Utilisant la stratégie capside-Incorporation Antigen pour le développement d'approches adénovirus sérotype 5 Vectored vaccins

Ici, nous présentons un protocole pour générer un type bivalent adénovirus 5 (Ad5) vecteur preuve-de-principe Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ en utilisant la stratégie Antigène capside-Incorporation. Ce vecteur a été démontrée à exposer remise en forme qualitative, la capacité d'échapper sérums Ad5 positif in vitro, et l'antigénicité ainsi que l'immunogénicité des antigènes incorporés.

L'adénovirus sérotype 5 (Ad5) a été largement modifié par des méthodes traditionnelles de transgène pour le développement de vaccins. Les efficacités réduites de ces vecteurs Ad5 traditionnellement modifiés dans les essais cliniques pourraient être principalement corrélées avec Ad5 immunité pré-existante (PEI) parmi la majorité de la population. Pour promouvoir le développement d'un vaccin Ad5-vectorisé par la résolution de la préoccupation de l'Ad5 PEI, la stratégie innovante Antigène capside-constitution a été employé. Par le mérite de cette stratégie, Ad5-guidé nous avons d'abord construit la navette hexon plasmide HVR1-Kwas-HVR5-Ses ₆ / pH5S par sous-clonage de la région hypervariable (HVR) 1 de hexon dans un plasmide navette construite précédemment HVR5-Ses ₆ / pH5S, qui avait son étiquette ₆ incorporé dans le HVR5. Ce fragment HVR1 ADN contenant un épitope ELDKWAS VIH a été synthétisé. HVR1-Kwas-HVR5-Ses ₆ / pH5S était alors linéarisé et co-transformé avec le plasmide linéarisé épine dorsale PAD5 / ΔH5 (GL),pour la recombinaison homologue. Ce plasmide recombiné PAD5 / H5-HVR1-Kwas _HVR5-6-His a été transfecté dans des cellules afin de générer le vecteur viral d'Ad5 / H5-HVR1-Kwas _HVR5-6-His. Ce vecteur a été validé à avoir les aptitudes qualitative indiqué par titre virale physique (VP / ml), titre infectieux (IP / ml) et le ratio de VP correspondant / IP. Tant l'épitope VIH et son étiquette ₆ étaient exposés en surface sur la capside Ad5, et conservés antigénicité spécifique d'épitope de leur propre. Un essai de neutralisation a indiqué la capacité de ce vecteur divalent de contourner neutralisation par des sérums positifs Ad5 in vitro. l'immunisation de souris a démontré la génération de robustes immunité humorale spécifique à l'épitope du VIH et son _6. Cette étude de preuve de principe a suggéré que le protocole associé à la stratégie de l'antigène de capside-incorporation pourrait être faisable utilisé pour la génération de vaccins à vecteur Ad5 en modifiant différentes protéines de capside. Ce protocole pourrait même être Futres modifié pour la production de vaccins à vecteur d'adenovirus de serotype rare.

Adénovirus humain (Ad) est un de taille moyenne, virus non enveloppé avec une nucléocapside icosaédrique contenant une double génome d'ADN simple brin. Ad appartient à la famille Adenoviridae, avec une classification en sept groupes (A à G). Chaque groupe contient le virus de différents sérotypes. Dont, adénovirus sérotype 5 (Ad5) du groupe C a été la plus étudiée et la plus largement appliquée pour les approches Vectored comme la thérapie génique et la vaccination.

La stratégie transgénique traditionnelle a été développée et appliquée à des modifications Ad5, qui est caractérisé par le déplacement des gènes précoces virus avec un gène d'intérêt, et l'expression du gène ciblé d'intérêt chez un hôte. Des exemples sont la construction de pENV9 / Ad5hrΔE3 par le remplacement du gène précoce 3 (E3) avec gène rev de virus de l'immunodéficience simien ^1, la construction de AdCMVGag par le remplacement du gène précoce 1 (E1) avec le gène gag de l'immunodéficience humaine(VIH) ^2, et la construction du lac de la pub Z en remplaçant E1 avec gène lac Z ^3. La large application de la stratégie de transgène traditionnelle sur Ad5 dépend des avantages suivants: la large gamme d'hôtes pour Ad5, le génie génétique réalisable sur le virus et la propagation du virus, le grand établissement de l'insert de gène étranger et la sécurité de l'Ad5 ^4,5. Cependant, les efficacités réduits de thérapies cliniques Ad5-vectorisé par l'utilisation de cette stratégie a été un obstacle majeur, qui a été cartographiée à être principalement associée à Ad5 PEI, depuis Ad5 est tellement répandue parmi la majorité des enfants et des adultes ^4,6.

Pour surmonter le principal goulot d'étranglement de l'Ad5, l'objectif principal est de développer une stratégie alternative contournant Ad5 PEI. L'immunité innée ^7, l'immunité adaptative tels que des anticorps neutralisants (AcN) ^10/08 T CD8 ⁺ et des réponses de lymphocytes ¹⁰ contre Ad5 a été démontré que la contribute à Ad5 PEI, avec Ad5 NAbs apparaissant à jouer un rôle dominant dans les contributions à Ad5 PEI ^10,11. En outre, Ad5 NABS épitopes cibles situées dans des protéines de capside, y compris le principal hexon de protéines, de fibres et de la base du penton. Dont, hexon est la principale cible de Ad5 NAbs ^8,11-13. Basé sur ces résultats, une stratégie novatrice Antigène capside-constitution a été introduite. Cette nouvelle stratégie met en évidence le remplacement ou l'incorporation de protéines-de-intérêts sur Ad5 protéines de capside, qui déplace ou masque les épitopes neutralisants Ad5, conduisant à la diminution de la reconnaissance par le NAbs et efficaces administrations vecteur Ad5. Il est à noter que cette stratégie est concurrentiel car il peut aussi aider les hôtes suscitent robuste immunité humorale et l'immunité cellulaire puissante en présentant directement des antigènes d'intérêt pour le système immunitaire ^4,14,15. Basé sur cette stratégie, le clonage moléculaire et recombinant Ad vecteur viral de sauvetage peuvent être structurellement divisésen quatre étapes principales: (a) la préparation d'un fragment de gènes d'intérêt soit par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) ou la synthèse; (B) la ligation du fragment de gène dans un plasmide navette qui contient le fragment génique d'intérêt et les bras homologues à un squelette de l'adénovirus; (C) la recombinaison homologue par co-transformation de la navette de plasmide contenant le fragment génique d'intérêt avec le squelette plasmidique linéarisé PAD5 / ΔH5 (GL) ^16; (D) la transfection de plasmide linéarisé adénovirus recombinant pour sauver le vecteur Ad recombinant incorporé avec des antigènes-de-intérêt.

Notre groupe et quelques autres ont étendu cette stratégie alternative d'incorporation de la pub pour Ad développement d'un vaccin vectorisé contre différents agents pathogènes infectieux. Nous avons signalé la génération d'un vecteur Ad recombinant Ad-HVR1-LGS-His ₆ -V3 en incorporant un marquage His VIH-1 antigène V3 dans la locale de l'Ad5 HVR1 hexon (hexon5). Ce vecteur généré str déclenchéréponse immunitaire humorale spécifique ong à l'épitope V3 ^4. Nous avons également signalé le développement de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 en intégrant le VIH-1 membrane région ectodomaine proximale (MPER) dans les paramètres régionaux HVR2 de hexon5 ^2. En outre, le groupe de M. Zhou a utilisé les avantages de cette stratégie de constitution de la pub pour développer Ad sérotype 3 (Ad3) Les vaccins vectorisées, ie., La génération de vecteur viral R1SP70A3 en incorporant un SP70 épitope de neutralisation de l'entérovirus 71 dans le HVR1 des Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 généré NAbs solides et la production d'IFN-γ spécifiques à l'épitope de SP70, qui conduisent au taux élevé de protection contre l'entérovirus 71 ¹⁵ défi.

Aux fins de référence technique, notre étude a profité de la stratégie Antigène capside-Incorporation qualitative de se concentrer sur la génération d'un vecteur Ad5 divalent Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ en incorporant un antigène du VIH-1 dans HVR1 uneda Sa balise dans HVR5 de hexon5. Le vecteur viral généré a également été évalué immunologiquement. La stratégie Antigène capside-Incorporation pourrait être utilisé pour le développement d'approches de vaccination Ad5-vectorisé contre différentes maladies infectieuses.

L'Université de l'Alabama à Birmingham Comité soins en établissement et l'utilisation des animaux a approuvé l'utilisation de souris comme décrit ici sous le numéro 101 109 272 protocole approuvé.

1. Construction d'une modification génétique plasmide PAD5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ avec la stratégie capside-Incorporation Antigène

1. Construction du plasmide navette HVR1-Kwas _HVR5-6-His / pH5S
   1. Commander un plasmide contenant la séquence d'ADN synthétisée HVR1-Kwas entre les sites d'enzymes de restriction Agel à AccI de gène hexon5.
   2. Digest 6 pg du fragment synthétisé (HVR1-Kwas) avec l'enzymes Agel (6 unités) et AccI (6 unités) pendant 3 heures à 37 ° C. Résoudre le fragment digéré dans un gel d'agarose à 2% par électrophorèse, et on purifie le fragment avec un kit d'extraction de gel d'ADN selon le protocole du fabricant.
   3. Sur la base du rapport molaire de l'insert au vecteur de 3: 1, en utilisant l'ADN ligase T4 ligase et buffer à ligaturer 12 ng du fragment (HVR1-Kwas) dans 100 ng d'un plasmide navette précédemment construit HVR5-His ₆ / pH5S ¹⁷ dans un volume de 10 ul à la température ambiante pendant 2 h, via les sites AccI et de Agel.
   4. Transformer une pi sur 10 pi du produit de ligature dans 50 pl de cellules DH5a électrocompétentes dans un électroporateur (à 1800 V). Ajouter 950 ul de milieu SOC à des cellules DH5a transformées et incuber le mélange pendant 1 heure à 37 ° C, avec 300 tours par minute. Étaler 100-200 ul du mélange 1 ml sur la gélose Luria-Bertani (LB) contenant de la kanamycine et incuber O / N à 37 ° C.
      1. À l'écran ~ 10 colonies par PCR ciblant le fragment HVR1-Kwas, mélanger l'amorce avant (TATGTGTGTCATGTATGCGT), amorce inverse (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) et une seule colonie DH5a dans une solution de mélange maître PCR (selon le protocole du fabricant). Exécutez des échantillons sur un thermocycleur en se référant au manuel fourni avec la solution PCR mix master.
      2. Utilisez l'amorce avant (TATGTGTGTCATGTATGCGT) pour séquencer le fragment HVR1-Kwas dans les clones sélectionnés dans la section 1.1.4.1.
2. Construction du plasmide PAD5 / _{H5-HVR1-Kwas-6-His} HVR5
   1. Digest 6 ug de HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ / pH5S avec les enzymes EcoRI (6 unités) et Pmel (6 unités) pendant 3 heures à 37 ° C, et on purifie le fragment contenant les bras de recombinaison homologue et le gène hexon5 double modifié, comme indiqué dans l'étape 1.1.2. Linéariser l'épine dorsale plasmide PAD5 / ΔH5 (GL) ¹⁶ avec SwaI.
   2. Co-transformation de 100 ng du fragment cible à partir du plasmide navette et 100 ng de l'épine dorsale linéarisé PAD5 / ΔH5 (GL) dans 50 ul de cellules électrocompétentes BJ5183 pour la recombinaison homologue dans un électroporateur (à 1 800 V). Ajouter 950 ul de milieu SOC à des cellules transformées et incuber le mélange pendant 1 heure à 37 ° C, 300 tours par minute. Étaler 100 à 200 ul du mélange de 1 mlsur la gélose LB contenant de la kanamycine (finale 50 pg / ml) O / N incubation à 37 ° C.
      1. Choix ~ 10 petites colonies dans 3 ml de LB liquide contenant de la kanamycine (finale 50 pg / ml) O / N incubation à un agitateur (250 tours par minute, 37 ° C). Extraire les plasmides à partir de la culture. Utiliser l'analyse par PCR pour cribler les 10 colonies par le fragment de ciblage HVR1-Kwas, comme illustré à l'étape 1.1.4.1.
      2. Pour dépister les mêmes colonies par analyse PCR ciblant le fragment pIX du génome de la colonne vertébrale, mélanger l'amorce directe (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), amorce inverse (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) et un seul BJ5183 colonie dans une solution mix master PCR (selon le protocole du fabricant). Exécutez des échantillons sur un thermocycleur en se référant au manuel fourni avec la solution de mélange maître PCR.
      3. Désigner les colonies double positifs PCR comme PAD5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6.
   3. Transformer 100 ng du plasmide PAD5 / H5-HVR1-Kwas _HVR5-6-His dansà DH5a cellules comme illustré à l'étape 1.1.4.
      1. Utiliser l'analyse par PCR pour cribler ~ 10 colonies par le fragment de ciblage HVR1-Kwas, comme illustré à l'étape 1.1.4.1.
      2. Utiliser l'analyse par PCR pour cribler les mêmes colonies par le fragment de ciblage pIX du génome de la colonne vertébrale, comme illustré à l'étape 1.2.2.2.
      3. Utilisez l'amorce avant (TATGTGTGTCATGTATGCGT) pour séquencer le fragment HVR1-Kwas dans PAD5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6.

2. Préparation de modification Ad5 vecteur viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆

1. Constituer le milieu complet en ajoutant FBS (finale de 10%), les acides aminés 100X non essentiels (finale 0,1 mM), 200 mM de L-glutamine (finale 2 mM) et solution de pénicilline / streptomycine (finale 1%) dans DMEM avec haute teneur en glucose . Maintenir les cellules humaines embryonnaires de rein (HEK293) dans un milieu complet dans un incubateur de culture (37 ° C et 5% de CO2 dans 85% des conditions humidifié).
2. Sauvetage de cinq viralecteur Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆
   1. Graine 3,0 x 10 ⁶ de cellules HEK293 dans une fiole T-25 contenant 5 ml de milieu complet et la culture O / N pour obtenir une monocouche avec 80% de confluence.
   2. 15 pg de linéariser PAD5 / _{H5-HVR1-Kwas-6-His} HVR5 dans un volume de 100 ul avec l'enzyme de restriction PacI (15 unités) à 37 ° C pendant 3 heures.
      1. Extrait linéarisé PAD5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ par centrifugation de la réaction de deux fois (10 000 g pendant 1 min) avec un volume égal de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (rapport de 25: 24: 1) dans une hotte de laboratoire et séquentiel par centrifugation (10 000 xg pendant 10 min) avec une solution mixte (300 ul d'éthanol à 100% et 10 ul d'acétate de sodium) et 700 ul d'éthanol à 70%. Rejeter le surnageant à chaque étape de centrifugation.
   3. Remettre en suspension dans le plasmide purifié ~ 40 pi d'eau distillée ou du Tris-EDTA (TE) tampon. Quantifier l'ADN plasmidique par la mesure de l'optiquensity (DO) à 260 nm.
   4. Transfecter 3 pg du plasmide linéarisé avec commerciale réactif de transfection liposomale dans le flacon T-25, selon le manuel du fabricant. Changer le milieu de transfection avec un milieu complet à 6 heures post-transfection et d'incubation ultérieure dans l'incubateur de culture. Maintenir les cellules transfectées par le remplacement du milieu complet tous les deux à trois jours, jusqu'à ce que personne formulaire de plaques virales.
   5. Lorsque les plaques se développent pour effet cytopathique complet (CPE), racler les cellules restantes au large de la fiole dans une hotte stérile, et la cellule de récolte lysat par centrifugation milieu à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Suspendre le culot cellulaire dans ~ 1 ml de milieu contenant 2% de FBS, et de briser les cellules par congélation-décongélation quatre fois. Recueillir le surnageant contenant le virus sauvé après centrifugation lysat à 10.000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
3. Propagation à grande échelle du vecteur viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆
   1. Propager evirus de e dans un flacon T-75 contenant des cellules HEK293 dans la hotte stérile en infectant avec 1/3 à pleine lysat du flacon T-25. Laisser CPE complet pour développer dans les deux à trois jours dans l'incubateur de culture. Récolter le surnageant de lysat comme indiqué dans l'étape 2.2.5.
   2. Propager le virus dans une à trois flacons T-175 dans la hotte stérile par infection avec 1/2 à plein lysat provenant de la fiole T-75, en fonction des conditions de propagation du virus. Laisser CPE complet pour développer dans les deux à trois jours dans l'incubateur de culture. Récolter le surnageant de lysat comme indiqué dans l'étape 2.2.5.
   3. Propager le virus dans une douzaine ou plus de flacons T-175 dans la hotte stérile en infectant avec 1/2 à pleine lysat du flacon T-175 précédente (s). Calculer la somme de l'utilisation de la fiole sur la base des conditions de propagation du virus et la quantité de virus dans le besoin. Récolter le surnageant de lysat comme indiqué dans l'étape 2.2.5 lorsqu'il est plein CPE se produit dans les deux à trois jours dans l'incubateur de culture.
4. Purification de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ par le chlorure de césium
   1. Préparer deux densités des solutions de CsCl à l'HEPES 5 mM: 1,33 g / ml et 1,45 g / ml, tout en évitant le contact avec CsCl.
   2. Charge 4 ml de CsCl (1,33 g / ml) dans un tube d'ultracentrifugation stérile, et charger doucement 4 ml de CsCl (1,45 g / ml) contre fond du tube. Charge 4 ml de lysat surnageant lentement au-dessus des gradients dans la hotte stérile.
   3. Centrifuger le tube à 110 000 g pendant 3 heures à 4 ° C pour séparer la bande inférieure d'âge mûr / virus de la bande supérieure défectueux / virus. Recueillir la bande inférieure à l'aide d'une seringue de 3 ml avec une aiguille armée G 33 et la bande diluer avec 5 mM de HEPES à un volume de 4 ml dans la hotte stérile.
   4. Charger un autre tube avec deux densités de solutions de CsCl et la bande diluée de virus comme décrit à l'étape 2.4.2. Centrifuger le tube à 110 000 xg O / N à 4 ° C. Recueillir la bande virale comme décrit à l'étape 2.4.3.
   5. Injecter la solution de virus recueillis dans un Dialysest la cassette par une seringue de 3 ml armé avec une aiguille 33 G dans la hotte stérile.
   6. Placer la cassette dans 700 ml de tampon de dialyse 1x (1 L recette: 100 ml de 10 x PBS, 100 ml de 100% de glycerol et 800 ml d'eau distillée; filtrage du tampon à travers un filtre de 0,22 um) et remplacer le tampon de dialyse toutes les 3 h pour quatre fois. Aspirer la solution de virus dialysée en utilisant la seringue aiguilleté.

3. Validation du vecteur viral Sauvé

1. Vecteur viral titrages
   1. Pour le titrage physique de virus, on dilue à la fois le virus et le tampon de dialyse (contrôle d'arrière-plan) à 1: 10 et 1: 20 dans du tampon de lyse par le virus (10% de SDS dans du Tris-EDTA) dans de petits tubes, et incuber les tubes à 56 ° C pendant 10 min.
   2. Tourner sur un BioPhotometer et régler le mode de l'absorbance à DO 260 nm. Utilisez le tampon de dialyse dilué (1: 10) pour équilibrer le signal de fond en cliquant sur le fond "blanc". Tapez "10 + 90" dans le scr BioPhotometereen, et lire le signal du virus dilué (1: 10).
   3. Lire le signal du virus dilué (1: 20) en suivant la méthode à l'étape 3.1.2, mais au lieu de taper "5 + 95" dans l'écran de BioPhotometer. Multiplier deux nombres de virus de lecture par 1.1x10 ¹² et calculer le titre moyen d'une unité en tant que VP / ml, sur la base des deux titres individuels des deux dilutions.
   4. Pour le titre de virus infectieux (IP / ml), utilisez le Karber DICT statistique ₅₀ ¹⁴ méthode pour déterminer la profondeur de l'infection sur les cellules HEK293 après l'infection de 10 jours (dpi)
2. Évaluation de l'affichage de l'exposition antigénique sur le vecteur viral
   1. Enduire le vecteur viral dans une plaque ELISA et procéder avec le reste d'étapes dans une méthode ELISA standard ^14. Utilisation anti-gp41 (2F5) un anticorps humain monoclonal (mAb) anti-souris et marqueur His mAb pour la détection d'antigènes constituées ¹⁴ correspondant.
   2. Résoudre le vecteur viral dans un denaturouge électrophorèse sur gel de protéine (SDS-PAGE) et de procéder avec le reste d'étapes dans une méthode western-blot la norme ^14. Utilisation anti-gp41 (2F5) un anticorps humain monoclonal (mAb) anti-souris et marqueur His mAb pour la détection d'antigènes constituées ¹⁴ correspondant.
3. Dans l'évaluation in vitro du vecteur sur l'aptitude à contourner les sérums Ad5-positve
   1. Maintenir des cellules HeLa dans du milieu complet dans l'incubateur de culture (37 ° C et 5% de CO ₂ sous des conditions de 85% humidifié). Constituer le milieu complet en ajoutant FBS (finale de 10%), 200 mM de L-glutamine (finale 2 mM) et une solution de pénicilline / streptomycine (finale 1%) dans du milieu essentiel minimum d'Eagle (MEME).
   2. Seed cellules HeLa dans des plaques de 6 puits à 1x10 ⁶ cellules / puits, et incuber les plaques dans l'incubateur de culture (37 ° C et 5% de CO ₂ moins de 85% des conditions humidifiés) pendant 2 heures. Incuber sérums Ad5-positive (0,1 pi ou 0 ul) avec 5 IP / cellule de vecteur viral (Ad5 ou Ad5 / H5-HVR1-Kwas _HVR5-6-His) dans l'incubateur de culture pendant 1 h avant d'ajouter les mélanges sur des plaques à 6 puits contenant des cellules.
   3. À 24 h après l'infection (hpi), rinçage des cellules une fois avec du PBS et les cellules lysent dans 0,5 ml de tampon de lyse. Centrifuger à 15 000 g pendant 5 min et recueillir le surnageant. Mélanger 20 pi du surnageant avec 100 pi de substrat de la luciférase pour la lecture du signal de la luciférase, car les virus contiennent le gène de la luciférase.

4. immunologique évaluation du vecteur viral Sauvé

1. Préparer deux groupes de vaccination: Ad5 et Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6.
   1. Injecter souris (n = 8 / groupe) par voie intramusculaire avec des virus à 1x10 ¹⁰ VP / souris, dans un homologue "prime-boost" schéma d'immunisation, avec un intervalle de 2 semaines.
   2. A 2 semaines après chaque injection, saigner souris sans anesthésie par des saignements joue avec lancettes animales (5 mm de longueur de pointe) àrecueillir le sang dans des tubes de 1,5 ml.
2. Mélanger le sang dans les tubes par retournement vers le haut et vers le bas, et incuber le sang à la température ambiante pendant 30 min. Faites tourner les tubes à 10.000 g pendant 5 min à 4 ° C et les sérums de transfert (couche supérieure) à de nouveaux tubes de 1,5 ml.
   1. Faites tourner les nouveaux tubes à 10.000 g pendant 5 min à 4 ° C et les sérums de transfert nouvellement marqué tubes de 1,5 ml pour le stockage à -80 ° C.
3. Evaluation de l'immunité humorale spécifique de l'antigène par ELISA basé sérums-
   1. Diluer Son peptide (stock à 1 mM) et le VIH-1 peptide (stock à 1 mM) séparément dans 100.
   2. un tampon de carbonate mM (pH 9,5) pour atteindre la concentration de revêtement de peptide à 10 uM. Enrober les plaques ELISA avec les peptides dilué séparément en ajoutant 100 pi par puits et incuber les plaques O / N à 4 ° C.
   3. Laver les plaques avec du PBST quatre fois à 200 pl / puits et le bloc pendant 1 h à 5% de BSA dans du PBST. Appliquer des sérums de souris pour les plaques à dilution 1: 100 dans le blocage buffer, 100 pl / puits. Incuber pendant 2 heures d'incubation à la température ambiante.
   4. Laver les plaques avec du PBST quatre fois. Bloquer les plaques par incubation à température ambiante pendant 30 min dans du tampon de blocage à 100 pl / puits.
   5. Appliquer de chèvre anti-IgG de souris-HRP (1: 5000 dans le tampon de blocage) à 100 ul / puits à la fois aux plaques revêtues avec son peptide de HIV-1 et peptide individuellement. Incuber pendant 2 heures à température ambiante. Laver les plaques avec du PBST.
   6. Lire les plaques à DO450 nm après incubation avec un substrat de HRP pendant 30 min.

La stratégie Antigène capside-Incorporation (figure 1A) a été utilisé pour générer le bivalent Ad5 vecteur viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Tout d'abord, le plasmide navette HVR1-Kwas _HVR5-6-His / pH5S a été construit en sous-clonant le fragment HVR1-Kwas dans le plasmide navette de construction précédente HVR5-His ^_6/17 pH5S. En second lieu, le plasmide PAD5 / H5-HVR1-Kwas _HVR5-6-His ¹⁴ a été construit par une recombinaison homologue entre le fragment de "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR5-His6-Pmel" et SwaI linéarisé PAD5 / ΔH5 (GL ) ¹⁶ (figure 1B). La transfection de Pad digéré PAD5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ dans un ballon de plomb T-25 à la rescousse du vecteur viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ ^14. Le vecteur viral a ensuite été sauvé propage à grande échelle et purifiés par deux cycles d'ultracentrifugation sur gradient de CsCl.

Afin dedémontrer la viabilité / remise en forme du vecteur viral sauvé Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6, le titre physique a été déterminé à 1,3 x 10 ¹¹ VP / ml en mesurant les copies physiques de génome viral, et le titre était infectieuse déterminée à 1,4 x 10 ⁹ IP / ml en titrant les particules virales infectieuses réels. Le rapport VP / IP a ensuite été calculée à 92 ^14. Normalement, une annonce avec un rapport VP / IP en dessous de 1000 indique une remise en forme qualitative de ce virus. Afin de démontrer que ce virus récupéré affiche l'antigène antigénique VIH et His respectivement sur la surface de la capside virale protéine majeure hexon5, ELISA a été entrepris avec 2F5 humaine mAb et souris anti-His mAb, respectivement. Les résultats ont indiqué que les deux mAb 2F5 humaine (figure 2A) et ¹⁴ souris anti-His mAb (figure 2B) ¹⁴ ont montré lient à Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, alors qu'il n'y avait pas de liaison à la contro négativel vecteur Ad5. L'analyse Western-blot a été utilisé pour confirmer les données de la méthode ELISA, comme les deux mAb 2F5 humain (figure 2C) et ¹⁴ souris anti-marqueur His mAb (figure 2D) ¹⁴ détecté des bandes spécifiques autour de 117 kDa uniquement dans le virus Ad5 / H5- HVR1-Kwas _HVR5-6-His, qui correspond à la taille de la protéine de hexon5. Afin d'évaluer le potentiel de Ad5 / H5-HVR1-Kwas _HVR5-6-His à contourner neutralisation par des sérums Ad5-positif, l'analyse du test de neutralisation a été effectuée comme indiqué dans la section 3.3 de protocole. Les résultats ont montré que l'unité luminescente rapport de signal (RLU) à partir du vecteur viral d'Ad5 traité avec 0 ul de Ad5-positve sérums est 12 fois supérieur à celui du même vecteur traitée avec 0,1 ul de Ad5-positve sérums (valeur p <0,001 ). Ceci a suggéré la neutralisation du vecteur Ad5 par les sérums Ad5-positvive. En revanche, il y avait peu de différence à partir du vecteur viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆traité avec 0 ul et 0,1 ul de sérums Ad5-positve (Figure 3). Depuis hexon est la principale cible de l'annonce NAbs et spécifique hexon épitopes neutralisants résident dans tous les HVR d'hexon ^12,18, les données ci-dessus ont démontré que Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ échappés neutralisation par des sérums Ad5-positve in vitro et suggéré le potentiel de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ de contourner Ad5 PEI dans l'hôte.

Afin de déterminer si l'divalent modifiée Ad5 vecteur viral avec la stratégie capside-Incorporation Antigène pourrait susciter robuste immunité humorale spécifique aux antigènes-de-intérêts incorporés, la "prime-boost" schéma d'immunisation a été appliquée pour immuniser des souris avec un contrôle vecteur viral Ad5 et le vecteur Ad5 bivalent / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Les sérums à base d'ELISA revêtues avec le peptide HIV-1 a montré que des sérums de groupe d'immunisation de Ad5 / H5-HVR1-Kwas _HVR5-6-His avait significant pour la liaison de HIV-1 peptide à des dilutions de 40 à 640, par rapport au sérum dans le groupe témoin (valeur p <0,001) (figure 4A) ^14. Les sérums à base d'ELISA revêtues avec son peptide a montré que le sérum dans le groupe de vaccination de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ était obligatoire pour le son peptide significative par rapport au sérum dans le groupe de contrôle, en tant que valeur p statistique < 0,001 aux dilutions de sérum de 40 et 80, la valeur de p <0,01 au dilution de 160 et la valeur de p <0,05 à une dilution 320 (figure 4B) ^14. Les résultats ci-dessus indiquent la génération de la réponse immunitaire humorale contre les antigènes incorporés sur le vecteur viral bivalent.

Figure 1. Représentation schématique de la construction génétique du plasmide PAD5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ avec la stratégie Antigène capside-Incorporation. (A) La stratégie Antigène capside-Incorporation est caractérisé par afficher directement l'antigène d'intérêt sur ​​les protéines de capside (hexons, base de penta, pIX et / ou fibre) d'adénovirus. Ce chiffre a été adapté à partir Nemerow et al., 2009. Virology 384 (2009) 380-388, Elsevier auteur. (B) fragment de gène (HVR1-Kwas) a été synthétisé et cloné dans un vecteur pUC par une société. Ce fragment a été sous-cloné dans le plasmide navette précédemment construit HVR5-His ₆ / pH5S par les enzymes de restriction Agel et AccI pour générer HVR1-Kwas _HVR5-6-His / pH5S. Le plasmide navette résultant a été digéré avec les enzymes EcoRI et Pmel, et co-transformé avec SwaI linéarisé le plasmide de squelette PAD5 / ΔH5 (GL) pour la recombinaison homologue, aboutissant à la génération de la recombiné PAD5 squelette plasmidique / H5-HVR1-Kwas -HVR5-His _6. Dans cette figure, R1 désigne HVR1 et R5 désigne HVR5, et GL désigne la protéine de fluorescence verte (GFP) et luciferase, séparément. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Evaluation de l'exposition antigénique des antigènes incorporés à la surface de la capside du vecteur viral divalent Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Vecteur viral entier ELISA a été effectuée afin de déterminer si les antigènes incorporés ont été exposés sur le vecteur surface tout en conservant les caractéristiques antigéniques de leur propre. Des plaques ELISA ont été revêtues avec le vecteur divalent, et incubées avec le mAb 2F5 humain (A) ou de souris anti-His mAb (B). Les données indiquent la liaison significative des anticorps dirigés contre le vecteur divalent, mais pas pour le vecteur de commande Ad5. R1-Kwas-R5-His ₆ désigne Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Analyse Western-blot a été réalisée pour confirmer la liaison de l'anticorps monoclonal humain 2F5 (C) ou une souris anti-Sa mAb (D) pour les antigènes incorporés sur le vecteur bivalent antigénique. Dans les deux (C) et (D), la voie 1 indique Ad5 et la piste 2 indiquent Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. L'évaluation de la capacité du vecteur viral divalent d'échapper à la neutralisation par un dosage de neutralisation Ad5-positve sérum in vitro. A été effectuée pour déterminer si le vecteur divalent peut échapper à la neutralisation. Les résultats indiquent la neutralisation des virus Ad5 par les sérums, mais les escape de neutralisation du virus in vitro divalent. Dans cette figure, R1-Kwas-R5-His ₆ désigne Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Les astérisques *** désigne la valeur p <0,001.

Figure 4. Dans la production in vivo de l'immunité humorale par le vecteur viral divalent dans le modèle de souris. Les sérums à base d'ELISA a été utilisé pour évaluer l'immunité humorale contre les protéines sont intégrés sur le vecteur divalent Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ . HIV-1 peptide (A) et son peptide (B) ont été revêtus dans les plaques ELISA séparément, suivi par l'incubation avec les sérums de souris à partir des deux groupes de vaccination (Ad5 et Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆₎ . Les données indiquent la production significative de réponses immunitaires humorales contre l'antigène du VIH-1 en HVR1 (A) et le marqueur His dans HVR5 (B). Chaque point de données représente moyens et SD à partir de huit répétitions. Les astérisques *** désigne la valeur p <0,001, ** désigne la valeur p <0,01, et * désigne la valeur p <0,05.

L'application de la stratégie de modification transgénique traditionnelle sur Ad5 pour le développement de vaccins a été diminué principalement en raison du goulet d'étranglement associé à l'Ad5 PEI ^4,6. Ce goulot d'étranglement peut être partiellement diminuée par application de l'alternative de la stratégie Antigène capside-Incorporation (figure 1A), puisque cette stratégie peut se soustraire à la neutralisation par Ad5 NAbs en remplaçant épitopes neutralisants de Ad5 avec des antigènes-de-intérêts, et de faciliter la génération de l'immunité robuste aux antigènes-de-intérêts incorporés. Dans cette étude, la génération du vecteur viral bivalent modifiée Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ a été présenté comme un exemple conceptuel (figure 1B). Correspondant à la section 1.1.1 de protocole, le fragment synthétisé dans le plasmide ordonné contient une substitution d'gène gp41 du VIH-1 en court de la HVR1 hexon5 locale. Le gène gp41 partielle code pour un épitope ELDKWAS, qui substitueHVR1 partielle des acides aminés 139 à 144 de ¹⁴ hexon5. ELDKWAS est un épitope neutralisant efficace du VIH-1 gp41 ^19.

Pendant le clonage, il y avait deux étapes critiques. Une étape est la sélection de deux enzymes de restriction lors de la synthèse de l'intérêt fragment de gène dans la section 1.1.1 de protocole. La sélection des deux enzymes dépend conditionnellement à l'emplacement de l'annonce capside être modifiée, à savoir., Dans cette étude, un fragment de gène contenant Kwas a été désigné à incorporer dans la protéine de HVR1 hexon5. Les enzymes de restriction Agel et AccI existent séparément dans les zones de la locale HVR1 N-terminale et C-terminale flanquant, et ne existent pas dans le fragment HVR1-Kwas, ainsi Agel et AccI ont été choisis pour être mis individuellement à N-terminale et C- terminale du fragment synthétisé HVR1-Kwas. Depuis hexon est la principale cible de l'annonce NAbs et spécifique hexon épitopes neutralisants résident dans tous les HVR d'hexon ^12,18, il est possible que ee hexons modifiée vecteurs Ad5 avec la stratégie Antigène capside-Incorporation pourraient acquérir la capacité de contourner la neutralisation par les sérums Ad5 positif in vitro, et même le PEI dans Ad5 hôte. Dans cette étude, à la fois HVR1 et HVR5 sur le vecteur viral divalent pourraient contribuer à la fuite de la neutralisation par les sérums Ad5-positif. L'autre étape critique a participé à la section 1.2.2 de protocole. Après le O / N incubation du mélange de co-transformé sur de la gélose LB, les colonies cultivées BJ5183 doivent être immédiatement cultivées dans du milieu LB liquide pour O / N, et les plasmides doivent être immédiatement extrait des cellules BJ5183 aussi. Retarder les procédures mènera probablement à potentiel recombinaison et des mutations, depuis le plasmide recombiné dans les cellules BJ5183 est pas stable. Le plasmide correct à partir de la recombinaison homologue a besoin d'être transformé en DH5a afin de maintenir une espèce du génome stables et correctes.

Après le clonage, il y avait deux étapes les plus critiques. Lepremière étape, dans la partie protocole est d'environ transfection. Il est nécessaire de transfecter le plasmide recombiné Ad squelette dans des cellules qui expriment E1 d'Ad5 (HEK293), si le plasmide de gène E1 squelette est supprimé. L'autre étape dans la section 2.3 du protocole est d'environ upscaling de virus. La procédure de base pour upscaling du virus suit le principe de mise à l'échelle de virus standard d'un flacon T-25 à flacons T-75 et T-175 flacons. Toutefois, le nombre de flacons (T-75 et / ou T-175) à utiliser dépend de la vitesse du virus, le développement du CPE causé par l'infection par le virus, et la quantité de virus nécessaire croissance.

La stratégie Antigène capside-Incorporation permet une large application sur les modifications de l'annonce. Avec cette stratégie, il est possible de modifier ou incorporer des antigènes hétérologues sur différents capside protéines majeures, comme hexon ^2,4,20, base du penton ²¹ et ²² fibres. La protéine de capside mineure pIX extrémité C-terminale a également montré promesse pour l'heterolantigène ogous / incorporation du peptide ^21,23. Outre la modification unique, plusieurs modifications sur des annonces avec cette stratégie également atteints succès. Les exemples sont la génération de divalent Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ dans cette étude par incorporations dans les deux HVR1 et HVR5 de hexon5, et l'incorporation de deux épitopes neutralisants de entérovirus de type 71 en soit HVR1 et HVR2 ou HVR1 et HVR4, ou HVR1 et HVR5 de hexon3 ^24. Ces exemples impliquent la faisabilité de modifications hexons dans d'autres sérotypes de l'annonce, dans le but d'une thérapie génique ou une approche de vaccination. Nos données ont également démontré les incorporations de deux épitopes Trypanosoma cruzi dans hexon et pIX (données non publiées). Cette stratégie a également été étendu pour faire vecteurs Ad chimériques soit pour la vaccination ou des approches de thérapie génique. Des exemples sont la production de chimère en commutant Ad5H3 hexon5 avec hexon3 ^16, la génération de Ad3H7 chimère par commutation hexon3 wie hexon7 ^25, et la génération de Ad5F4 chimère fibre d'Ad5 par le remplacement de la fibre ²⁶ avec Ad4.

Dans cette étude, l'divalent Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ démontré l'susciter des réponses immunitaires humorales spécifiques aux antigènes-de-intérêts incorporés. Notre projet actuel démontre que la réponse des lymphocytes ASP2 spécifique CD8 T est significativement amorcée par immunisation avec un vecteur Ad5-pIX-ASP2, qui a été généré par l'incorporation ASP2 peptide dans la protéine IX (pIX) de l'Ad5, avec la stratégie de l'antigène de capside-Incorporation (données non présentées). ASP2, également appelé amastigote protéine de surface 2, est un antigène immunodominant de la digénétique intracellulaire parasite protozoaire Trypanosoma cruzi (T. cruzi) ^27. Cette nouvelle découverte expérimentale étend notre connaissance que l'application de la stratégie Antigène capside-Incorporation sur les vaccins de l'annonce vectorisé peut provoquer non seulement des réponses immunitaires humorales, mais aussi la immun cellulaireréponses spécifiques aux antigènes-de-intérêts e.

Bien que relativement avantageux de la stratégie de transgène traditionnelle, la stratégie Antigène capside-Incorporation a également trois inconvénients. Tout d'abord, il ne peut pas permettre l'incorporation d'un gène d'intérêt tant que stratégie traditionnel. Il a été rapporté que la stratégie Antigène capside-Incorporation sur hexon5 permet des insertions d'un maximum de 80 acides aminés (AA) dans hvr1 77 aa à aa HVR5 et 57 dans HVR2 ^2. Dont, HVR1 est le lieu le plus permissif pour l'incorporation. Toutefois, le mineur de pIX protéine de capside peut recevoir une insertion de ²⁸ acides aminés 1000. Deuxièmement, certains antigènes-de-intérêt pour la nature ne parviennent pas à incorporer dans les protéines de la capside de l'annonce, en raison de facteurs tels que les frais et les forces d'acides aminés, qui semblent perturber l'agencement structurel de virus Ad. Dans ce cas, l'introduction d'entretoises appropriées liée à la antigènes d'intérêt peut aider èmee succès incorporation ^4. Troisièmement, incorporations dans certains endroits HVR, ie., HVR6 ou HVR7 pourraient conduire à la génération de vecteurs viraux pas viables ^12. Étant donné les avantages et inconvénients des deux stratégies, un choix judicieux des deux stratégies, ou une combinaison des deux stratégies dépendront des conditions / besoins spécifiques. Un exemple de peigner les deux stratégies est la génération de Ad5 / HVR2-MPER-L15 (Gag), la région extérieure proche de la membrane (MPER) du VIH-1 gp41was incorporés dans HVR2 de hexon5 avec la stratégie Antigène capside-Incorporation, et HIV-1 Gag gène a été inséré pour remplacer le gène E1 d'Ad5 locale à la stratégie traditionnelle de transgène ^2.

Les auteurs ont rien à révéler.

Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de la Santé accorde 5T32AI7493-20 et 5R01AI089337-03. Les bailleurs de fonds ne jouaient aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.