конкретного антигенность самостоятельно. Нейтрализация анализ показал способность этого вектора двухвалентного обойти нейтрализации Ad5-положительные сыворотки в пробирке. Иммунизация мышей показали поколение надежной гуморальный иммунитет, специфичные для эпитопа ВИЧ и его _6. Это доказательство правильности принципа исследование показало, что протокол, связанный со стратегией антиген капсида-Регистрации может быть реально использованы для генерации Ad5-векторной вакцины, изменяя различные белки капсида. Этот протокол может быть даже Further модифицированы для генерации редких серотипа аденовирусов векторная вакцин.

Аденовируса человека (БА) является среднего размера, не охватило вирусов с икосаэдрического нуклеокапсиде содержащей двухцепочечной ДНК генома. Объявление принадлежит к семейству Adenoviridae, с классификацией в семи группах (A через G). Каждая группа содержит вирус различных серотипов. Из которых, аденовирус серотипа 5 (Ad5) из группы С был наиболее широко изучены и наиболее широко применяется для векторной подходов, таких как генной терапии и вакцинации.

Традиционная стратегия трансген были разработаны и применены для Ad5 модификаций, которая характеризуется смещением вирусных ранних генов с генами из интересов и целенаправленной экспрессии гена-из-интерес у хозяина. Примерами являются строительство pENV9 / Ad5hrΔE3 путем замены раннего гена 3 (E3) с геном оборотов в Simian вируса иммунодефицита ^1, строительство AdCMVGag путем замены раннего гена 1 (Е1) с геном затычки иммунодефицита человекаВирус (ВИЧ) ^2, и строительство ас объявление Z путем замены E1 с ас Z гена ^3. Широкое применение в традиционной стратегии трансгенной на Ad5 зависит от следующих достоинств: широкий диапазон хозяев для Ad5, реализуемого генной инженерии на вирус и распространения вируса, большой размещения внешней гена вставки и безопасности Ad5 ^4,5. Тем не менее, снижение полезного действия Ad5-векторной клинической терапии с использованием этой стратегии была основным узким местом, которое было отображаются на в первую очередь связано с Ad5 PEI, так Ad5 настолько распространено среди большинства детей и взрослых ^4,6.

Чтобы преодолеть основную узкое Ad5, основная цель заключается в разработке альтернативной стратегии в обход Ad5 PEI. Врожденный иммунитет ^7, адаптивного иммунитета, такие как нейтрализующие антитела (NABS) ^8-10 и CD8 ⁺ Т-клеточных ответов против ¹⁰ Ad5 как было показано, совместноntribute к Ad5 PEI, с Ad5 NABS появляться играть доминирующую роль в взносов Ad5 PEI ^10,11. Кроме того, Ad5 NABS целевые эпитопы, локализованные в белков капсида, в том числе основной Hexon белка, волокна и Пентон базы. Из которых, Hexon является главной мишенью Ad5 NABS ^8,11-13. Основываясь на этих выводах, инновационная стратегия антиген капсида-Включение была введена. Это новая стратегия подчеркивает замену или включение белков интересов, на Ad5 белков капсида, которые посменно маскирует Ad5 нейтрализующие эпитопы, приводит к пониженной признания в NABS и эффективных администраций векторных Ad5. Стоит отметить, что эта стратегия является конкурентоспособной, потому что она также может помочь выявить хозяева надежную гуморальный иммунитет и клеточный иммунитет мощный непосредственно представляя антигены интересов, для иммунной системы ^4,14,15. Основываясь на этой стратегии, молекулярное клонирование и рекомбинантный вирусный вектор объявления спасение может быть структурно разделенна четыре основных этапа: (а) подготовка гена интересов, либо фрагментом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или синтеза; (Б) перевязка фрагмента гена в челночный плазмиды, содержащей ген интересов, фрагмент и гомологичные руки к аденовирусной позвоночника; (С) гомологичной рекомбинации путем совместного преобразования трансфер плазмиду, содержащую ген, представляющей интерес фрагмент с линеаризованной плазмидой магистральной pAd5 / ΔH5 (GL) ^16; (D) трансфекции линеаризованной рекомбинантной аденовирусной плазмидой, чтобы спасти рекомбинантный вектор объявление объединена с антигенами-на-интерес.

Наша группа и некоторые другие расширили эту альтернативную стратегию инкорпорации объявление для развития векторная вакцина против Ad различных инфекционных возбудителей. Мы сообщили поколение рекомбинантного вектора Ad Ad-HVR1-LGS-His ₆ -v3 путем включения His-меченый ВИЧ-1 антиген V3 в HVR1 локали Ad5 Hexon (hexon5). Это вызвало вектор срабатывает улOng гуморальный иммунный ответ на конкретный эпитоп V3 ^4. Мы также сообщили о разработке Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 путем включения ВИЧ-1 мембранного проксимального эктодомена область (MPER) в HVR2 локали hexon5 ^2. Кроме того, группа доктора Чжоу использовал преимущества этой стратегии инкорпорации объявления развивать серотип объявление 3 (Ad3), переносимые вакцины, то есть., Поколение вирусный вектор R1SP70A3 путем включения нейтрализующий эпитоп SP70 энтеровирусной 71 в HVR1 из Ad3 Hexon (hexon3). R1SP70A3 генерируется сильные NABS и производство IFN-γ, характерные для эпитопной SP70, которые приводят к высокой скорости защиты от энтеровирусов 71 вызов ^15.

Для технического руководства, наше исследование воспользовался качественной стратегии антиген капсида-Регистрации, чтобы сосредоточиться на генерации двухвалентного Ad5 вектор Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ путем включения ВИЧ-1 антигена в HVR1да Его тег в HVR5 из hexon5. Генерируется вирусный вектор был также иммунологически оценены. Стратегия антиген капсида-Включение могут быть использованы на развитие Ad5-векторной подходов вакцинации против различных инфекционных заболеваний.

Университет Алабамы в Бирмингеме институциональной использования животных и ухода комитета одобрили использование мышей, как описано в настоящем документе в рамках утвержденного протокола числа 101109272.

1. Генетическая Строительство модифицированной плазмидой pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ с антигеном капсидоподобные Регистрации стратегии

1. Строительство шаттла плазмиды _{HVR1-Kwas-HVR5-6} / Его pH5S
   1. Заказать плазмиды, содержащей ДНК-последовательность синтезировали HVR1-Kwas между сайты рестрикции AgeI в AccI гена hexon5.
   2. Дайджест 6 мкг синтезированного фрагмента (HVR1-Kwas) с ферментами AgeI (6 единиц) и AccI (6 единиц) в течение 3 часов при 37 ° С. Решение переваренной фрагмент в 2% агарозном геле методом электрофореза и очищают фрагмент с использованием набора для экстракции ДНК из геля в соответствии с протоколом производителя.
   3. На основании молярном соотношении вставки в вектор в 3: 1, используют ДНК-лигазы Т4 лигазы и бuffer лигировать 12 нг фрагмента (HVR1-Kwas) в 100 нг ранее построенной челночной плазмиды HVR5-His ^_6/17 pH5S в объеме 10 мкл при комнатной температуре в течение 2 ч, через сайты AgeI и AccI.
   4. Преобразование 1 мкл из 10 мкл продукта лигирования в 50 мкл электрокомпетентных клеток DH5 & alpha в электропоратора (1800 V). Добавить 950 мкл SOC среды трансформированных клеток DH5 & alpha и инкубируют смесь в течение 1 ч при 37 ° С, 300 оборотов в минуту. Распространение 100-200 мкл смеси 1 мл на Лурии-Бертани (LB) агар, содержащий канамицин, и инкубируют O / N при 37 ° С.
      1. На экран ~ 10 колоний от ПЦР направленные фрагмент HVR1-Kwas, смешать прямого праймера (TATGTGTGTCATGTATGCGT), обратный праймер (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) и одну колонию DH5 & в раствор смеси ПЦР мастер (в соответствии с протоколом производителя). Запуск образцов на амплификаторе со ссылкой на руководство, поставляемое с решением ПЦР мастер смеси,
      2. Используйте прямой праймер (TATGTGTGTCATGTATGCGT) для секвенирования фрагмента HVR1-Kwas в клонах экранированных в разделе 1.1.4.1.
2. Конструирование плазмиды pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆
   1. Дайджест 6 мкг HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ / pH5S с ферментами EcoRI (6 единиц) и PmeI (6 единиц) в течение 3 часов при 37 ° С, и очистить фрагмент, содержащий гомологичные рекомбинации оружие и двойной модифицированный ген hexon5, как указано в пункте 1.1.2. Линеаризуем магистральную плазмиды pAd5 / ΔH5 (GL) ¹⁶ с SwaI.
   2. Со-преобразования 100 нг целевого фрагмента из челночной плазмиды и 100 нг линеаризованной pAd5 / ΔH5 (GL) позвоночника в 50 мкл электрокомпетентных BJ5183 клеток для гомологичной рекомбинации в электропоратора (1800 V). Добавить 950 мкл SOC среды трансформированных клеток и инкубируют смесь в течение 1 ч при 37 ° С, 300 об. Распространение 100 - 200 мкл смеси 1 млна агаре LB, содержащей канамицин (конечная 50 мкг / мл) в течение O / N инкубации при 37 ° С.
      1. Pick ~ 10 крошечные колонии в 3 мл жидкой LB, содержащей канамицин (конечная 50 мкг / мл) в течение O / N инкубации на качалке (250 оборотов в минуту, 37 ° C). Экстракт плазмиды из культуры. Использование ПЦР-анализа на экран в 10 колоний путем воздействия на фрагмент HVR1-Kwas, как показано в шаге 1.1.4.1.
      2. На экран те же колонии от ПЦР анализа таргетирования пикс фрагмент магистральной генома, смешать прямого праймера (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), обратный праймер (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) и один BJ5183 колонию в раствор смеси ПЦР мастер (в соответствии с протоколом производителя). Запуск образцов на термоциклере, ссылаясь на руководстве, прилагаемом к решению Master Mix ПЦР.
      3. Назначить дважды положительные колонии ПЦР в качестве pAd5 / _{H5-HVR1-Kwas-HVR5-6} Его.
   3. Transform 100 нг плазмиды pAd5 / _{H5-HVR1-Kwas-HVR5-6} в Егов DH5 & клетки, как показано в шаге 1.1.4.
      1. Использование ПЦР-анализа на экран ~ 10 колоний путем охвата фрагмента HVR1-Kwas, как показано в шаге 1.1.4.1.
      2. Использование ПЦР-анализа на экран те же колонии путем воздействия на PIX фрагмент магистральной генома, как показано в шаге 1.2.2.2.
      3. Используйте прямой праймер (TATGTGTGTCATGTATGCGT) для секвенирования фрагмента HVR1-Kwas в pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6.

2. Подготовка модифицированной Ad5 вирусный вектор Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆

1. Представляют собой полное среду, добавив FBS (конечная 10%), 100X Номера незаменимых аминокислот (конечная 0,1 мм), 200 мм L-глутамин (конечная 2 мм) и раствор пенициллина / стрептомицина (конечная 1%) в DMEM с высоким содержанием глюкозы , Поддержание человеческих эмбриональных почек (НЕК293) клеток в полной среде в культуре инкубаторе (37 ° C и 5% CO2 при 85% влажности условий).
2. Спасение вирусной вет е р Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆
   1. Семенной 3,0 х 10 ⁶ клеток НЕК293 в одном Т-25 колбу, содержащую 5 мл полной среды и культуры O / N для достижения монослоя с 80% слияния.
   2. Линеаризовать 15 мкг pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ в объеме 100 мкл с использованием рестрикционного фермента PacI (15 единиц) при 37 ° С в течение 3 часов.
      1. Экстракт линеаризованный pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ центрифугированием реакцию дважды (10000 мкг в течение 1 мин) с равным объемом фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (соотношение при 25: 24: 1) в вытяжном шкафу и последовательным центрифугированием (10000 х г в течение 10 мин) с смешанным раствором (300 мкл 100% -ного этанола и 10 мкл ацетата натрия) и 700 мкл 70% этанола. Удалите супернатант в каждой стадии центрифугирования.
   3. Ресуспендируют в очищенной плазмидной ~ 40 мкл дистиллированной воды или Трис-ЭДТА (ТЭ) буфера. Количественного определения ДНК плазмиды путем измерения оптической деnsity (ОД) при 260 нм.
   4. Трансфекции 3 мкг линеаризованной плазмиды с коммерческой липосомальный трансфекции реагента в Т-25 колбу, в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Изменение трансфекции среду с полной среде в течение 6 часов после трансфекции и последующей инкубации в культуральной инкубаторе. Поддержание трансфекции клеток с помощью замены не полный среду каждые два-три дня, пока индивидуального вирусные бляшки форме.
   5. При бляшки развиваются до полного цитопатического эффекта (CPE), очистить оставшиеся клетки выключения колбу в стерильных капот, и урожай клеточный лизат центрифугированием среды при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Приостановка осадок клеток в ~ 1 мл среды, содержащей 2% FBS, и разорвать клетки путем замораживания-оттаивания в четыре раза. Собирают супернатант, содержащий вирус спасены после центрифугирования лизата при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
3. Масштаб распространения Большая часть вирусного вектора Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆
   1. Размножаются йе вирус в Т-75 колбу, содержащую клетки HEK293 в стерильных капот, заражая 1/3 до полной лизата от Т-25 колбу. Разрешить полный CPE развивать в течение двух-трех дней в культуральной инкубатора. Урожай лизата супернатант, как указано в шаге 2.2.5.
   2. Распространять вирус в 2:59 Т-175 колб в стерильных капот путем инфицирования с 1/2 до полного лизата от Т-75 колбу, в зависимости от условий распространения вируса. Разрешить полный CPE развивать в течение двух-трех дней в культуральной инкубатора. Урожай лизата супернатант, как указано в шаге 2.2.5.
   3. Распространять вирус в одном или нескольких десятков Т-175 колб в стерильных капот путем инфицирования с 1/2 до полного лизата из предыдущего Т-175 колбы (ов). Определить количество использования колбу на основе условий распространения вируса и количество вируса в этом нуждается. Урожай лизата супернатант, как указано в шаге 2.2.5, когда полный CPE происходит в течение двух-трех дней в культуральной инкубатора.
4. Purification из Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ хлорид цезия
   1. Приготовьте два плотности растворов CsCl в 5 мМ HEPES: 1,33 г / мл и 1,45 мкг / мл, в то время избегая контакта с CsCl.
   2. Загрузка 4 мл CsCl (1,33 г / мл) в стерильном ультрацентрифужную пробирку и осторожно загружают 4 мл CsCl (1,45 г / мл) против нижней части трубы. Нагрузка 4 мл лизата надосадочной жидкости медленно в верхней части градиентов в стерильных капот.
   3. Центрифуга трубки на 110000 х г в течение 3 ч при 4 ° С для отделения зрелого / нижний вируса группа из дефектного вируса / высшего диапазона. Соберите нижнюю полосу с помощью шприца 3 мл вооруженный 33 G иглы и разбавить группу с 5 мМ HEPES с объемом 4 мл в стерильных капот.
   4. Загрузка другую трубу с двух плотностей растворов CsCl и разбавленный полосы вируса, как описано в шаге 2.4.2. Центрифуга трубки на 110000 х г O / N при 4 ° С. Соберите группу вирусной, как описано в шаге 2.4.3.
   5. Вводите собранный вирус решение в dialysэто кассета с помощью шприца 3 мл вооруженный 33 G иглы в стерильной крышкой.
   6. Поместите кассету в 700 мл 1х буфера для диализа (1 л Рецепт: 100 мл 10х PBS, 100 мл 100% глицерина и 800 мл дистиллированной воды; фильтровать буфера через фильтр 0,22 мкм) и заменить диализного буфера каждые 3 ч в 4 раза. Аспирата из Диализованные решение вирусов с помощью иглами шприца.

3. Проверка спасенных вирусный вектор

1. Вирусный вектор титрование
   1. Для вируса физической титра, развести как вирус и диализа буфера (фон контролю) на 1: 10 и 1: 20 в вирус буфера для лизиса (10% SDS в Трис-ЭДТА) в небольших трубок и инкубировать все трубы на 56 ° С в течение 10 мин.
   2. Включите в биофотометра и установите режим оптической плотности OD при 260 нм. Используйте разбавленный буфер диализа (1: 10), чтобы сбалансировать фонового сигнала, нажав кнопку "пустой" дно. Тип "10 + 90" в Биофотометре ЮКЖДееп, и читать сигнал разбавленного вируса (1: 10).
   3. Читайте сигнал разбавленного вируса (1: 20), следуя методу в шаге 3.1.2, а вместо этого ввести «5 + 95» на экране Биофотометре. Умножение двух чисел вирус считывания с помощью 1.1x10 ¹² и вычислить средний титр с блоком как VP / мл, в расчете на двух отдельных титров из двух разведений.
   4. Для вируса инфекционного титра (IP / мл), используйте Karber статистический метод TCID ₅₀ ^14, чтобы определить глубину поражения на НЕК293 на 10 дней после заражения (точек на дюйм)
2. Оценка антигенной индикатора экспозиции на вирусном векторе
   1. Пальто вирусный вектор в ELISA пластины и заполните остальные шаги в стандартном методе ELISA ^14. Использование человеческого анти-gp41 (2F5) моноклональное антитело (Mab) и мышиное анти-His тегов МКА для обнаружения соответствующих антигенов включены ^14.
   2. Решить вирусного вектора в denatuэлектрофорез красный белок гель (SDS-PAGE) и приступить к остальной части шагов в стандартном методе западного блоттинга ^14. Использование человеческого анти-gp41 (2F5) моноклональное антитело (Mab) и мышиное анти-His тегов МКА для обнаружения соответствующих антигенов включены ^14.
3. В пробирке оценки вектора на способность обойти Ad5-positve сывороток
   1. Поддержание HeLa клетки в полной среде в культуре инкубаторе (37 ° С и 5% СО ₂ при 85% влажности) условия. Представляют собой полное среды путем добавления FBS (конечная 10%), 200 мМ L-глутамина (конечная 2 мм) и раствор пенициллина / стрептомицина (конечная 1%) в минимальную поддерживающую среду Игла (MEME).
   2. Семенной HeLa клетки в 6-луночные планшеты при 1x10 ⁶ клеток / лунку, и инкубируют планшеты в культуре инкубаторе (37 ° С и 5% СО ₂ при 85% влажности условий) в течение 2 часов. Выдержите Ad5-положительные сыворотки (0,1 мкл или 0 мкл) с 5 IP / ячейки вирусного вектора (Ad5 или Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆₎ в культуральной инкубаторе в течение 1 часа перед добавлением смеси на 6-луночные планшеты, содержащие клетки.
   3. В 24 ч после инфекции (ИНН), промыть клетки один раз PBS и лизируют клетки в 0,5 мл буфера для лизиса. Центрифуга при 15000 х г в течение 5 мин и собирают супернатант. Смешайте 20 мкл супернатанта с 100 мкл субстрата люциферазы для чтения люциферазы сигнала, так вирусы содержат ген люциферазы.

4. Иммунологические оценка спасенных вирусный вектор

1. Подготовьте две группы иммунизации: Ad5 и Ad5 / _{H5-HVR1-Kwas-HVR5-6} Его.
   1. Вводите мышей (п = 8 / группа) внутримышечно вирусов на 1х10 ¹⁰ VP / мышь, в гомологичной "премьер-наддува" режима иммунизации, с интервалом в 2 недели.
   2. В 2 недели после каждой инъекции, кровотечение мышей без анестезии щеке кровотечение ланцеты животных (5 мм длины наконечника) дособирать кровь в 1,5 мл пробирки.
2. Смешайте кровь в пробирках путем инвертирования вверх и вниз, и инкубируют в крови при комнатной температуре в течение 30 мин. Спин трубки при 10000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и передачи сывороток (верхний слой) к новым 1,5 мл пробирки.
   1. Спин новые трубок при 10000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и передачи сывороток вновь отмечены в 1,5 мл пробирки для хранения при -80 ° С.
3. Оценка антиген-специфического гуморального иммунитета сыворотками основе ELISA
   1. Развести Его пептид (акции на 1 мм) и ВИЧ-1 пептид (акции на 1 мм) отдельно в 100.
   2. мМ карбонатный буфер (рН 9,5), чтобы достичь концентрации пептида покрытия при 10 мкМ. Покрывают пластинки ELISA с разбавленных пептидов отдельно добавлением 100 мкл на лунку и инкубации планшетов O / N при 4 ° С.
   3. Промыть пластины с PBST четыре раза при 200 мкл / лунку и блока в течение 1 ч в 5% BSA в PBST. Применение сыворотки мышей к пластинам на разведение 1: 100 в блокирующем BUFфер, 100 мкл / лунку. Инкубируют в течение 2 ч инкубации при комнатной температуре.
   4. Вымойте тарелки с PBST четыре раза. Блок пластин путем инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин в блокирующем буфере при 100 мкл / лунку.
   5. Применение антимышиного IgG-HRP (1: 5000 в блокирующем буфере) в количестве 100 мкл / лунку, чтобы обеих пластинах, покрытых пептидом и его ВИЧ-1 пептида по отдельности. Инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Вымойте тарелки с PBST.
   6. Read пластин при OD450 нм после инкубации с HRP субстрат в течение 30 мин.

Стратегия антиген капсида-Включение (1А) была использована, чтобы генерировать двухвалентное Ad5 вирусный вектор Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Во-первых, трансфер плазмиды HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ / pH5S был построен субклонированием HVR1-Kwas фрагмент в предыдущем построен трансфер плазмиды HVR5-Его ^_6/17 pH5S. Во-вторых, плазмиду pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ ¹⁴ был построен в гомологичной рекомбинации между фрагментом "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR5-His6-PmeI" и SwaI-линеаризованной pAd5 / ΔH5 (GL ) ¹⁶ (Фиг.1В). Трансфекция PacI переваривается pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ в колбе приводят к спасению вирусного вектора Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ ¹⁴ Т-25. Спасены вирусный вектор был затем размножают в большом масштабе и очищали с помощью двух циклов CsCl ультрацентрифугирования в градиенте.

Чтобыпродемонстрировать жизнеспособность / пригодность спасенного вирусного вектора Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6, физическое титр определяемой на 1,3 х 10 ¹¹ VP / мл путем измерения физических копий вирусного генома, и инфекционные титр определяется на уровне 1,4 · 10 ⁹ / мл IP титрованием фактические инфекционных вирусных частиц. Впоследствии отношение В.П. / IP был рассчитан на 92 ^14. Обычно, объявление с коэффициентом В. П. / IP ниже 1000 указывает на качественное пригодность этого вируса. Для того чтобы продемонстрировать, отображает ли этот вирус спасены антигенную антиген ВИЧ и Его тег, соответственно, на поверхности вирусный капсид основной белок hexon5, ELISA была проведена с человеческим 2F5 монАТ и мышиное анти-His тегом мАт, соответственно. Результаты показали, что оба человек 2F5 МКА (2А) ¹⁴ и мышиное анти-His метка МКА (2В) ¹⁴ показали связывание с Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Его 6, в то время как там было никакого связывания с отрицательной Controл вектор Ad5. Вестерн-блот анализ был использован для подтверждения данных в ELISA, и как человека 2F5 мАт (фиг.2с) ¹⁴ и мыши анти-His меткой мАт (рис 2D) ¹⁴ обнаружена определенные полосы вокруг 117 кДа только в вируса Ad5 / H5- HVR1-Kwas-HVR5-His _6, что соответствует размеру hexon5 белка. Для того, чтобы оценить потенциал Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ в обход нейтрализации Ad5-положительной сыворотки, анализ нейтрализации анализ проводили, как указано в разделе 3.3 протокола. Результаты показали, что относительная люминесцентные блок (RLU) сигнал от вирусного вектора, обработанного Ad5 0 мкл Ad5-positve сывороток в 12 раз выше, чем из того же вектора обрабатывают 0,1 мкл Ad5-positve сывороток (P <0,001 значения ). Это указывает на нейтрализацию вектора Ad5 по Ad5-positvive сывороток. В отличие от этого, не было большой разницы от вирусного вектора Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆обрабатывали 0 мкл и 0,1 мкл Ad5-positve сывороток (рис 3). Так Hexon является главной мишенью Ad NABS и Hexon конкретных нейтрализующие эпитопы находятся во всех HVRs в Hexon ^12,18, данные выше показано, что Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ избежали нейтрализации Ad5-positve сывороток в пробирке и предложил потенциала Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ на обход Ad5 PEI в хозяине.

Чтобы исследовать ли изменен двухвалентный Ad5 вирусный вектор со стратегией капсидоподобные Регистрации антигена может вызвать надежную гуморальный иммунитет, определенные для зарегистрированных антигенов-на-интересов, "прайм-импульс" режим иммунизации применяется для иммунизации мышей с управлением вирусный вектор Ad5 и двухвалентный вектор Ad5 / _{H5-HVR1-Kwas-HVR5-6} Его. Сера на основе ELISA покрывали ВИЧ-1, показали, что пептид сыворотки иммунизации группы Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ была significanт связывание с ВИЧ-1 пептида при разведении от 40 до 640, по сравнению с сывороткой от контрольной группы (р значение <0,001) (рис 4а) ^14. Сера на основе ИФА покрыты Его пептида показал, что сыворотка от иммунизации группы Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ было значительное связывание с Его пептида по сравнению с сывороткой от контрольной группы, а статистической стоимости р < 0,001 на разведении сывороток 40 и 80, р <0,01 значения при разведении 160 и значение р <0,05 в разведении 320 (рис 4В) ^14. Приведенные выше результаты указывают на генерацию гуморального иммунного ответа против объединенных антигенов на двухвалентного вирусного вектора.

Рисунок 1. Схематическое изображение генетического строительства плазмиды pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ со стратегией антиген капсида-Регистрации, () Стратегия антиген капсида-Включение характеризуется непосредственно отображать антиген-на-проценты по белков капсида (Hexon, пента базовых, пикс и / или волокна) аденовируса. Эта цифра была взята из Nemerow и др., 2009, Virology 384 (2009) 380-388, Elsevier авторских прав. (B) фрагмента гена (HVR1-Kwas) был синтезирован и клонирован в вектор PUC компанией. Этот фрагмент субклонировали в ранее построенной челночной плазмиды _HVR5-6 / Его pH5S по рестриктазами AccI и AgeI генерировать HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ / pH5S. Полученную трансфер плазмиду переваривали ферментами EcoRI и PmeI и со-трансформированной SwaI-линеаризованный основой плазмиды pAd5 / ΔH5 (GL) для гомологичной рекомбинации, в результате генерации рекомбинируют основой плазмиду pAd5 / h5-HVR1-Kwas -HVR5-His _6. На этом чертеже, R1 обозначает HVR1 и R5 обозначает HVR5 и GL обозначает зеленый флуоресцентный белок (GFP) и lucifeрасе, отдельно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Оценка антигенной экспозиции включены антигенов на поверхности капсида двухвалентной вирусного вектора Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Всего вирусный вектор ELISA проводили для определения, если включены антигены были выставлены на вектор Поверхность сохраняя антигенные характеристики самостоятельно. ELISA-планшеты покрывали вектора двухвалентного, и инкубировали с человеческой 2F5 мАт (А) или мышиное анти-His мАт (B). Данные показали значительное связывание антител к вектору двухвалентного, а не к контрольным вектором Ad5. R1-R5-Kwas-His ₆ обозначает Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Вестерн-блот анализ был проведен, чтобы подтвердить антигенного связывания человеческого 2F5 мАт (С) или мышиное анти-His мАт (D) к объединенной антигенов на вектор двухвалентного. В обоих (C) и (D), дорожка 1 показывает Ad5, а полоса 2 указывают Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Оценка способности двухвалентных вирусный вектор, чтобы избежать нейтрализации Ad5-positve сыворотки в пробирке. Анализе нейтрализации проводили для определения, если вектор двухвалентного могли избежать нейтрализации. Результаты показали, нейтрализацию вируса Ad5 сывороткой, но ESмыс нейтрализации вируса двухвалентный в пробирке. На этом рисунке, _R1-R5-Kwas-6 обозначает Его Ad5 / _{H5-HVR1-Kwas-HVR5-6} Его. Звездочки *** обозначает р <0,001 значение.

Рисунок 4. В естественных генерации гуморального иммунитета к двухвалентной вирусного вектора в модели мышей. Сера на основе ELISA использовали для оценки гуморального иммунитета против объединенных белков на двухвалентного вектора Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ , ВИЧ-1 пептид (А) и его пептид (В) были покрыты в пластинах ELISA отдельно, а затем инкубации с сывороткой мышей из обеих групп иммунизации (Ad5 и Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆₎ , Данные указывают на значительное образование гуморальных иммунных реакций против ВИЧ-1 антигена в HVR1 () и его тег в HVR5 (Б). Каждая точка данных представляет средства и SD от восьми репликантов. Звездочки *** обозначает р <0,001 значение ** обозначает р <0,01 значение, и * обозначает р значение <0,05.

Применение традиционной стратегии трансгенной о внесении изменений Ad5 для разработки вакцин была ослаблена в первую очередь из-за узкого связанного с Ad5 PEI ^4,6. Это узкое может быть частично уменьшена путем применения альтернативных антиген капсида-Включение стратегии (рис 1А), так как это стратегия может уклониться от нейтрализации Ad5 NABS заменой нейтрализующие эпитопы Ad5 с антигенами интересов, и способствовать поколение надежной иммунитета к объединенной антигенов-на-интерес. В этом исследовании, поколение модифицированной двухвалентный вирусного вектора Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ был введен в качестве концептуальной примере (рис 1B). В соответствии с разделе 1.1.1 протокола, синтезированного фрагмента в упорядоченной плазмида содержит ВИЧ-1 gp41 короткий замена гена в HVR1 местности из hexon5. Частичная gp41 ген кодирует эпитоп ELDKWAS, который заменяетчастичная HVR1 из аминокислот 139 до 144 hexon5 ^14. ELDKWAS является мощным нейтрализующим эпитопом в ВИЧ-1 gp41 ^19.

Во время клонирования, были два важных шага. Один шаг был выбор из двух ферментов рестрикции при синтезе интерес фрагмент гена в разделе протокола 1.1.1. Отбор двух ферментов условно зависит от расположения капсида Ad быть модифицированы, т.е.., В этом исследовании, фрагмент гена, содержащий Kwas был назначен включать в HVR1 из hexon5 белка. Ферменты рестрикции и AgeI AccI существуют отдельно в N-терминал и С-концевыми фланкирующими участки местности HVR1, и не существует во фрагменте HVR1-Kwas, таким образом, AgeI и AccI были выбраны, чтобы быть по отдельности поместить в N-конце и С- конец синтезированного фрагмента HVR1-Kwas. Так Hexon является главной мишенью Ad NABS и Hexon конкретных нейтрализующие эпитопы находятся во всех HVRs в Hexon ^12,18, это возможно, что йе Hexon изменены Ad5 векторов со стратегией антиген капсида-Регистрации может получить возможность обойти нейтрализации Ad5-положительной сыворотки в пробирке, и даже Ad5 PEI в хозяине. В этом исследовании, как и HVR1 HVR5 на двухвалентный вирусного вектора может внести свой вклад в спасение нейтрализации по Ad5-положительной сыворотки. Другим критическим шагом было в разделе протокола 1.2.2. После O / N инкубации совместно трансформировали смеси на LB-агар, выращенные колонии BJ5183 должны быть немедленно культивировали в жидкой LB для O / N, и плазмиды должны быть немедленно извлечены из клеток, а BJ5183. Отсрочка процедуры, скорее всего, приведет к потенциальному рекомбинации и мутации, так рекомбинации плазмиды в клетках BJ5183 не является стабильным. Правильно сконструированную плазмиду с гомологичной рекомбинации должно быть преобразовано в DH5 & alpha;, чтобы поддерживать стабильную и правильную видов генома.

После клонирования, были еще два важных шагов.Первый шаг в разделе протокола о трансфекции. Необходимо трансфекции рекомбинации объявление магистральную плазмиды в клетках, которые экспрессируют Ad5 E1 (НЕК293), если основа плазмида гена Е1 удалены. Другой шаг в разделе протокола 2.3 о вирусной укрупнения. Основная процедура вируса укрупнения следует принципу стандартного вируса укрупнения от Т-25 колбу на Т-75 колб и Т-175 колбах. Однако количество колб (Т-75 и / или Т-175) для использования в зависимости от скорости роста вируса, развитие CPE вызванных вирусной инфекции, и количество вируса необходимо.

Стратегия антиген капсида-Включение позволяет широкого применения на модификациях объявление. При этой стратегии, целесообразно модифицировать или гетерологичных антигенов включают в разные капсида основных белков, таких как Hexon ^2,4,20, Пентон основания ²¹ и ²² волокна. Капсида минорный белок PIX С-конец также показали обещание для heterolтерми антиген / пептид включение ^21,23. Кроме того, одной модификации, несколько модификаций на объявление этой стратегии также добился успеха. Примеры поколение двухвалентный Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ в этом исследовании включений в обоих HVR1 и HVR5 из hexon5, и включение двух нейтрализующих эпитопов типа энтеровирусной 71 в любом HVR1 и HVR2 или HVR1 и HVR4 или HVR1 и HVR5 из hexon3 ^24. Эти примеры подразумевают возможность Hexon изменений в других серотипов объявление, с целью либо генной терапии или подход вакцинации. Наши данные также продемонстрировали инкорпорации двух трипаносом Тгурапозота эпитопов в Hexon и PIX (неопубликованные данные). Эта стратегия также была расширена, чтобы химерные векторы объявления для любой вакцинации или подходов генной терапии. Примерами являются генерация химерного Ad5H3 путем переключения hexon5 с hexon3 ^16, генерация химерного Ad3H7 путем переключения hexon3 Wiго hexon7 ^25, и генерирование химерного Ad5F4 путем замены Ad5 волокна с волокном ²⁶ AD4.

В этом исследовании, двухвалентный Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ продемонстрировали Выявление гуморальных иммунных реакций, характерных для зарегистрированных антигенов-на-интерес. Наш текущий проект демонстрирует, что ответ ASP2-специфических CD8 Т-клеток значительно загрунтовать с помощью иммунизации вектором Ad5-PIX-ASP2, который был сгенерирован путем включения ASP2 пептид в IX белка (пикс) из Ad5, со стратегией антиген капсида-Регистрации (данные не показаны). ASP2, также названный амастигота поверхностный белок 2, является иммунодоминантный антиген дигенетических внутриклеточный паразит простейшее Trypanosoma Тгурапозота (Т. Тгурапозота) ^27. Этот новый экспериментальный факт расширяет наши знания, применение антиген капсида-Регистрации стратегии на Ad векторная вакцин может вызвать не только гуморальный иммунный ответ, но также сотовой иммуне ответы, специфичные для антигенов-на-интерес.

Хотя сравнительно выгодным для традиционной стратегии трансгенной, стратегия антиген капсида-Включение также имеет три недостатка. Во-первых, оно не может разрешить включение гена интересов, до тех пор, традиционная стратегия делает. Было сообщено, что стратегия антиген капсида-Включение на hexon5 позволяет вставками максимум 80 аминокислот (AA) в HVR1, 77-А на HVR5 и 57 А на HVR2 ^2. Из которых, HVR1 является наиболее разрешительный локаль для включения. Тем не менее, незначительные белок капсида PIX может вместить вставку 1000 аминокислот ^28. Во-вторых, некоторые антигены интересов, в природе неудачу в включении в Ad белков капсида, из-за таких факторов, как обвинений и сил аминокислот, которые, кажется, чтобы сорвать конструктивную компоновку вируса Ad. В этом случае внедрение соответствующих распорок связаны с антигенами интересов, может помочь йе успешным включение ^4. В-третьих, инкорпорации в некоторых местах HVR, то есть., HVR6 или HVR7 может привести к неудачной поколения жизнеспособных вирусных векторов ^12. Учитывая преимущества и недостатки обеих стратегий, мудрый выбор из двух стратегий или сочетание обеих стратегий будет зависеть от конкретных условий / потребностей. Пример расчесывать обе стратегии является формирование Ad5 / HVR2-MPER-L15 (Gag), в результате чего мембрана проксимальных внешний край (MPER) ВИЧ-1 gp41was включены в HVR2 из hexon5 со стратегией антиген капсида-регистрации, и ВИЧ-1 гена Gag был вставлен, чтобы заменить ген Е1 языковой Ad5 с традиционной стратегии трансгена ^2.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения предоставляет 5T32AI7493-20 и 5R01AI089337-03. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.