La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

A continuación, presentamos un protocolo para generar un adenovirus divalente tipo 5 (Ad5) vectores de prueba de principio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ mediante la utilización de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. Este vector se demostró la aptitud para exhibir cualitativa, la capacidad de escapar de sueros Ad5-positivo in vitro, y la antigenicidad, así como la inmunogenicidad de los antígenos incorporados.

Adenovirus de serotipo 5 (Ad5) ha sido ampliamente modificado con métodos tradicionales de transgén para el desarrollo de vacunas. Las eficacias reducidas de estos vectores Ad5 tradicionalmente modificados en los ensayos clínicos podrían ser correlacionados principalmente con Ad5 inmunidad pre-existente (PEI) entre la mayoría de la población. Promover el desarrollo de vacunas Ad5-vectored resolviendo la preocupación de Ad5 PEI, la innovadora estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación se ha empleado. Por mérito de esta estrategia, Ad5 vectored-que primero construyó el transbordador hexón plásmido HVR1-Sus _Kwas-HVR5-6 / pH5S subclonando la región hipervariable (HVR) 1 de hexón en un plásmido lanzadera previamente construido HVR5-His ₆ / pH5S, que tenía Su etiqueta ₆ incorporado en el HVR5. Se sintetizó Este fragmento de ADN que contiene un epítopo de HVR1 ELDKWAS VIH. ₆ / pH5S Sus HVR1-Kwas-HVR5-Fue entonces linealizado y co-transformada con el plásmido linealizado backbone pAd5 / ΔH5 (GL),para la recombinación homóloga. Este plásmido recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 _6-His se transfectó en células para generar el vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 _6-His. Este vector fue validado para tener la aptitud cualitativa indica viral título física (VP / ml), título infeccioso (IP / ml) y la correspondiente relación / IP VP. Tanto el epítopo VIH y His ₆ estaban en la cápside Ad5 expuesto en la superficie, y retenidos antigenicidad epítopo específico de los suyos. Un ensayo de neutralización indica la capacidad de este vector divalente para eludir la neutralización por sueros Ad5-positivo in vitro. Inmunización ratones demostró la generación de robusta inmunidad humoral específica al epítopo de VIH y su _6. Este estudio de prueba de principio sugirió que el protocolo asociado con la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación podría ser factible utilizar para la generación de vacunas vectorizadas-Ad5 mediante la modificación de diferentes proteínas de la cápside. Este protocolo podría incluso ser fás modificado para la generación de vacunas de adenovirus-vectorizada raras serotipo.

Adenovirus humano (Ad) es un virus de tamaño medio sin envoltura con una nucleocápside icosaédrica que contiene un genoma de ADN de cadena doble. Ad pertenece a la familia Adenoviridae, con una clasificación en siete grupos (A a G). Cada grupo contiene virus de diferentes serotipos. De los cuales, adenovirus serotipo 5 (Ad5) del grupo C ha sido el más estudiado y el que más se aplica para los enfoques vectored como la terapia génica y vacunas.

La estrategia transgén tradicional ha sido desarrollado y aplicado para las modificaciones de Ad5, que se caracteriza por el desplazamiento de los genes tempranos de virus con un gen de interés, y la expresión del gen de centrado de intereses en un huésped. Ejemplos de ello son la construcción de pENV9 / Ad5hrΔE3 mediante la sustitución de gen temprano 3 (E3) con el gen rev de Simian Virus de Inmunodeficiencia ^1, la construcción de AdCMVGag mediante la sustitución de gen temprano 1 (E1) con el gen gag de la Inmunodeficiencia HumanaVirus (HIV) ^2, y la construcción de Ad lac Z mediante la sustitución de E1 con lac Z gen ^3. La amplia aplicación de la estrategia tradicional transgén en Ad5 depende de los siguientes méritos: la amplia gama de anfitriones para Ad5, la factible ingeniería gen en el virus y la propagación de virus, la gran alojamiento de inserto de gen extraño y la seguridad de Ad5 ^4,5. Sin embargo, los reducidos eficacias de terapias clínicas vectored-Ad5 por el uso de esta estrategia ha sido un importante cuello de botella, que ha sido asignada para ser asociado principalmente con Ad5 PEI, ya Ad5 es tan frecuente entre la mayoría de los niños y los adultos ^4,6.

Para superar el principal cuello de botella de Ad5, el objetivo principal es el desarrollo de una estrategia alternativa eludir Ad5 PEI. La inmunidad innata ^7, la inmunidad adaptativa, tales como anticuerpos neutralizantes (NABS), ^8-10 y T CD8 ⁺ respuestas de las células ¹⁰ contra Ad5 se ha demostrado que contribute al Ad5 PEI, con Ad5 NAbs apareciendo a desempeñar el papel dominante en las contribuciones al Ad5 PEI ^10,11. Por otra parte, Ad5 Nabs epítopos objetivo situadas en proteínas de la cápside, incluidos el principal hexón proteínas, fibra y base de pentón. De los cuales, hexón es el objetivo principal de Ad5 NAbs ^8,11-13. Basándose en estos hallazgos, una innovadora estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación se ha introducido. Esta nueva estrategia destaca la sustitución o incorporación de proteínas de intereses en las proteínas de la cápside Ad5, que desplaza o máscaras de los epítopos neutralizantes Ad5, que conduce a la disminución de reconocimiento por parte de las administraciones y NAbs vector Ad5 eficientes. Es de destacar que esta estrategia es competitivo ya que también puede ayudar a hosts provocar inmunidad humoral y la inmunidad celular robusto potente mediante la presentación de antígenos directamente-de-interés para el sistema inmune ^4,14,15. Basado en esta estrategia, la clonación molecular y rescate Ad vector viral recombinante se pueden dividir estructuralmenteen cuatro pasos principales: (a) la preparación de fragmento de gen de interés ya sea por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o síntesis; (B) la ligación de fragmento de gen en un plásmido lanzadera que contiene el fragmento del gen de interés y los brazos homólogas a una cadena principal de adenovirus; (C) la recombinación homóloga por la co-transformación del plásmido lanzadera que contiene el fragmento del gen de intereses con el plásmido linealizado backbone pAd5 / ΔH5 (GL) ^16; (D) la transfección de plásmido linealizado adenoviral recombinante para rescatar el vector Ad recombinante constituida con antígenos de intereses.

Nuestro grupo y algunos otros han extendido esta estrategia de incorporación de anuncio alternativo para Ad desarrollo de la vacuna vectorizada contra diferentes agentes patógenos infecciosos. Nos informó la generación de un vector recombinante Ad Ad-HVR1-LGS-Su ₆ -V3 incorporando un Su-etiquetados VIH-1 antígeno V3 en la configuración regional HVR1 de Ad5 hexón (hexon5). Este vector generado desencadena strong respuesta inmune humoral específica para el epítopo V3 ^4. También informó el desarrollo de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 incorporando el VIH-1 membrana región ectodominio proximal (MPER) en la configuración regional HVR2 de hexon5 ^2. Además, el grupo del Dr. Zhou ha utilizado los beneficios de esta estrategia de incorporación Ad desarrollar Ad serotipo 3 (Ad3) vacunas vectorizadas, es decir., La generación de vectores R1SP70A3 viral mediante la incorporación de un SP70 epítopo neutralizante de Enterovirus 71 en el HVR1 de Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 generado NAbs fuertes y la producción de IFN-γ específicas para el epítopo SP70, que conducen a la alta tasa de protección contra Enterovirus 71 ¹⁵ desafío.

A los efectos de referencia técnica, nuestro estudio se aprovechó de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación cualitativa para centrarse en la generación de un vector Ad5 divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ mediante la incorporación de un antígeno del VIH-1 en HVR1 unda His en HVR5 de hexon5. El vector viral también fue generada inmunológicamente evaluado. La estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación podría ser utilizado para el desarrollo de enfoques de vacunación vectored-Ad5 contra diferentes enfermedades infecciosas.

La Universidad de Alabama en Birmingham Institucional Animal Uso y Cuidado Comité aprobó el uso de ratones como se describe en el presente documento con el número de protocolo aprobado 101.109.272.

1. Genética Construcción de un plásmido modificado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ con la Estrategia de la cápside-Incorporación Antígeno

1. La construcción del plásmido lanzadera ₆ / pH5S Sus HVR1-Kwas-HVR5-
   1. Pedido un plásmido que contiene la secuencia de ADN sintetizada HVR1-Kwas entre los sitios de enzimas de restricción AgeI a AccI del gen hexon5.
   2. Digerir 6 mu g del fragmento sintetizado (HVR1-Kwas) con las enzimas de AgeI (6 unidades) y AccI (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C. Resolver el fragmento digerido en un gel de agarosa al 2% por electroforesis, y purificar el fragmento con un kit de extracción en gel de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   3. Basado en la relación molar de inserto al vector en 3: 1, usar el ADN ligasa de T4 ligasa y bUffer para ligar 12 ng del fragmento (HVR1-Kwas) en 100 ng de un plásmido lanzadera previamente construido HVR5-His ₆ / pH5S ¹⁷ en un volumen de 10 l a TA durante 2 h, a través de los sitios de AgeI y AccI.
   4. Transformar 1 l de cada 10 l de el producto de ligación en 50 l de células DH5 electrocompetentes en un electroporador (a 1.800 V). Añadir 950 l de medio SOC a las células DH5a transformado y se incuba la mezcla durante 1 hora a 37 ° C, con 300 rpm. Spread 100-200 l de la mezcla de 1 ml sobre el agar Luria-Bertani (LB) que contiene kanamicina y se incuba O / N a 37 ° C.
      1. A la pantalla ~ 10 colonias por PCR dirigidos al fragmento HVR1-Kwas, mezclar el cebador directo (TATGTGTGTCATGTATGCGT), cebador inverso (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) y una sola colonia DH5a en una solución de mezcla maestra de PCR (de acuerdo con el protocolo del fabricante). Ejecutar las muestras en un termociclador refiriéndose al manual proporcionado con la solución mezcla maestra de PCR.
      2. Utilice el cebador directo (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para secuenciar el fragmento HVR1-Kwas en los clones seleccionados en la sección 1.1.4.1.
2. Construcción del plásmido pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆
   1. Recopilación de 6 g de HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ / pH5S con las enzimas EcoRI (6 unidades) y PmeI (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C, y purificar el fragmento que contiene los brazos de recombinación homóloga y el gen modificado hexon5 dual, como se indica en el paso 1.1.2. Linealizar el plásmido columna vertebral pAd5 / ΔH5 (GL) ¹⁶ con SwaI.
   2. Co-transformada de 100 ng del fragmento diana del plásmido lanzadera y 100 ng de la estructura linealizado pAd5 / ΔH5 (GL) en 50 l de células BJ5183 electrocompetentes para la recombinación homóloga en un electroporador (a 1.800 V). Añadir 950 l de medio SOC a las células transformadas y se incuba la mezcla durante 1 hora a 37 ° C, 300 rpm. Corre 100-200 l de la mezcla de 1 mlen el agar LB que contiene kanamicina (final de 50 mg / ml) para O / N de incubación a 37 ° C.
      1. Escoja ~ 10 pequeñas colonias en 3 ml de LB líquido que contiene kanamicina (final de 50 mg / ml) de O / N de incubación en un agitador (250 rpm, 37 ° C). Extracto de plásmidos de la cultura. Utilice el análisis de PCR para detectar las 10 colonias por la orientación del fragmento de HVR1-Kwas, como se ilustra en el paso 1.1.4.1.
      2. A la pantalla los mismos colonias mediante análisis por PCR dirigida al fragmento pIX del genoma columna vertebral, mezclar el cebador directo (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), cebador inverso (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) y una sola colonia BJ5183 en una solución de mezcla maestra de PCR (de acuerdo con el protocolo del fabricante). Ejecutar las muestras en un termociclador refiriéndose al manual proporcionado con la solución de mezcla maestra de PCR.
      3. Designar las colonias de doble positivos de PCR como pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su _6.
   3. Transformar 100 ng del plásmido pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ ena células DH5a como se ilustra en el paso 1.1.4.
      1. Utilice el análisis de PCR para detectar ~ 10 colonias por la orientación del fragmento de HVR1-Kwas, como se ilustra en el paso 1.1.4.1.
      2. Utilice el análisis de PCR para detectar las mismas colonias por la orientación del fragmento pIX del genoma columna vertebral, como se ilustra en el paso 1.2.2.2.
      3. Utilice el cebador directo (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para secuenciar el fragmento HVR1-Kwas en pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su _6.

2. Preparación de Modificado Ad5 Viral vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆

1. Constituyen el medio completo mediante la adición de FBS (10% final), ácidos no esenciales 100X Amino (final de 0,1 mM), 200 mM L-glutamina (final 2 mM) y penicilina / estreptomicina solución (final de 1%) en DMEM con alta glucosa . Mantener las células humanas de riñón embrionario (HEK293) en medio completo en una incubadora de cultivo (37 ° C y 5% de CO2 bajo condiciones de humedad del 85%).
2. Rescate de cinco viralctor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆
   1. Seed 3,0 x 10 ⁶ de las células HEK293 en una T-25 matraz que contenía 5 ml de medio completo y cultivo O / N para lograr una monocapa con 80% de confluencia.
   2. Linealizar 15 g de pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 _6-His en un volumen de 100 l con enzima de restricción PacI (15 unidades) a 37 ° C durante 3 hrs.
      1. Extraer linealizado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ por centrifugación de la reacción dos veces (10.000 xg durante 1 min) con un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (relación en 25: 24: 1) en una campana de humos , y por centrifugación secuencial (10.000 xg durante 10 min) con una solución mixta (300 l de etanol 100% y 10 l de acetato de sodio) y 700 l de etanol al 70%. Desechar el sobrenadante en cada etapa de centrifugación.
   3. Resuspender el plásmido purificado en ~ 40 l de agua destilada o Tris-EDTA (TE) tampón. Cuantificar el ADN plásmido mediante la medición de la óptica density (DO) a 260 nm.
   4. Transfectar 3 g del plásmido linealizado con reactivo comercial transfección liposomal en el matraz T-25, de acuerdo con el manual del fabricante. Cambie el medio de transfección con medio completo a 6 horas después de la transfección y la posterior incubación en la incubadora de cultivo. Mantener las células transfectadas mediante la sustitución de medio completo cada dos o tres días, hasta formar placas virales individuales.
   5. Cuando las placas se desarrollan a efecto citopático completo (CPE), raspar las células restantes fuera el matraz en una campana estéril, y lisado celular cosecha por centrifugación medio a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Suspender el sedimento de células en ~ 1 ml de medio que contiene 2% de FBS, y romper las células por congelación-descongelación cuatro veces. Recoger el sobrenadante que contiene virus rescatado después de la centrifugación del lisado a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Propagación a gran escala del vector viral de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆
   1. Propagar ªe virus en un matraz T-75 que contiene células HEK293 en la campana estéril mediante la infección con un tercio a la plena lisado del matraz T-25. Permita CPE completo para desarrollar dentro de dos o tres días en la incubadora de cultivo. Recoger el sobrenadante lisado como se indica en el paso 2.2.5.
   2. Propagar el virus en una a tres matraces T-175 en la campana estéril mediante la infección con medio completo a lisado del matraz T-75, dependiendo de las condiciones de propagación de virus. Permita CPE completo para desarrollar dentro de dos o tres días en la incubadora de cultivo. Recoger el sobrenadante lisado como se indica en el paso 2.2.5.
   3. Propagar el virus en una docena o más de matraces T-175 en la campana estéril mediante la infección con medio completo a lisado de la anterior matraz T-175 (s). Determinar la cantidad de uso matraz basado en las condiciones de propagación de virus y la cantidad de virus en necesidad. Recoger el sobrenadante lisado como se indica en el paso 2.2.5 cuando CPE completo se produce en dos o tres días en la incubadora de cultivo.
4. Purificación de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ de cloruro de cesio
   1. Preparar dos densidades de soluciones de CsCl en 5 mM HEPES: 1,33 g / ml y 1,45 g / ml, mientras que evitando el contacto con CsCl.
   2. Cargar 4 ml de CsCl (1,33 g / ml) en un tubo de ultracentrífuga estéril, y la carga suavemente 4 ml de CsCl (1,45 g / ml) contra la parte inferior del tubo. Cargar 4 ml de sobrenadante de lisado lentamente en la parte superior de los gradientes en la campana estéril.
   3. Centrifugar el tubo a 110.000 xg durante 3 horas a 4 ° C para separar la banda de virus maduro / inferior de la banda de virus defectuoso / superior. Recoger la banda inferior usando una jeringa de 3 ml armado con una aguja de 33 G y diluir la banda con 5 mM HEPES a un volumen de 4 ml en la campana estéril.
   4. Cargar otro tubo con dos densidades de soluciones de CsCl y la banda diluida de virus como se describe en el paso 2.4.2. Centrifugar el tubo a 110.000 xg O / N a 4 ° C. Recoger la banda viral como se describe en el paso 2.4.3.
   5. Inyectar la solución de virus recogido en un dialyses casete por una jeringa de 3 ml armado con una aguja de 33 G en la campana estéril.
   6. Coloque el casete en 700 ml de tampón de diálisis 1x (1 L receta: 100 ml de PBS 10x, 100 ml de 100% de glicerol y 800 ml de agua destilada; filtrar el tampón a través de un filtro de 0,22 micras) y reemplazar el tampón de diálisis cada 3 hrs para 4 veces. Aspirar a cabo solución de virus dializado utilizando una jeringa con aguja.

3. Validación del vector viral rescatado

1. Las titulaciones virales del vector
   1. Para el título físico virus, diluir tanto virus y tampón de diálisis (control de fondo) a 1: 10 y 1: 20 en tampón de lisis virus (10% de SDS en Tris-EDTA) en pequeños tubos, e incubar todos los tubos a 56 ° C durante 10 minutos.
   2. Encienda una BioPhotometer y establecer el modo de absorbancia a OD 260 nm. Utilice el tampón de diálisis diluido (1: 10) para equilibrar la señal de fondo haciendo clic en la parte inferior "en blanco". Tipo "10 + 90" en el scr BioPhotometereen, y leer la señal del virus diluido (1: 10).
   3. Leer la señal del virus diluido (1: 20), siguiendo el método en el paso 3.1.2, pero en su lugar, escriba "5 + 95" en la pantalla BioPhotometer. Multiplicar los dos números de lectura virus por 1.1x10 ¹² y calcular el título medio con una unidad como VP / ml, basado en los dos títulos individuales de las dos diluciones.
   4. Para el título infeccioso del virus (IP / ml), utilizar el método de Karber ₅₀ TCID estadística ¹⁴ para determinar la profundidad de la infección en células HEK293 después de la infección 10 días (dpi)
2. Evaluación de la pantalla de exposición antigénica en el vector viral
   1. Escudo del vector viral en una placa de ELISA y continúe con el resto de pasos en un método ELISA estándar ^14. Use anticuerpo humano anti-gp41 (2F5) monoclonal (mAb) y el ratón anti-His tag mAb para la detección de antígenos incorporados correspondiente ^14.
   2. Resolver el vector viral en un denatuelectroforesis en gel de proteína roja (SDS-PAGE) y continúe con el resto de pasos en un método Western-blot estándar ^14. Use anticuerpo humano anti-gp41 (2F5) monoclonal (mAb) y el ratón anti-His tag mAb para la detección de antígenos incorporados correspondiente ^14.
3. Evaluación in vitro del vector en la capacidad de eludir sueros Ad5-positve
   1. Mantener las células HeLa en medio completo en la incubadora de cultivo (37 ° C y 5% de CO ₂ bajo condiciones de humedad del 85%). Constituyen el medio completo mediante la adición de FBS (10% final), 200 mM L-glutamina (final de 2 mM) y solución de penicilina / estreptomicina (final de 1%) en medio esencial mínimo de Eagle (MEME).
   2. Semilla células HeLa en placas de 6 pocillos a 1x10 ⁶ células / pocillo, y se incuban las placas en la incubadora de cultivo (37 ° C y 5% de CO ₂ bajo condiciones de humedad del 85%) durante 2 horas. Incubar los sueros Ad5-positivo (0,1 l 0 o l) con 5 IP / célula de vector viral (Ad5 o Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆₎ en la incubadora de cultivo durante 1 hora antes de añadir las mezclas sobre las placas de 6 pocillos que contienen células.
   3. A las 24 horas después de la infección (hpi), enjuagar las células una vez con PBS y se lisan las células en 0,5 ml de tampón de lisis. Centrifugar a 15.000 xg durante 5 min y se recoge el sobrenadante. Mezclar 20 l del sobrenadante con 100 l de sustrato de luciferasa para la lectura de la señal de la luciferasa, ya que los virus contienen el gen de la luciferasa.

4. Evaluación inmunológica del vector viral rescatado

1. Prepare dos grupos de inmunización: Ad5 y Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su _6.
   1. Inyectar ratones (n = 8 / grupo) por vía intramuscular con virus en 1x10 ¹⁰ VP / ratón, en un "primer impulso" régimen de inmunización homóloga, con un intervalo de 2 semanas.
   2. A las 2 semanas después de cada inyección, sangrar ratones sin anestesia por la mejilla sangrado con lancetas animales (5 mm de longitud de punta) arecoger la sangre en tubos de 1,5 ml.
2. Mezclar la sangre en los tubos por inversión arriba y abajo, y se incuba la sangre a temperatura ambiente durante 30 min. Haga girar los tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C y los sueros de transferencia (capa superior) para nuevos tubos de 1,5 ml.
   1. Haga girar los nuevos tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C y la transferencia de los sueros de recién marcados tubos de 1,5 ml para el almacenamiento a -80 ° C.
3. Evaluación de la inmunidad humoral específica de antígeno por ELISA basado sueros-
   1. Diluir Su péptido (acciones a 1 mM) y el VIH-1 péptido (acciones a 1 mM) por separado en 100.
   2. tampón de carbonato mM (pH 9,5) para lograr la concentración de recubrimiento péptido a 10 mM. Recubrir las placas de ELISA con los péptidos diluidos por separado mediante la adición de 100 l por pocillo e incubando las placas de O / N a 4 ° C.
   3. Lavar las placas con PBST durante cuatro veces a 200 l / pocillo y el bloque durante 1 h en 5% de BSA en PBST. Aplicar sueros de ratones a las placas a 1: 100 dilución en el buf bloqueafer, 100 l / pocillo. Incubar durante 2 horas de incubación a temperatura ambiente.
   4. Lavar las placas con PBST durante cuatro veces. Bloquear las placas por incubación a TA durante 30 min en el tampón de bloqueo a 100 l / pocillo.
   5. Aplicar de cabra anti-IgG de ratón-HRP (1: 5.000 en el tampón de bloqueo) a 100 l / pocillo tanto a las placas recubiertas con Su péptido y el VIH-1 péptido individualmente. Incubar durante 2 horas a RT. Lavar las placas con PBST.
   6. Leer las placas a OD450 nm después de la incubación con sustrato de HRP durante 30 min.

La estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación (Figura 1A) se utilizó para generar el vector viral divalente Ad5 Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 _6-His. En primer lugar, el servicio de transporte plásmido HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ / pH5S se construyó subclonando fragmento HVR1-Kwas en el anterior plásmido lanzadera construida HVR5-Su ₆ / pH5S ^17. En segundo lugar, el plásmido pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ ¹⁴ fue construido por una recombinación homóloga entre el fragmento de "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR5-His6-PmeI" y linealizado con SwaI pAd5 / ΔH5 (GL ) ¹⁶ (Figura 1B). La transfección de PacI digiere pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ en un matraz plomo T-25 al rescate del vector viral de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ ^14. El vector viral rescatado se propagó en gran escala y se purificó mediante dos ciclos de gradiente de CsCl ultracentrífuga.

A fin de quedemostrar la viabilidad / aptitud del vector viral rescatado Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6, el título físico se determinó en 1,3 x 10 ¹¹ VP / ml mediante la medición de las copias físicas de genoma viral, y el título infeccioso era determinado en 1,4 x 10 ⁹ IP / ml mediante titulación de las partículas virales infecciosas reales. La relación VP / IP se calculó posteriormente a 92 ^14. Normalmente, un anuncio con una relación / IP VP por debajo de 1.000 indica una aptitud cualitativa de este virus. Con el fin de demostrar si este virus rescatado muestra el antígeno VIH antigénico y etiqueta His, respectivamente, sobre la superficie de la cápside viral proteína principal hexon5, ELISA se llevó a cabo con mAb 2F5 humano y de ratón anti-His tag mAb, respectivamente. Los resultados indicaron que tanto el mAb 2F5 humana (Figura 2 A) ¹⁴ y el ratón anti-His MAB (Figura 2B) ¹⁴ mostraron vinculantes para Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6, mientras que no hubo unión al contro negativol vector Ad5. Se utilizó un análisis Western-blot para confirmar los datos en el ELISA, ya que tanto 2F5 mAb humano (Figura 2C) ¹⁴ y el ratón anti-His tag mAb (Figura 2D) ¹⁴ detectado bandas específicas alrededor de 117 kDa sólo en el virus Ad5 / H5 HVR1-Kwas-HVR5-His _6, que corresponde al tamaño de la proteína hexon5. Con el fin de evaluar el potencial de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ en eludir la neutralización por sueros Ad5-positivo, el análisis de ensayo de neutralización se llevó a cabo como se indica en la sección 3.3 del protocolo. Los resultados mostraron que la unidad luminiscente relativa (RLU) de la señal a partir del vector viral Ad5 tratado con 0 l de Ad5-positve sueros es 12 veces mayor que la de la misma vector tratado con 0,1 l de Ad5-positve sueros (valor p <0,001 ). Esto sugirió la neutralización del vector Ad5 por los sueros Ad5-positvive. En contraste, hubo poca diferencia con el vector viral de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆tratados con 0 l y 0,1 l de sueros Ad5-influjo positivo (Figura 3). Desde hexón es el objetivo principal de Ad NAbs, y hexón específica epítopos neutralizantes residen en todas las HVR de hexón ^12,18, los datos anteriores demostraron que Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ escaparon neutralización por sueros Ad5-positve in vitro y sugiere el potencial de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 _6-His en eludir Ad5 PEI en el huésped.

Para investigar si la bivalente modificada Ad5 vector viral con la estrategia de la cápside-Incorporación antígeno podría provocar robusta inmunidad humoral específica a los antígenos de intereses incorporados, el "primer impulso" régimen de inmunización se aplicó para inmunizar ratones con el control de vectores virales y Ad5 el vector divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su _6. ELISA basados ​​en Sera revestido con el VIH-1 péptido mostraron que los sueros de grupo de inmunización de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ tuvo significativos llevadost unión al péptido de VIH-1 a diluciones entre 40 y 640, en comparación con los sueros del grupo control (p valor <0,001) (Figura 4A) ^14. Sera-basado ELISA recubierto con Su péptido mostraron que los sueros del grupo de inmunización de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ tenía la unión al péptido Su significativa en comparación con los sueros del grupo de control, como valor estadístico p < 0.001 en las diluciones de suero de 40 y 80, el valor de p <0,01 en la dilución de 160 y el valor de p <0,05 en una dilución de 320 (Figura 4B) ^14. Los resultados anteriores indican la generación de la respuesta inmune humoral contra los antígenos incorporados en el vector viral divalente.

Figura 1. Ilustración esquemática de la construcción genética del plásmido pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ con la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. (A) La estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación se caracteriza por mostrar directamente al antígeno de interés en las proteínas de la cápside (hexones, bases penta, pIX y / o fibra) de adenovirus. Esta figura es una adaptación de Nemerow et al., 2009. Virología 384 (2009) 380-388, Elsevier. Fragmento del gen de autor (B) (HVR1-Kwas) fue sintetizado y clonado en un vector pUC por una empresa. Este fragmento se subclonó en el plásmido lanzadera previamente construido HVR5-Sus ₆ / pH5S por las enzimas de restricción AgeI y AccI para generar ₆ / pH5S Sus HVR1-Kwas-HVR5. El plásmido lanzadera resultante se digirió con las enzimas EcoRI y PmeI, y co-transformada con el plásmido linealizado columna vertebral-SwaI pAd5 / ΔH5 (GL) para la recombinación homóloga, lo que resulta en la generación de la columna vertebral plásmido recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas -HVR5-Su _6. En esta figura, R1 significa HVR1 y R5 denota HVR5, y GL denota proteína verde fluorescente (GFP) y luciferase, por separado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Evaluación de la exposición antigénica de antígenos incorporados en la superficie de la cápside del vector viral divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su _6. Todo vector viral ELISA se llevó a cabo para determinar si los antígenos incorporados fueron expuestos en el vector superficie, mientras que el mantenimiento de las características antigénicas de su propio. Las placas de ELISA se recubrieron con el vector divalente, y se incubaron con mAb 2F5 humano (A) o de ratón anti-His mAb (B). Los datos indicaron la unión significativa de los anticuerpos para el vector divalente, pero no para el vector de control Ad5. R1-Kwas-R5-Su ₆ denota Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su _6. Se realizó un análisis Western-blot para confirmar la unión del mAb 2F5 humano (C) o de ratón anti-His mAb (D) a los antígenos incorporados en el vector divalente antigénico. En ambos (C) y (D), carril 1 indica Ad5, y el carril 2 indican Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su _6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Evaluación de la capacidad del vector viral divalente para escapar de la neutralización por Ad5-positve sueros in vitro. Ensayo de neutralización se realizó para determinar si el vector divalente podría escapar de la neutralización. Los resultados indicaron la neutralización de virus Ad5 por los sueros, pero los EScape de neutralización del virus in vitro divalente. En esta figura, R1-Kwas-R5-Su ₆ indica Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su _6. Los asteriscos *** denota el valor de p <0,001.

La Figura 4. En la generación in vivo de la inmunidad humoral por el vector viral divalente en el modelo de ratones. Sera-basado en ELISA se utilizó para evaluar la inmunidad humoral contra las proteínas incorporadas en el vector divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ . VIH-1 péptido (A) y su péptido (B) se recubrieron en las placas de ELISA por separado, seguido por la incubación con los sueros de los ratones de los dos grupos de inmunización (Ad5 y Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆₎ . Los datos indicaron la generación significativa de la respuesta inmune humoral contra el VIH-1 antígeno en HVR1 (A) y la etiqueta His en HVR5 (B). Cada punto de datos representa medios y SD de ocho repeticiones. Los asteriscos *** denota el valor de p <0,001, ** denota el valor de p <0,01, y * denota el valor de p <0,05.

La aplicación de la estrategia tradicional transgén en la modificación de Ad5 para el desarrollo de vacunas se ha disminuido debido principalmente al cuello de botella asociado con el Ad5 PEI ^4,6. Este cuello de botella puede ser parcialmente disminuido por la aplicación de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación (Figura 1A) alternativo, ya que esta estrategia puede evadir la neutralización por Ad5 NAbs reemplazando neutralizantes epítopos de Ad5 con antígenos de intereses, y facilitar la generación de robusta inmunidad a los antígenos de intereses incorporadas. En este estudio, la generación del vector viral divalente modificado Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ se introdujo como un ejemplo conceptual (Figura 1B). Correspondiente a la sección 1.1.1 protocolo, el fragmento sintetizado en el plásmido ordenado contiene un VIH-1 gp41 corto sustitución génica en la configuración regional HVR1 de hexon5. El gen gp41 parcial codifica un epítopo ELDKWAS, que sustituyeHVR1 parcial de los aminoácidos 139 a 144 del hexon5 ^14. ELDKWAS es un epítopo neutralizante potente en el VIH-1 gp41 ^19.

Durante la clonación, había dos pasos críticos. Un paso fue la selección de dos enzimas de restricción cuando se sintetiza el fragmento del gen de interés en la sección de protocolo 1.1.1. La selección de las dos enzimas depende condicionalmente en la ubicación de Ad cápside que ser modificado, es decir., En este estudio, fragmento de gen que contiene Kwas fue designado para incorporar en HVR1 de la proteína hexon5. Las enzimas de restricción AgeI y AccI existen por separado en N-terminal y C-terminal de las zonas de la localidad HVR1 flanqueo, y no existen en el fragmento HVR1-Kwas, tanto AgeI y AccI fueron elegidos para ser puesto individual en N-terminal y C- terminal del fragmento sintetizado HVR1-Kwas. Desde hexon es el objetivo principal de Ad NAbs, y-hexon específica epítopos neutralizantes residen en todas las HVR de hexon ^12,18, es factible que THe hexón modificado vectores Ad5 con la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación podrían adquirir la capacidad de eludir la neutralización por los sueros Ad5-positivo in vitro, e incluso el Ad5 PEI en host. En este estudio, tanto HVR1 y HVR5 en el vector viral divalente podrían contribuir a la fuga de la neutralización por los sueros Ad5-positivo. El otro paso fundamental estaba en la sección de protocolo 1.2.2. Después de la O / N de incubación de co-transformada mezcla sobre agar LB, las colonias crecidas BJ5183 necesitan ser inmediatamente cultivaron en LB líquido para O / N, y los plásmidos necesitan ser extraído inmediatamente de las células BJ5183 también. Retrasar los procedimientos es probable que conduzca a la recombinación y mutaciones potencial, ya que el plásmido recombinado en las células BJ5183 no es estable. El plásmido correcto de la recombinación homóloga necesita ser transformado en DH5a con el fin de mantener una especie de genoma estables y correctas.

Después de la clonación, había dos pasos más críticos. Losprimer paso en la sección de protocolo es sobre la transfección. Es necesario transfectar el plásmido columna vertebral Ad recombinado en las células que expresan Ad5 E1 (HEK293), si el plásmido columna vertebral es el gen E1 eliminado. El otro paso en la sección de protocolo 2.3 es acerca escalado virus. El procedimiento básico para la ampliación de la escala virus sigue el principio de escalado virus estándar a partir de un matraz T-25 a T-75 matraces y matraces T-175. Sin embargo el número de los matraces (T-75 y / o T-175) para su uso depende de la velocidad de crecimiento del virus, el desarrollo de CPE causada por la infección por el virus, y la cantidad de virus necesaria.

La estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación permite una amplia aplicación en las modificaciones de anuncios. Con esta estrategia, es factible modificar o incorporar antígenos heterólogos en diferentes principales proteínas de la cápsida, tales como hexon ^2,4,20, base de Penton ²¹ y ²² de fibra. La proteína de la cápside menor pIX C terminal también mostró promesa para el heterolantígeno ogous / incorporación péptido ^21,23. Además de la sola modificación, múltiples modificaciones en anuncio con esta estrategia también lograron el éxito. Ejemplos de ello son la generación de divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 _6-His en este estudio por incorporaciones en tanto HVR1 y HVR5 de hexon5, y la incorporación de dos epítopos neutralizantes de enterovirus tipo 71 en cualquiera de HVR1 y HVR2 o HVR1 y HVR4, o HVR1 y HVR5 de hexon3 ^24. Estos ejemplos implican la viabilidad de modificaciones hexón en otros serotipos de Ad, con el propósito de ya sea la terapia génica o enfoque de la vacunación. Nuestros datos también demostraron las incorporaciones de dos epítopos Trypanosoma cruzi en hexón y pIX (datos no publicados). Esta estrategia también se ha ampliado para hacer vectores de Ad quiméricos, ya sea para la vacunación o enfoques de terapia génica. Ejemplos de ello son la generación de Ad5H3 quimérico por conmutación hexon5 con hexon3 ^16, la generación de Ad3H7 quimérico por conmutación wi hexon3TH hexon7 ^25, y la generación de Ad5F4 quimérico mediante la sustitución de fibra de Ad5 con fibra de Ad4 ^26.

En este estudio, el divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su ₆ demostró la suscitar las respuestas inmunes humorales específicos a los antígenos de intereses incorporadas. Nuestro proyecto actual demuestra que la respuesta de las células CD8 específica ASP2-T está preparado de manera significativa por la inmunización con un vector Ad5-pIX-ASP2, que se generó mediante la incorporación de péptido en la proteína ASP2 IX (PIX) de Ad5, con la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación (datos no mostrados). ASP2, también llamado proteína de superficie amastigote 2, es un antígeno inmunodominante del digenético parásito protozoo intracelular Trypanosoma cruzi (T. cruzi) ^27. Este nuevo hallazgo experimental se extiende nuestro conocimiento de que la aplicación de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación en vacunas Ad vectorizada puede provocar no sólo las respuestas inmunes humorales, sino también la Immun celulare respuestas específicas a los antígenos de intereses.

Aunque comparativamente ventajosa a la estrategia tradicional transgén, la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación también tiene tres desventajas. En primer lugar, no puede permitir que la incorporación del gen de intereses, siempre y cuando la estrategia tradicional hace. Se ha informado de que la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación en hexon5 permite inserciones de un máximo de 80 aminoácidos (aa) en HVR1, 77 aa en HVR5 y 57 aa en HVR2 ^2. De los cuales, HVR1 es el entorno nacional más permisivo para la incorporación. Sin embargo, el menor pIX proteína de la cápside se puede añadir una inserción de 1.000 aminoácidos ^28. En segundo lugar, algunos antígenos-de-interés en la naturaleza fallan en incorporar a las proteínas de la cápside del Anuncio, debido a los factores tales como cargas y fuerzas de aminoácidos, que parecen alterar la disposición estructural del virus Ad. En este caso, la introducción de espaciadores apropiados vinculada a los antígenos de intereses puede ayudar a THe incorporación exitosa ^4. En tercer lugar, incorporaciones en algunos lugares HVR, es decir., HVR6 o HVR7 podrían conducir a la generación fallida de vectores virales viables ^12. Teniendo en cuenta las ventajas y desventajas de ambas estrategias, una sabia selección de las dos estrategias o una combinación de ambas estrategias dependerán de las condiciones / necesidades específicas. Un ejemplo de peinar tanto las estrategias es la generación de Ad5 / HVR2-MPER-L15 (GAG), por lo que la región proximal a la membrana externa (MPER) de 1-VIH gp41was incorporados en HVR2 de hexon5 con la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación, y el VIH-1 gen Gag fue insertado para reemplazar el gen locale E1 de Ad5 con la estrategia transgén tradicional ^2.

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta obra fue financiada en parte por los Institutos Nacionales de Salud otorga 5T32AI7493-20 y 5R01AI089337-03. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.