Utilizzando la strategia di Antigen Capside-Incorporation per lo sviluppo di approcci Adenovirus sierotipo 5 Vectored vaccino

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare una prova di principio di tipo bivalente adenovirus 5 (Ad5) vettore Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ utilizzando la strategia di Antigen Capside-incorporazione. Questo vettore è stato dimostrato per esporre idoneità qualitativa, la capacità di sfuggire sieri Ad5-positivi in vitro, e l'antigenicità e immunogenicità agli antigeni incorporati.

Adenovirus sierotipo 5 (Ad5) è stato ampiamente modificato con metodi tradizionali transgene per lo sviluppo di vaccini. Le efficacies ridotte di questi vettori Ad5 tradizionalmente modificati negli studi clinici potrebbero essere correlati principalmente Ad5 immunità pre-esistente (PEI) tra la maggioranza della popolazione. Per promuovere lo sviluppo di vaccini Ad5 vettorizzate risolvendo la preoccupazione di Ad5 PEI, l'innovativa strategia di Antigen Capside-Incorporation è stato impiegato. Per merito di questa strategia, Ad5 vettorizzate abbiamo costruito la navetta hexon plasmide HVR1-Kwas-HVR5-I suoi ₆ / pH5S di subcloning regione ipervariabile (HVR) 1 di hexon in un plasmide shuttle precedentemente costruito HVR5-I suoi ₆ / pH5S, che ha avuto il suo tag ₆ incorporato nel HVR5. Questo frammento di DNA che contiene una HVR1 HIV epitopo ELDKWAS è stato sintetizzato. HVR1-Kwas-HVR5-I suoi ₆ / pH5S era allora linearizzato e co-trasformato con linearizzato dorsale plasmide pAd5 / ΔH5 (GL),per ricombinazione omologa. Questo plasmide ricombinato pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ è stato trasfettato in cellule per generare il vettore virale Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Questo vettore è stato validato per avere idoneità qualitativa indicato dal titolo virale fisico (VP / ml), titolo infettiva (IP / ml) e corrispondenti il ​​rapporto / IP VP. Sia l'epitopo HIV e la sua etichetta ₆ erano-superficie esposta sul capside Ad5, e trattenuti specifici epitopi antigenicità di loro. Un saggio di neutralizzazione indicava la capacità di questo bivalente vettore per aggirare la neutralizzazione da sieri Ad5 positivi in vitro. I topi di immunizzazione ha dimostrato la generazione di robusta immunità umorale specifica per l'epitopo HIV e la sua _6. Questo studio di prova di principio suggerito che il protocollo associato alla strategia capside-Incorporation potrebbe essere fattivamente utilizzato per la generazione di vaccini Ad5-vettorizzate modificando diverse proteine ​​del capside. Questo protocollo potrebbe anche essere fn ulteriore modificato per la generazione di rare sierotipo vaccini adenovirus vettorizzate.

Adenovirus umano (Ad) è un virus senza involucro di medie dimensioni con un nucleocapside icosaedrica con un letto genoma DNA filamento. Ad appartiene alla famiglia Adenoviridae, con una classificazione in sette gruppi (da A a G). Ciascun gruppo contiene virus di diversi sierotipi. Di cui, adenovirus sierotipo 5 (Ad5) dal gruppo C è stato il più ampiamente studiato e il più ampiamente richiesto approcci Vectored come la terapia genica e le vaccinazioni.

La strategia transgene tradizionale è stato sviluppato e applicato per modifiche Ad5, che si caratterizza per lo spostamento dei primi virus geni con un gene di interesse, e l'espressione mirata del gene di interesse in un host. Esempi sono la costruzione di pENV9 / Ad5hrΔE3 sostituendo presto gene 3 (E3) con rev gene di Simian Immunodeficiency Virus ^1, la costruzione di AdCMVGag sostituendo presto gene 1 (E1) con il gene gag di immunodeficienza umanaVirus (HIV) ^2, e la costruzione di Ad lac Z sostituendo E1 con gene lac Z ^3. L'ampia applicazione della strategia transgene tradizionale Ad5 dipende dai seguenti vantaggi: l'ampia gamma di ospiti per Ad5, dell'ingegneria gene fattibile su virus e la propagazione del virus, la grande alloggio dell'inserto gene estraneo e la sicurezza di Ad5 ^4,5. Tuttavia, i valori di efficacia ridotto di terapie cliniche Ad5-vettorizzate mediante l'uso di questa strategia è stato un collo di bottiglia importante, che è stato mappato per essere associato principalmente Ad5 PEI, dato che Ad5 è così diffuso tra la maggior parte dei bambini e degli adulti ^4,6.

Per superare il principale collo di bottiglia Ad5, l'obiettivo primario è quello di sviluppare una strategia alternativa aggirare Ad5 PEI. L'immunità innata ^7, immunità adattativa come anticorpi neutralizzanti (NABS) ^8-10 e CD8 ⁺ T risposte delle cellule ¹⁰ contro Ad5 hanno dimostrato di collaborarentribute a Ad5 PEI, con Ad5 NAbs che sembra svolgere il ruolo dominante dei contributi per Ad5 PEI ^10,11. Inoltre, Ad5 NAB epitopi beneficiarie situate in proteine ​​del capside, tra cui la principale hexon proteine, fibre e base Penton. Di cui, hexon è l'obiettivo principale di Ad5 NAbs ^8,11-13. Sulla base di questi risultati, è stato introdotto un innovativo strategia Antigen Capside-incorporazione. Questo romanzo strategia mette in evidenza la sostituzione o integrazione di proteine-di-interessi su proteine ​​del capside Ad5, che sposta o maschere epitopi Ad5 neutralizzanti, che porta alla diminuzione riconoscimento da parte NAbs ed efficienti le amministrazioni vettoriali Ad5. È interessante notare che questa strategia è competitivo, perché può anche aiutare gli host suscitano robusta immunità umorale e dell'immunità cellulare potente da direttamente presentando antigeni di interessi per il sistema immunitario ^4,14,15. Sulla base di questa strategia, la clonazione molecolare e ricombinante salvataggio annuncio vettore virale può essere strutturalmente divisoin quattro fasi principali: (a) la preparazione di frammento di gene di interessi da una reazione a catena della polimerasi (PCR) o sintesi; (B) la legatura del frammento di gene in un plasmide navetta che contiene il frammento di gene-di-interesse e braccia omologhe a una backbone adenovirus; (C) la ricombinazione omologa da co-trasformando il plasmide shuttle contenente il frammento di gene di interessi con la spina dorsale plasmide linearizzato pAd5 / ΔH5 (GL) ^16; (D) la transfezione di linearizzato plasmide adenovirale ricombinante per salvare il vettore ricombinante annuncio integrato con gli antigeni-di-interessi.

Il nostro gruppo e alcuni altri hanno esteso questa strategia incorporazione Annuncio alternativa per annuncio lo sviluppo di vaccini vectored contro diversi agenti patogeni infettivi. Abbiamo riportato la generazione di un annuncio vettore ricombinante Ad-HVR1-lgs-His ₆ -v3 incorporando un His-tag HIV-1 antigene V3 nel locale HVR1 di Ad5 hexon (hexon5). Questo vettore generato innescato strong risposta immunitaria umorale specifica per il epitopo V3 ^4. Abbiamo anche segnalato lo sviluppo di Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 incorporando HIV-1 membrana regione ectodomain prossimale (MPER) nel locale HVR2 di hexon5 ^2. Inoltre, il gruppo del Dr. Zhou ha utilizzato i benefici di questa strategia Ad integrazione di sviluppare annuncio sierotipo 3 (Ad3) vaccini vettorizzate, vale a dire., La generazione di virus vettore R1SP70A3 incorporando un SP70 neutralizzante epitopo di Enterovirus 71 nella HVR1 di Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 generato NAbs forti e produzione di IFN-γ specifici per la SP70 epitopo, che portano al alto tasso di protezione contro Enterovirus 71 sfida ^15.

Ai fini di riferimento tecnico, il nostro studio ha approfittato della strategia qualitativa Antigen Capside-incorporazione di concentrarsi sulla generazione di un bivalente Ad5 vettore Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ incorporando un antigene HIV-1 in HVR1 unda sua tag nel HVR5 di hexon5. Il vettore virale generato è stato anche immunologicamente valutata. La strategia di Antigen Capside-Incorporation potrebbero essere utilizzati per lo sviluppo di approcci di vaccinazione Ad5-vettorizzate contro diverse malattie infettive.

L'Università di Alabama a Birmingham Istituzionale uso di animali e Comitato Cura ha approvato l'uso di topi, come descritto qui sotto il numero di protocollo approvato 101.109.272.

1. genetica Costruzione di un plasmide modificato pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ con la strategia Antigen Capside-Incorporation

1. Costruzione del plasmide shuttle HVR1-Kwas-HVR5-I suoi ₆ / pH5S
   1. Ordina un plasmide contenente la sequenza di DNA sintetizzato HVR1-Kwas tra i siti di enzimi di restrizione AGEI per ACCI di gene hexon5.
   2. Digest 6 mg del frammento sintetizzato (HVR1-Kwas) con enzimi AGEI (6 unità) e ACCI (6 unità) per 3 ore a 37 ° C. Risolvere il frammento digerito in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi, e purificare il frammento con un kit di estrazione DNA gel secondo il protocollo del produttore.
   3. Sulla base del rapporto molare di inserto di vettore a 3: 1, utilizzare ligasi T4 DNA ligasi, bUffer per legare 12 ng del frammento (HVR1-Kwas) in 100 ng di plasmide shuttle precedentemente costruito HVR5-His ₆ / pH5S ¹⁷ in un volume di 10 ml a temperatura ambiente per 2 ore, tramite i siti di AGEI e ACCI.
   4. Transform 1 ml di 10 ml di prodotto legatura in 50 microlitri di cellule DH5α electrocompetent in elettroporatore (a 1800 V). Aggiungere 950 pl di mezzo SOC alle cellule trasformate DH5α e incubare la miscela per 1 ora a 37 ° C, con 300 rpm. Distribuire 100-200 microlitri della miscela di 1 ml sull'agar Luria-Bertani (LB) contenente kanamicina e incubare O / N a 37 ° C.
      1. Per lo screening ~ 10 colonie mediante PCR rivolte frammento HVR1-Kwas, mescolare il primer in avanti (TATGTGTGTCATGTATGCGT), inversione di primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) e una singola colonia DH5α in una soluzione master mix PCR (secondo il protocollo del produttore). Eseguire campioni su un termociclatore facendo riferimento al manuale fornito con la soluzione di PCR master mix.
      2. Utilizzare il primer in avanti (TATGTGTGTCATGTATGCGT) per sequenziare il frammento HVR1-Kwas nei cloni proiettati nella sezione 1.1.4.1.
2. Costruzione del plasmide pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆
   1. Digest 6 mg di HVR1-Kwas-HVR5-Il suo ₆ / pH5S con enzimi EcoRI (6 unità) e PMEI (6 unità) per 3 ore a 37 ° C, e purificare il frammento contenente armi ricombinazione omologa e il doppio gene hexon5 modificato, come indicato al punto 1.1.2. Linearizzare il plasmide dorsale pAd5 / ΔH5 (GL) ¹⁶ con Swai.
   2. Co-transform 100 ng del frammento di destinazione dal plasmide shuttle e 100 ng del backbone linearizzato pAd5 / ΔH5 (GL) in 50 ml di cellule BJ5183 electrocompetent per la ricombinazione omologa in elettroporatore (a 1800 V). Aggiungere 950 pl di mezzo SOC alle cellule trasformate e incubare la miscela per 1 ora a 37 ° C, 300 rpm. Distribuire 100-200 microlitri della miscela di 1 mlsulla agar LB contenente kanamicina (finale 50 mg / ml) per O / N incubazione a 37 ° C.
      1. Raccogliere ~ 10 minuscole colonie in 3 ml di LB liquido contenente kanamicina (finale 50 mg / ml) per O / N incubazione a un agitatore (250 rpm, 37 ° C). Estrarre plasmidi della cultura. Utilizzare l'analisi PCR per lo screening delle 10 colonie di mira il frammento HVR1-Kwas, come illustrato al punto 1.1.4.1.
      2. Per schermare le stesse colonie di PCR mira il frammento pix del genoma spina dorsale, mescolare il primer in avanti (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), inversione di primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) e un singolo BJ5183 colonia in una soluzione master mix PCR (secondo il protocollo del produttore). Eseguire campioni su un termociclatore facendo riferimento al manuale fornito con la soluzione di master mix PCR.
      3. Designare le colonie doppio positive PCR come pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6.
   3. Trasforma 100 ng del plasmide pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ ina DH5α cellule, come illustrato al punto 1.1.4.
      1. Utilizzare l'analisi PCR per lo screening ~ 10 colonie di mira il frammento HVR1-Kwas, come illustrato al punto 1.1.4.1.
      2. Utilizzare l'analisi PCR per schermare le stesse colonie di mira il frammento pix del genoma spina dorsale, come illustrato al punto 1.2.2.2.
      3. Utilizzare il primer in avanti (TATGTGTGTCATGTATGCGT) per sequenziare il frammento HVR1-Kwas in pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6.

2. Preparazione di Modified Ad5 Viral Vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆

1. Costituiscono il mezzo completo con l'aggiunta di FBS (finale il 10%), 100X non essenziali Aminoacidi (finale 0,1 mm), 200 mm L-glutammina (finale 2 mm) e la penicillina / streptomicina soluzione (finale 1%) in DMEM con alte concentrazioni di glucosio . Mantenere rene embrionale (HEK293), le cellule umane in terreno completo in un incubatore culturale (37 ° C e 5% di CO2 sotto l'85% condizioni umidificati).
2. Salvataggio di virale vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆
   1. Seed 3.0 x 10 ⁶ cellule HEK293 in uno T-25 pallone contenente 5 ml di mezzo completo e coltura O / N per ottenere un monostrato con 80% di confluenza.
   2. Linearizzare 15 mg di pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ in un volume di 100 ml con enzima di restrizione Paci (15 unità) a 37 ° C per 3 ore.
      1. Estrarre linearizzato pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ centrifugando reazione due volte (10.000 xg per 1 min) con un volume uguale di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (rapporto a 25: 24: 1) in una cappa aspirante , e per centrifugazione sequenziale (10.000 xg per 10 min) con una soluzione mista (300 ml di etanolo al 100% e 10 ml di acetato di sodio) e 700 ml di etanolo al 70%. Gettare il surnatante in ogni fase di centrifugazione.
   3. Risospendere il plasmide purificato in ~ 40 ml di acqua distillata o Tris-EDTA (TE) buffer. Quantificare il DNA plasmidico misurando la de otticansity (OD) a 260 nm.
   4. Trasfettare 3 pg di plasmide linearizzato con commerciale reagente liposomiale trasfezione nel pallone T-25, in base al manuale del costruttore. Cambiare il medio trasfezione con terreno completo a 6 ore dopo la trasfezione e successiva incubazione nell'incubatrice cultura. Mantenere cellule trasfettate sostituendo terreno completo ogni due o tre giorni, fino al singolo modello placche virali.
   5. Quando placche sviluppano a pieno effetto citopatico (CPE), raschiare le rimanenti celle esterne matraccio in una cappa sterile, lisato cellulare raccolta mediante centrifugazione media a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Sospendere il pellet cellulare in ~ 1 ml di terreno contenente 2% FBS, e rompere le cellule da congelamento-scongelamento quattro volte. Raccogliere il surnatante contenente virus in salvo dopo centrifugazione lisato a 10.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
3. Propagazione su larga scala del vettore virale Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆
   1. Propagazione the virus in un pallone T-75 contenenti cellule HEK293 nella cappa sterile infettando con 1/3 a pieno lisato dal pallone T-25. Lasciare pieno CPE per sviluppare entro due o tre giorni in incubatrice cultura. Raccogliere il surnatante lisato come indicato al punto 2.2.5.
   2. Propagare il virus uno a tre T-175 palloni in cappa sterile infettando con 1/2 a pieno lisato dal pallone T-75, a seconda delle condizioni di propagazione del virus. Lasciare pieno CPE per sviluppare entro due o tre giorni in incubatrice cultura. Raccogliere il surnatante lisato come indicato al punto 2.2.5.
   3. Propagare il virus in un dozzina o più T-175 palloni della cappa sterile infettando con 1/2 a pieno lisato dal pallone T-175 precedente (s). Determinare la quantità di utilizzo della boccetta sulla base delle condizioni di propagazione di virus e la quantità di virus nel bisogno. Raccogliere il surnatante lisato come indicato al punto 2.2.5 quando si verifica completa CPE entro due o tre giorni in incubatrice cultura.
4. Purificazione di Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ da cloruro di cesio
   1. Preparare due densità di soluzioni CsCl in 5 mM HEPES: 1,33 g / ml e 1,45 g / ml, evitando il contatto con CsCl.
   2. Carico 4 ml di CsCl (1,33 g / ml) in una provetta sterile ultracentrifuga e caricare delicatamente 4 ml di CsCl (1,45 g / ml) contro fondo della provetta. Carico 4 ml di lisato surnatante lentamente sopra dei gradienti nella cappa sterile.
   3. Centrifugare la provetta a 110.000 xg per 3 ore a 4 ° C per separare il gruppo di virus maturo / inferiore dalla fascia virus difettoso / alto. Raccogliere la banda inferiore utilizzando una siringa da 3 ml armato con un ago G 33 e diluire la fascia con 5 mM HEPES a un volume di 4 ml nella cappa sterile.
   4. Caricare un altro tubo a due densità di soluzioni CsCl e la fascia diluita di virus come descritto al punto 2.4.2. Centrifugare la provetta a 110.000 xg O / N a 4 ° C. Raccogliere la band virale come descritto al punto 2.4.3.
   5. Iniettare la soluzione virus raccolti in un dialysè cassette da una siringa da 3 ml armato di ago G 33 nella cappa sterile.
   6. Posizionare la cassetta in 700 ml di tampone di dialisi 1x (1 L ricetta: 100 ml di PBS 10x, 100 ml del 100% glicerolo e 800 ml di acqua distillata, filtrare il buffer attraverso un filtro di 0,22 micron) e sostituire il tampone di dialisi ogni 3 ore per 4 volte. Aspirare fuori soluzione virus dializzato mediante siringa agugliato.

3. La convalida del vettore virale Rescued

1. Vettore virale titolazioni
   1. Per il virus titolo fisica, diluire sia virus e tampone di dialisi (controllo di sfondo) a 1: 10 e 1: 20 in tampone di lisi virus (10% SDS in Tris-EDTA) in tubetti, e incubare tutte le provette a 56 ° C per 10 min.
   2. Accendere un BioPhotometer e impostare la modalità di assorbanza a OD 260 nm. Utilizzare il buffer di dialisi diluito (1: 10) per bilanciare il segnale di fondo cliccando il fondo "vuoto". Tipo "10 + 90" nella scr BioPhotometereen, e leggere il segnale di virus diluito (1: 10).
   3. Leggere il segnale di virus diluito (1: 20) seguendo il metodo in fase 3.1.2, ma invece digitare "5 + 95" nella schermata BioPhotometer. Moltiplicare due numeri lettura virus da 1.1x10 ¹² e calcolare il titolo medio con un apparecchio come VP / ml, in base ai due titoli individuali delle due diluizioni.
   4. Per il titolo infettivo del virus (IP / ml), utilizzare il Karber TCID statistico ₅₀ ¹⁴ metodo per determinare la profondità infezione sulle cellule HEK293 a 10 giorni dopo l'infezione (dpi)
2. Valutazione della visualizzazione dell'esposizione antigenica sul vettore virale
   1. Rivestire la vettore virale in una piastra ELISA e procedere con il resto dei passaggi in un metodo standard ELISA ^14. Usa anti-gp41 (2F5) anticorpo umano monoclonale (mAb) e mouse anti-His mAb per la rilevazione di antigeni corrispondenti incorporati ^14.
   2. Risolvere il vettore virale in un denatuelettroforesi su gel di proteine ​​rosso (SDS-PAGE) e procedere con il resto dei passaggi in un metodo western-blot standard ^14. Usa anti-gp41 (2F5) anticorpo umano monoclonale (mAb) e mouse anti-His mAb per la rilevazione di antigeni corrispondenti incorporati ^14.
3. Valutazione in vitro del vettore sulla capacità di bypassare sieri Ad5-positivo
   1. Mantenere cellule HeLa in terreno completo in incubatrice coltura (37 ° C e 5% di CO ₂ in 85% condizioni umidificati). Costituiscono il mezzo completo aggiungendo FBS (finale 10%), 200 mM di L-glutammina (2 mM finale) e soluzione di penicillina / streptomicina (finale 1%) in Minimum Essential medio Eagle (MEME).
   2. Seed cellule HeLa in piastre da 6 pozzetti a 1x10 ⁶ cellule / pozzetto e incubare le piastre nell'incubatore coltura (37 ° C e 5% CO ₂ 85% in condizioni umidificati) per 2 ore. Incubare sieri Ad5-positivi (0,1 ml o 0 ml) con 5 IP / cellula di vettore virale (Ad5 o Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆₎ in incubatrice coltura per 1 ora prima di aggiungere le miscele sulle 6-pozzetti contenenti cellule.
   3. A 24 ore dopo l'infezione (HPI), lavare le cellule una volta con PBS e le cellule Lisare in 0,5 ml di tampone di lisi. Centrifugare a 15.000 xg per 5 minuti e raccogliere il surnatante. Mescolare 20 ml di surnatante con 100 ml di substrato luciferasi per la lettura del segnale luciferasi, poiché virus contengono il gene della luciferasi.

4. immunologico Valutazione del vettore virale Rescued

1. Preparare due gruppi di immunizzazione: Ad5 e Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6.
   1. Iniettare topi (n = 8 / gruppo) per via intramuscolare con i virus a 1x10 ¹⁰ VP / mouse, in un "prime-boost" regime di immunizzazione omologa, con un intervallo di 2 settimane.
   2. A 2 settimane dopo ogni iniezione, sanguinare topi senza anestesia da guancia sanguinante con lancette animali (5 mm Lunghezza punta) araccogliere il sangue in provette da 1,5 ml.
2. Mescolare il sangue nei tubi invertendo su e giù, e incubare il sangue a temperatura ambiente per 30 min. Spin le provette a 10.000 xg per 5 minuti a 4 ° C ed i sieri di trasferimento (strato superiore) a nuove provette da 1,5 ml.
   1. Spin i nuovi tubi a 10.000 xg per 5 minuti a 4 ° C e trasferimento sieri ora contrassegnati provette da 1,5 ml per la conservazione a -80 ° C.
3. La valutazione di antigene-specifica immunità umorale dalla società Sera-ELISA
   1. Diluire suo peptide (azione a 1 mm) e HIV-1 peptide (azione a 1 mm) separatamente nel 100.
   2. mM tampone carbonato (pH 9,5) per ottenere la concentrazione di rivestimento peptide a 10 mM. Rivestire le piastre ELISA con i peptidi diluiti separatamente con l'aggiunta di 100 pl per pozzetto e incubare le piastre O / N a 4 ° C.
   3. Lavare i piatti con PBST per quattro volte a 200 l / pozzetto e blocco per 1 ora a 5% di BSA in PBST. Applicare sieri topi per le piastre a diluizione 1: 100 nel BUF bloccofer, 100 l / pozzetto. Incubare per 2 ore di incubazione a RT.
   4. Lavare le piastre con PBST per quattro volte. Bloccare le piastre incubando a temperatura ambiente per 30 min in tampone di bloccaggio a 100 microlitri / pozzetto.
   5. Applicare capra anti-topo IgG-HRP (1: 5000 in tampone bloccante) a 100 ml / pozzetto per entrambe le piastre rivestite con il suo peptide e HIV-1 peptide singolarmente. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare i piatti con PBST.
   6. Leggere le piastre a OD450 nm dopo incubazione con il substrato HRP per 30 min.

La strategia di Antigen Capside-Incorporation (Figura 1A) è stato utilizzato per generare il bivalente Ad5 vettore virale Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. In primo luogo, la navetta plasmide HVR1-Kwas-HVR5-Il suo ₆ / pH5S è stato costruito da subcloning HVR1-Kwas frammento nella precedente plasmide shuttle costruito HVR5-Il suo ₆ / pH5S ^17. In secondo luogo, il plasmide pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ ¹⁴ è stato costruito da una ricombinazione omologa tra il frammento di "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR5-His6-PMEI" e Swai-linearizzato pAd5 / ΔH5 (GL ) ¹⁶ (Figura 1B). Trasfezione di PACI digerito pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ in un pallone di piombo T-25 in soccorso del vettore virale Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Sua ₆ ^14. Il vettore virale salvati fu poi propagato in larga scala e purificato mediante due cicli di CsCl gradiente ultracentrifuge.

Perdimostrare la fattibilità / idoneità del vettore virale salvato Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6, il titolo fisico è stato determinato in 1,3 x 10 ¹¹ VP / ml misurando le copie fisiche di genoma virale, e il titolo è stato contagioso determinato a 1,4 x 10 ⁹ IP / ml titolando le particelle reali infettive virali. Il rapporto VP / IP è stata successivamente calcolata a 92 ^14. Normalmente, un annuncio con un rapporto / IP VP inferiore a 1.000 indica una palestra qualitativa di questo virus. Per dimostrare se questo virus in salvo visualizza l'antigene HIV antigenica e la sua etichetta, rispettivamente, sulla superficie del capside virale principale proteina hexon5, ELISA è stata intrapresa con l'essere umano 2F5 mAb e topo anti-His mAb, rispettivamente. I risultati hanno indicato che sia il 2F5 mAb umano (Figura 2A) ¹⁴ e topo anti-His tag monoclonale (Figura 2B) ¹⁴ hanno mostrato vincolanti per Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, mentre non vi era vincolante per la Contro negativol vettore Ad5. Analisi Western-blot è stato usato per confermare i dati nel ELISA, sia come 2F5 mAb umana (Figura 2C) ¹⁴ e topo anti-His tag mAb (Figura 2D) ¹⁴ rilevato bande specifiche di circa 117 kDa solo nel virus Ad5 / H5 HVR1-Kwas-HVR5-His _6, che corrisponde alla dimensione di proteine ​​hexon5. Al fine di valutare il potenziale di Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ ad aggirare neutralizzazione sieri Ad5-positivi, analisi saggio di neutralizzazione è stata effettuata come indicato nella sezione del protocollo 3.3. I risultati hanno mostrato che l'unità relativa luminescente segnale (RLU) dal vettore virale Ad5 trattata con 0 ml di Ad5-positivo sieri è 12 volte superiore a quella dello stesso vettore trattata con 0,1 ml di Ad5-positivo sieri (valore p <0.001 ). Questo suggerisce la neutralizzazione del vettore Ad5 dal sieri Ad5-positvive. Al contrario, c'era poca differenza dal vettore virale Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆trattati con 0 ml e 0,1 ml di siero Ad5-positivo (Figura 3). Poiché hexon è l'obiettivo principale di Ad NAbs, e specifici hexon epitopi neutralizzanti risiedono in tutte le HVR di hexon ^12,18, i dati di cui sopra hanno dimostrato che Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ sfuggito neutralizzazione da sera Ad5-positivo in vitro e ha suggerito la possibilità di Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ su aggirare Ad5 PEI nell'ospite.

Per verificare se il bivalente modificato Ad5 vettore virale con la strategia Capsid-Incorporation Antigen potrebbe suscitare robusta immunità umorale specifica agli antigeni-di-interessi incorporati, il "prime-boost" regime di immunizzazione è stato applicato per immunizzare topi con controllo vettoriale virale Ad5 e il vettore bivalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. ELISA-based Sera rivestito con HIV-1 peptide ha mostrato che i sieri da gruppo di immunizzazione di Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ aveva significant legame al peptide HIV-1 a diluizioni compresa tra 40 e 640, rispetto ai sieri dal gruppo di controllo (valore p <0,001) (Figura 4A) ^14. Sera a base ELISA rivestita con la Sua peptide ha mostrato che i sieri dal gruppo di immunizzazione di Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ doveva legame significativo per la sua peptide rispetto ai sieri del gruppo di controllo, come valore statistico p < 0.001 alle diluizioni di siero di 40 e 80, il valore p <0,01 a una diluizione di 160 e un valore p <0,05 a una diluizione di 320 (Figura 4B) ^14. I risultati sopra riportati indicano la generazione della risposta immunitaria umorale contro gli antigeni incorporati sul vettore virale bivalente.

Figura 1. Schema di costruzione genetica di plasmide pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ con la strategia di Antigen Capside-Incorporation. (A) La strategia di Antigen Capside-Incorporation è caratterizzata da visualizzare direttamente l'antigene di interesse sulle proteine ​​del capside (hexon, base penta, PIX e / o fibra) di adenovirus. Questa cifra è stata adattata da Nemerow et al., 2009. Virologia 384 (2009) 380-388, copyright Elsevier. (B) frammento Gene (HVR1-Kwas) è stato sintetizzato e clonato in un vettore pUC da una società. Questo frammento è stato subclonato nel plasmide shuttle precedentemente costruito HVR5-I suoi ₆ / pH5S per gli enzimi di restrizione AGEI e ACCI per generare HVR1-Kwas-HVR5-I suoi ₆ / pH5S. Il plasmide shuttle risultante è stato digerito con gli enzimi EcoRI e PMEI, e co-trasformato con Swai-linearizzato plasmide backbone pAd5 / ΔH5 (GL) per la ricombinazione omologa, con conseguente generazione del ricombinato pAd5 backbone plasmide / H5-HVR1-Kwas -HVR5-His _6. In questa figura, R1 denota HVR1 e R5 denota HVR5, e GL denota la proteina verde fluorescente (GFP) e luciferase, separatamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Valutazione dell'esposizione antigenica di antigeni incorporati sulla superficie capside del vettore virale bivalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Sua _6. Vettore virale intero ELISA è stato effettuato per determinare se gli antigeni incorporati sono stati esposti su vettore superficie mantenendo caratteristiche antigeniche dei loro propri. Le piastre ELISA sono stati rivestiti con la bivalente vettoriale, e incubate con umana 2F5 mAb (A) o topo anti-His mAb (B). Dati indicato il significativo legame degli anticorpi al bivalente vettoriale, ma non al vettore di controllo Ad5. R1-Kwas-R5-His ₆ denota Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Analisi Western-blot è stata eseguita per confermare il legame del mAb 2F5 umana (C) o topo anti-His mAb (D) agli antigeni incorporate sulla bivalente vettoriale antigenica. In entrambi (C) e (D), corsia 1 indica Ad5 e corsia 2 indica Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Il suo _6. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Valutazione della capacità del vettore virale bivalente per sfuggire alla neutralizzazione da Ad5-positve sieri in vitro. Saggio di neutralizzazione è stata effettuata per determinare se il bivalente vettore poteva sfuggire la neutralizzazione. I risultati indicano la neutralizzazione del virus Ad5 dal siero, ma le escapo della neutralizzazione del virus bivalente in vitro. In questa figura, R1-Kwas-R5-His ₆ denota Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His _6. Gli asterischi *** indica il valore di p <0,001.

Figura 4. Nella generazione vivo dell'immunità umorale dal vettore virale bivalente nel modello topo. Sieri a base di ELISA è stato utilizzato per valutare l'immunità umorale contro le proteine ​​incorporate sul vettore bivalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ . HIV-1 peptide (A) e il suo peptide (B) sono stati rivestiti in piastre ELISA separatamente, seguita da incubazione con i sieri topi dai due gruppi di immunizzazione (Ad5 e Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆₎ . Dati indicato la significativa generazione di risposte immunitarie umorali contro l'HIV-1 antigene HVR1 (A) e il suo tag HVR5 (B). Ogni punto di dati rappresenta mezzi e SD da otto repliche. Gli asterischi *** denota il valore di p <0.001, ** indica il valore di p <0.01, e * indica il valore di p <0.05.

L'applicazione della strategia transgene tradizionale sulla modificazione Ad5 per lo sviluppo di vaccini è stata diminuita principalmente per il collo di bottiglia associato alla Ad5 PEI ^4,6. Questo collo di bottiglia può essere parzialmente diminuito applicando il alternativa strategia capside-Incorporation (Figura 1A), poiché questa strategia può sfuggire neutralizzazione da Ad5 NAbs sostituendo neutralizzanti epitopi di Ad5 con antigeni-di interesse, e facilitare la generazione di robusta immunità agli antigeni-di-interessi incorporati. In questo studio, la generazione del vettore virale bivalente modificato Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 _6-His è stato introdotto come esempio concettuale (Figura 1B). Corrispondente alla sezione 1.1.1 protocollo, il frammento sintetizzato nel plasmide ordinato contiene un HIV-1 gp41 breve sostituzione genica nel locale HVR1 di hexon5. Il gene codifica per un parziale gp41 epitopo ELDKWAS, che sostituisceHVR1 parziale aminoacidi 139-144 di hexon5 ^14. ELDKWAS è un epitopo neutralizzante potente in HIV-1 gp41 ^19.

Durante la clonazione, c'erano due passaggi critici. Un passo è la selezione di due enzimi di restrizione quando sintetizzare l'interesse frammento di gene nella sezione del protocollo 1.1.1. La scelta dei due enzimi dipende condizionatamente dalla posizione di Ad capside da modificare, cioè., In questo studio, frammento di gene contenente Kwas stato designato incorporare nella HVR1 di proteine ​​hexon5. Enzimi di restrizione AGEI e ACCI esistono separatamente in N-terminale e C-terminale aree del locale HVR1 di accompagnamento, e non esistono nel frammento HVR1-Kwas, quindi AGEI e ACCI sono stati scelti per essere messi singolarmente al N-terminale e C- capolinea del frammento sintetizzato HVR1-Kwas. Poiché hexon è l'obiettivo principale di Ad NAbs, e specifici hexon epitopi neutralizzanti risiedono in tutte le HVR di hexon ^12,18, è possibile che the Hexon modificato Ad5 vettori con la strategia di Antigen Capside-Incorporation potrebbero guadagnare la possibilità di bypassare la neutralizzazione da sieri Ad5 positivi in vitro, e anche il Ad5 PEI in host. In questo studio, sia HVR1 e HVR5 sul vettore virale bivalente potrebbero contribuire alla fuga di neutralizzazione sieri Ad5-positivi. L'altro passaggio fondamentale era nella sezione protocollo 1.2.2. Dopo l'O / N incubazione della miscela di co-trasformato su LB agar, le colonie cresciute BJ5183 devono essere immediatamente coltura in liquido LB per O / N, e plasmidi devono essere immediatamente estratto dalle cellule BJ5183 pure. Ritardando procedure determinerà probabilmente potenziale ricombinazione e mutazioni, poiché il plasmide ricombinato nelle cellule BJ5183 non è stabile. La corretta plasmide dalla ricombinazione omologa deve essere trasformata in DH5α al fine di mantenere una stabile e correggere specie genoma.

Dopo la clonazione, c'erano due fasi più critiche. Ilprimo passo nella sezione del protocollo è di trasfezione. È necessario trasfettare il ricombinato Ad backbone plasmide in cellule che esprimono Ad5 E1 (HEK293), se il plasmide backbone è E1 gene soppresso. L'altro passo nella sezione del protocollo 2.3 è di circa upscaling virus. La procedura di base per upscaling virus segue il principio di upscaling virus standard da un pallone T-25 a T-75 palloni e di T-175 palloni. Tuttavia il numero di beute (T-75 e / o T-175) da utilizzare dipende dalla velocità di crescita del virus, sviluppo CPE causata dal virus, e la quantità di virus necessaria.

La strategia di Antigen Capside-incorporazione consente un'ampia applicazione sulle modificazioni annunci. Con questa strategia, è fattibile per modificare o integrare gli antigeni eterologhi su diversi importanti proteine ​​del capside, come hexon ^2,4,20, base Penton ²¹ e fibra ^22. Il capside proteina minore Pix terminale C ha anche mostrato promessa per il heterolantigene ogous / peptide incorporazione ^21,23. Oltre alla singola modifica, molteplici modifiche su annuncio con questa strategia anche raggiunto il successo. Esempi sono la generazione di bivalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ in questo studio di incorporazioni sia HVR1 e HVR5 di hexon5, e l'inserimento di due epitopi neutralizzanti di tipo enterovirus 71 in entrambi HVR1 e HVR2 o HVR1 e HVR4, o HVR1 e HVR5 di hexon3 ^24. Questi esempi implicano la fattibilità di modificazioni hexon in altri sierotipi di Ad, ai fini di una terapia genica o un approccio di vaccinazione. I nostri dati hanno anche dimostrato le incorporazioni di due epitopi cruzi Trypanosoma in hexon e Pix (dati non pubblicati). Questa strategia è stata estesa anche a fare vettori Ad chimerici sia per la vaccinazione o approcci di terapia genica. Esempi sono la generazione di Ad5H3 chimerico commutando hexon5 con hexon3 ^16, la generazione di Ad3H7 chimerico commutando hexon3 with hexon7 ^25, e la generazione di Ad5F4 chimerico sostituendo fibra Ad5 con Ad4 fibra ^26.

In questo studio, il bivalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His ₆ ha dimostrato la eliciting delle risposte immunitarie umorali specifici agli antigeni-di-interessi incorporati. Il nostro progetto attuale dimostra che la risposta delle cellule ASP2 specifica CD8 T è significativamente innescato da immunizzazione con un vettore Ad5-Pix-ASP2, che è stato generato incorporando ASP2 peptide in proteine ​​IX (PIX) di Ad5, con la strategia di Antigen Capside-Incorporation (dati non mostrati). ASP2, chiamato anche amastigote proteina di superficie 2, è un antigene immunodominante della digenetic intracellulare protozoo parassita Trypanosoma cruzi (T. cruzi) ^27. Questa nuova scoperta sperimentale estende la nostra conoscenza che l'applicazione della strategia di Antigen Capside-Incorporation on Ad vectored vaccini può suscitare non solo risposte immunitarie umorali, ma anche il immun cellularee risposte specifiche agli antigeni-di-interessi.

Anche se relativamente vantaggiosa per la strategia transgene tradizionale, la strategia di Antigen Capside-Incorporation ha anche tre svantaggi. Innanzitutto, essa non può consentire l'integrazione della gene-di-interessi finché tradizionale strategia fa. E 'stato riportato che la strategia Antigen Capside-Incorporation su hexon5 permette inserimenti di un massimo di 80 aminoacidi (aa) in HVR1, 77 aa in HVR5 e 57 aa in HVR2 ^2. Di cui, HVR1 è il locale più permissive per l'incorporazione. Tuttavia, il minore proteina del capside PIX può ospitare un inserimento di 1000 aminoacidi ^28. In secondo luogo, alcuni antigeni-di-interesse per la natura non riescono a incorporare nelle proteine ​​del capside di annunci, a causa di fattori quali le spese e le forze di aminoacidi, che sembrano disturbare la disposizione strutturale virus Ad. In questo caso, l'introduzione di appositi distanziali legata alla antigeni di interessi può aiutare the l'incorporazione di successo ^4. In terzo luogo, incorporazioni in alcuni locali HVR, vale a dire., HVR6 o HVR7 potrebbe portare a fallita generazione di vettori virali vitali ^12. Dati i vantaggi e gli svantaggi di entrambe le strategie, una selezione saggio dalle due strategie o una combinazione di entrambe le strategie dipenderà dalle specifiche condizioni / esigenze. Un esempio di pettinatura entrambe le strategie è la generazione di Ad5 / HVR2-MPER-L15 (Gag), per cui la regione esterna membrana prossimale (MPER) di HIV-1 gp41was incorporate in HVR2 del hexon5 con la strategia di Antigen Capside-Incorporation, e HIV-1 gene Gag stato inserito per sostituire il gene locale E1 di Ad5 con la tradizionale strategia transgene ^2.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health concede 5T32AI7493-20 e 5R01AI089337-03. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.