Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) wurde ausgiebig mit traditionellen Transgen Methoden zur Impfstoffentwicklung modifiziert. Die reduzierten Wirkungsgrade dieser traditionell geändert Ad5-Vektoren in klinischen Studien konnte in erster Linie mit Ad5 vorbestehenden Immunität (PEI) bei der Mehrheit der Bevölkerung korreliert werden. Um Ad5-vektorImpfstoffEntwicklung durch die Lösung der Anliegen der Ad5 PEI fördern, hat die innovative Antigen Capsid-Incorporation Strategie verwendet worden. Von Vorteil dieser Strategie Ad5 vektor wir zunächst die Hexon Shuttle konstruierte Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ / pH5S durch Subklonieren der hypervariablen Region (HVR) 1 von Hexon in einen zuvor aufgebauten Shuttle-Plasmid HVR5-His ₆ / pH5S, das hatte seine _6-Tag in die HVR5 eingebaut. Diese HVR1 DNA Fragment, das ein HIV-Epitop ELDKWAS synthetisiert. HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ / pH5S war dann linearisiert und co-transformiert mit linearisierter Plasmid-Rückgrat pAd5 / ΔH5 (GL),zur homologen Rekombination. Diese kombinierte Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ wurde in Zellen transfiziert, um erzeugen den viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His _6. Dieser Vektor wurde validiert, um qualitative Eignung durch virale Titer physikalischen (VP / ml) angegeben, infektiöse Titer (IP / ml) und entsprechende VP / IP-Verhältnis haben. Sowohl die HIV-Epitop und His ₆ -Tag waren oberflächenexponierten auf der Ad5 Kapsid, und behielt Epitop-spezifischen Antigenität ihrer eigenen. Ein Neutralisationstest zeigte die Fähigkeit dieser zweiwertigen Vektor Neutralisierung durch Ad5-positiven Seren in vitro zu umgehen. Mice Immunisierung zeigten die Erzeugung von robuster humorale Immunität spezifisch für die HIV-Epitop und His _6. Diese Proof-of-Principle-Studie vorgeschlagen, dass das Protokoll mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie assoziiert könnten durchaus für die Erzeugung von Ad5-vektor Impfstoffe durch Modifikation verschiedener Kapsidproteine ​​genutzt werden. Dieses Protokoll kann auch feiter zur Erzeugung von Seltenen Serotyp adenoviralen Impfstoffe modifiziert.

Humanen Adenovirus (Ad) ist eine mittelgroße, nicht umhüllte Virus mit einem ikosaedrischen Nukleokapsid, das eine doppelsträngige DNA-Genom. Anzeige gehört zu der Familie Adenoviridae, mit einer Einteilung in sieben Gruppen (A bis G). Jede Gruppe enthält Virus der verschiedenen Serotypen. Von denen, Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) aus der Gruppe C war der am besten untersuchten und die am meisten für vectored Ansätze wie die Gentherapie und Impfungen angewendet.

Die traditionelle Strategie Transgen wurde entwickelt und für Ad5 Modifikationen, die durch die Verschiebung der Virus-Early-Gene mit einem Gen von Interesse charakterisiert ist, und der fokussierte Expression des Gens von Interesse in einem Wirt. Beispiele sind der Bau von pENV9 / Ad5hrΔE3 durch Ersetzen des frühen Gens 3 (E3) mit rev-Gen des Simian Immunodeficiency Virus ^1, die Konstruktion AdCMVGag durch Ersetzen des frühen Gens 1 (E1) mit dem gag-Gen des Human ImmunodeficiencyVirus (HIV) ^2, und der Aufbau der Anzeige lac Z durch Ersetzen E1 mit lac Z-Gen ^3. Die breite Anwendung der traditionellen transgene Strategie für Ad5 hängt von folgenden Vorteile: die Vielzahl von Hosts für Ad5, die machbar Gentechnik auf Viren und Virusvermehrung, die große Aufnahme von Fremdgens Einsatz und die Sicherheit von Ad5 ^4,5. Allerdings sind die reduzierten Wirkungsgrade Ad5-vektor klinischen Therapien durch die Verwendung dieser Strategie war ein wichtiger Engpass, der kartiert hat in erster Linie mit Ad5 PEI zugeordnet werden, da Ad5 ist so weit verbreitet bei der Mehrheit der Kinder und Erwachsene ^4,6.

Um den Engpass von Ad5 zu überwinden, ist das vorrangige Ziel, eine alternative Strategie Umgehung Ad5 PEI zu entwickeln. Angeborenen Immunität ⁷ adaptiven Immunität wie neutralisierende Antikörper (NAbs) ^8-10 und CD8 ⁺ T-Zellantworten gegen ¹⁰ Ad5 wurde gezeigt, zusammenntribute zu Ad5 PEI mit Ad5 NAbs erscheinen, um die dominante Rolle bei den Beiträgen um Ad5 PEI ^10,11 zu spielen. Außerdem Ad5 NABS Zielepitope in Kapsidproteine ​​gelegen, darunter die Hauptprotein Hexon, Ballaststoffe und Pentonbasis. Davon ist Hexon das Hauptziel von Ad5 NAbs ^8,11-13. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine innovative Antigen Capsid-Incorporation Strategie eingeführt. Diese neue Strategie hebt die Ersatz oder Einbau von Proteinen von Interesse auf Ad5 Kapsid-Proteine, welche die Ad5 neutralisierende Epitope verschiebt oder Masken, die zur Anerkennung durch die verringerte NAbs und effiziente Ad5 Vektor Verwaltungen. Es ist bemerkenswert, dass diese Strategie ist wettbewerbsfähig, weil es kann auch helfen, Hosts zu entlocken robuste humorale Immunität und starke zelluläre Immunität durch direkte Präsentation von Antigenen von Interesse für das Immunsystem ^4,14,15. Auf der Basis dieser Strategie kann die molekulare Klonierung und rekombinante virale Vektor Ad Rettungsstrukturteilenin vier Schritten: (a) die Herstellung von Gen-of-Interest-Fragment entweder durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder der Synthese; (B) die Ligation des Genfragments in einem Shuttle-Plasmid, das das Gen von Interesse homologe Fragment und Arme an einen Adenovirus-Rückgrat enthält; (C) eine homologe Rekombination durch Co-Transformation mit dem Shuttle-Plasmid, das das Gen von Interesse Fragment mit dem linearisierten Plasmid-Rückgrat pAd5 / ΔH5 (GL) ^16; (D) die Transfektion linearisiert rekombinanten adenoviralen Plasmid zu retten, die das rekombinante Ad-Vektor mit Antigenen von Interesse aufgenommen.

Unsere Gruppe und einige andere haben dieses alternative Ad Einarbeitung Strategie für Ad vectored Entwicklung von Impfstoffen gegen verschiedene Infektionserreger erweitert. Wir berichteten die Erzeugung eines rekombinanten Vektors Ad Ad-HVR1-Lgs-His ₆ -V3 durch Einbringen eines His-HIV-1-Antigen V3 in die HVR1 Gebietsschema der Ad5 Hexon (hexon5). Dies erzeugt vector ausgelöst strOng humoralen Immunantwort spezifisch für die V3-Epitop ^4. Wir berichteten auch die Entwicklung von Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 indem HIV-1-Membran proximalen Ektodomäne Bereich (MPER) in die HVR2 locale hexon5 ^2. Darüber hinaus hat Dr. Zhous Gruppe die Vorteile dieser Ad Einbau-Strategie verwendet, um Ad-Serotyp 3 (Ad3) vektorisierte Impfstoffe, dh. Die Entwicklung, die Erzeugung von viralen Vektor R1SP70A3 durch den Einbau eines neutralisierende Epitop SP70 von Enterovirus 71 in den HVR1 der Ad3 Hexon (hexon3). R1SP70A3 erzeugt starke NAbs und IFN-γ Produktion spezifisch für das Epitop SP70, die auf die hohe Rate der Schutz gegen Enterovirus 71 Herausforderung ¹⁵ führen.

Zum Zwecke der technischen Referenz, nahmen unsere Studie Vorteil der qualitativen Antigen Capsid-Incorporation Strategie, sich auf die Erzeugung eines zweiwertigen Ad5 Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ konzentrieren indem ein HIV-1-Antigen in HVR1 einda His-Tag in der HVR5 hexon5. Die erzeugte Virusvektor wurde ebenfalls immunologisch bewertet. Das Antigen Capsid-Incorporation Strategie könnte auf die Entwicklung von Ad5-vektor Impfung Ansätze gegen verschiedene Infektionskrankheiten eingesetzt werden.

Die Universität von Alabama in Birmingham Institutional Animal Benutzung und Pflege Committee genehmigt die Verwendung von Mäusen, wie sie hier im Rahmen der genehmigten Protokoll-Nummer 101109272 beschrieben.

1. Genetische Konstruktion eines modifizierten Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie

1. Der Bau des Shuttle-Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ / pH5S
   1. Bestellen ein Plasmid, das die synthetisierte DNA Sequenz HVR1-KWAS zwischen den Restriktionsenzymstellen auf AgeI AccI von hexon5 Gens.
   2. Verdauen 6 ug des synthetisierten Fragments (HVR1-KWAS) mit den Enzymen AgeI (6 Einheiten) und AccI (6 Einheiten) für 3 Stunden bei 37 ° C. Die verdauten Fragments in einem 2% igen Agarosegel durch Elektrophorese und Reinigung des Fragments mit einem DNA-Gel-Extraktions-Kits gemß dem Protokoll des Herstellers.
   3. Bezogen auf das molare Verhältnis von Insert zu Vektor 3: 1, zu verwenden T4 DNA-Ligase und Ligase-buffer bis 12 ng des Fragments (HVR1-KWAS) in 100 ng eines zuvor aufgebauten Shuttle-Plasmid ligiert HVR5-His ₆ / pH5S ¹⁷ in einem Volumen von 10 ul bei Raumtemperatur für 2 h über den Stellen der AgeI und AccI.
   4. Transformations 1 ul von 10 & mgr; l des Ligationsprodukts in 50 ul elektrokompetente DH5a-Zellen in einem Elektroporator (bei 1800 V). Add 950 ul SOC-Medium zu den transformierten DH5a-Zellen und Inkubieren des Gemisches für 1 Stunde bei 37 ° C mit 300 Umdrehungen pro Minute. Verteilt 100-200 ul der 1 ml Mischung auf Luria-Bertani (LB) -Agar, enthaltend Kanamycin und inkubieren O / N bei 37 ° C.
      1. Auf Bildschirm ~ 10 Kolonien durch PCR gezielt den Fragment HVR1-KWAS, mischen Sie die Vorwärts-Primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), Reverse-Primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) und ein Einzel DH5a Kolonie in ein PCR-Master-Mix-Lösung (nach Herstellerprotokoll). Führen Proben auf einem Thermocycler unter Bezugnahme auf das Handbuch mit der PCR-Mastermix Lösung bereitgestellt.
      2. Verwenden Sie die Vorwärts-Primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), um das Fragment HVR1-KWAS in den Klonen im Abschnitt 1.1.4.1 abgeschirmt zu sequenzieren.
2. Konstruktion des Plasmids pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆
   1. Digest 6 ug HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ / pH5S mit Enzymen EcoRI (6 Einheiten) und PmeI (6 Einheiten) für 3 Stunden bei 37 ° C und Reinigung des Fragments, das die homologe Rekombination Arme und die Doppel modifizierten hexon5 Gen, wie in Schritt 1.1.2 angegeben. Linearisieren das Rückgrat Plasmid pAd5 / ΔH5 (GL) ¹⁶ mit SwaI.
   2. Co-Transformation 100 ng der Ziel-Fragment aus dem Shuttle-Plasmid und 100 ng des linea pAd5 / ΔH5 (GL) Rückgrat in 50 ul elektrokompetenter BJ5183-Zellen für die homologe Rekombination in einem Elektroporator (bei 1800 V). Add 950 ul SOC-Medium zu den transformierten Zellen und Inkubieren des Gemisches für 1 Stunde bei 37 ° C, 300 Upm. Verbreiten 100-200 ul der 1 ml Mischungauf der LB-Agar mit Kanamycin (final 50 ug / ml) für die O / N-Inkubation bei 37 ° C.
      1. Pick ~ 10 winzige Kolonien in 3 ml flüssiges LB, welches Kanamycin (final 50 ug / ml) für O / N Inkubation bei einem Schüttler (250 rpm, 37 ° C). Extrahieren Plasmide aus der Kultur. Verwenden Sie die PCR-Analyse, um die 10 Kolonien, indem sie auf das Fragment HVR1-KWAS Bildschirm wie in Schritt 1.1.4.1 dargestellt.
      2. Um die gleichen Kolonien durch PCR-Analyse zur Förderung der pIX Fragment des Backbone-Genom-Bildschirm, mischen Sie die Vorwärts-Primer (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), Reverse-Primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) und ein Einzel BJ5183 Kolonie in ein PCR-Master-Mix-Lösung (nach Herstellerprotokoll). Führen Proben auf einem Thermocycler unter Bezugnahme auf das Handbuch mit der PCR-Master-Mix-Lösung zur Verfügung gestellt.
      3. Bezeichnen die PCR doppelt positive Kolonien als pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His _6.
   3. Transform 100 ng des Plasmids pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ inum Zellen DH5 wie in Schritt 1.1.4 dargestellt.
      1. Verwenden Sie die PCR-Analyse zu, indem sie auf das Fragment HVR1-KWAS Bildschirm ~ 10 Kolonien, wie in Schritt 1.1.4.1 dargestellt.
      2. PCR-Analyse verwenden, um die gleichen Kolonien durch Targeting des pIX-Fragment des Genom-Backbone-Bildschirm, wie in Schritt 1.2.2.2 dargestellt.
      3. Verwenden Sie die Vorwärts-Primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), um das Fragment HVR1-KWAS in pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ sequenzieren.

2. Herstellung von modifiziertem Ad5 viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆

1. Bilden die Komplettmedium durch Zugabe von FBS (final 10%), 100X Non-essentiellen Aminosäuren (final 0,1 mm), 200 mM L-Glutamin (2 mM final) und Penicillin / Streptomycin-Lösung (final 1%) in DMEM mit hohem Glucose . Pflege der menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK293-Zellen) in vollständigem Medium in einem Brutschrank (37 ° C und 5% CO2 bei 85% befeuchteten Bedingungen).
2. Rettung von viralen vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆
   1. Samen 3,0 x 10 ⁶ HEK293-Zellen in einem T-25-Kolben mit 5 ml Vollmedium und Kultur O / N, um eine Monoschicht mit 80% Konfluenz zu erreichen.
   2. Linearisieren 15 ug pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ in einem Volumen von 100 ul mit dem Restriktionsenzym PacI (15 Einheiten) bei 37 ° C für 3 Stunden.
      1. Extrahieren linearisiert pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ durch Zentrifugieren der Reaktions zweimal (10.000 × g für 1 min) mit einem gleichen Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (Verhältnis 25: 24: 1) in einer Abzugshaube und durch sequentielle Zentrifugation (10.000 × g für 10 min) mit einer gemischten Lösung (300 & mgr; l 100% Ethanol und 10 ul Natriumacetat) und 700 ul 70% Ethanol. Überstand verwerfen an jedem Zentrifugationsschritt.
   3. Resuspendieren des gereinigten Plasmids in ~ 40 ul destilliertem Wasser und Tris-EDTA (TE) Puffer. Quantifizierung der Plasmid-DNA durch Messung der optischen density (OD) bei 260 nm.
   4. Transfektion von 3 ug des linearisierten Plasmids mit kommerziellen liposomalen Transfektionsreagenz im T-25-Kolben, entsprechend der Anleitung des Herstellers. Ändern Sie das Transfektionsmedium mit Komplettmedium bei 6 Stunden nach der Transfektion und nachfolgende Inkubation im Brutschrank. Pflegen transfizierten Zellen durch Ersetzen Komplettmedium alle zwei bis drei Tage, bis einzelne viralen Plaques bilden.
   5. Wenn Plaques entwickeln die volle cytopathische Wirkung (CPE), kratzen die restlichen Zellen von der Flasche in eine sterile Haube und des Ernte Zelllysat durch Zentrifugation Medium bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Suspendiere das Zellpellet in ~ 1 ml Medium, enthaltend 2% FBS und brechen die Zellen durch Einfrieren und Auftauen viermal. Sammeln Sie den Überstand, der nach dem Zentrifugieren gewonnenen Virus-Lysat bei 10000 g 10 min bei 4 ° C.
3. Groß angelegte Ausbreitung des viralen Vektors Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆
   1. Propagieren thE-Virus in einer T-75-Kolben, der HEK293-Zellen in der sterilen Abdeckung durch Infektion mit 1/3 bis volle Lysat aus dem T-25-Kolben. Erlauben Sie vollen CPE innerhalb von zwei bis drei Tagen in der Kulturbrutschrank zu entwickeln. Ernten Sie die Lysatüberstand wie in Schritt 2.2.5 angegeben.
   2. Propagieren das Virus in 2.59 T-175-Kolben in dem sterilen Haube durch Infektion mit 1/2 bis volle Lysat aus dem T-75-Kolben in Abhängigkeit von den Ausbreitungsbedingungen Virus. Erlauben Sie vollen CPE innerhalb von zwei bis drei Tagen in der Kulturbrutschrank zu entwickeln. Ernten Sie die Lysatüberstand wie in Schritt 2.2.5 angegeben.
   3. Propagieren das Virus in einem Dutzend oder mehr T-175-Kolben in dem sterilen Haube durch Infektion mit 1/2 bis volle Lysat aus dem vorherigen T-175-Kolben (n). Die Höhe der Kolben Nutzung basierend auf den Virusausbreitungsbedingungen und der Menge des Virus in der Notwendigkeit. Ernten Sie die Lysatüberstand wie in Schritt 2.2.5 angegeben, wenn sie voll CPE innerhalb von zwei bis drei Tage in der Kulturbrutschrank auf.
4. Purification von Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ durch Cäsiumchlorid-
   1. Man stellt zwei Dichten CsCl-Lösungen in 5 mM HEPES: 1,33 g / ml und 1,45 g / ml, während die Vermeidung des Kontakts mit CsCl.
   2. Last 4 ml CsCl (1,33 g / ml) in einer sterilen Ultrazentrifugenröhrchen, und sanft geladen 4 ml CsCl (1,45 g / ml) gegen die Unterseite des Rohres. Last 4 ml Lysatüberstand langsam auf der Oberseite der Gradienten in dem sterilen Haube.
   3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 110.000 × g für 3 Stunden bei 4 ° C, um das reife / niedriger Virusbande von der defekten / höhere Virusbande zu trennen. Sammeln Sie das untere Band unter Verwendung einer 3-ml-Spritze mit einer 33 G-Nadel bewaffnet und verdünnt das Band mit 5 mM HEPES mit einem 4 ml Volumen in der sterilen Haube.
   4. Legen Sie eine andere Röhre mit zwei Dichten von CsCl-Lösungen und der verdünnten Band von Virus, wie in Schritt 2.4.2 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 110.000 xg O / N bei 4 ° C. Sammeln Sie die Virus Band, wie in Schritt 2.4.3 beschrieben.
   5. Spritzen Sie die gesammelten Virus-Lösung in einem dialysKassette ist durch eine 3-ml-Spritze mit einer 33 G-Nadel in den sterilen Haube bewaffnet.
   6. Setzen Sie die Kassette in 700 ml 1x Dialysepuffer (1 L Rezept: 100 ml 10x PBS, 100 ml 100% Glycerin und 800 ml destilliertem Wasser, filtern die Puffer durch ein 0,22 um-Filter) und ersetzen Sie die Dialysepuffer alle 3 Stunden für 4 mal. Saugen Sie dialysierten Virus-Lösung unter Verwendung von Nadelvlies-Spritze.

3. Validierung des rettete viralen Vektor

1. Viralen Vektor Titrationen
   1. Für das Virus physikalischen Titers verwässern beide Virus und Dialysepuffer (Hintergrundkontrolle) bei 1: 10 und 1: 20 in Virus Lysepuffer (10% SDS in Tris-EDTA) in Röhrchen, und Inkubieren alle Röhrchen bei 56 ° C 10 min.
   2. Schalten Sie ein BioPhotometer und stellen Sie den Modus der Absorption bei OD 260 nm. Verwenden Sie den Dialysepuffer verdünnt (1: 10), um das Hintergrundsignal durch Klicken auf die "leere" unten auszugleichen. Geben Sie "10 + 90" im BioPhotometer screen, und lesen Sie das Signal des verdünnten Virus (1: 10).
   3. Lesen Sie das Signal des verdünnten Virus (1: 20) Nach dem Verfahren in Schritt 3.1.2, sondern geben Sie "5 + 95" im BioPhotometer Bildschirm. Multiplizieren die beiden Virusauslese Zahlen von 1.1x10 ¹² und der Berechnung der mittleren Titer mit einer Einheit wie VP / ml, basierend auf den zwei individuellen Titer der beiden Verdünnungen.
   4. Für das Virus infektiöse Titer (IP / ml), verwenden Sie die Karber statistischen TCID ₅₀ Verfahren ^14, um die Infektion Tiefe auf HEK293-Zellen nach 10 Tagen nach der Infektion zu bestimmen (dpi)
2. Bewertung der antigenen Belichtungsanzeige auf dem viralen Vektor
   1. Mantel der virale Vektor in einer ELISA-Platte und fahren Sie mit dem Rest der Schritte in einem Standard-ELISA-Verfahren ^14. Verwenden menschlichen anti-gp41 (2F5) monoklonale Antikörper (mAb) und Maus-anti-His Tag-mAb für den Nachweis von Antigenen ¹⁴ entsprechend eingebaut.
   2. Beheben Sie den viralen Vektor in einem denatured Protein-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und fahren Sie mit dem Rest der Schritte in einem Standard-Western-Blot-Verfahren ^14. Verwenden menschlichen anti-gp41 (2F5) monoklonale Antikörper (mAb) und Maus-anti-His Tag-mAb für den Nachweis von Antigenen ¹⁴ entsprechend eingebaut.
3. In-vitro-Bewertung des Vektors auf der Fähigkeit, Ad5-positve Seren umgehen
   1. Aufrechtzuerhalten HeLa-Zellen in Komplettmedium in der Kulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO ₂ bei 85% befeuchteten Bedingungen). Bilden die Komplettmedium durch Zugabe von FBS (final 10%), 200 mM L-Glutamin (2 mM final) und Penicillin / Streptomycin-Lösung (final 1%) in Minimum Essential Medium Eagle (MEME).
   2. Seed HeLa-Zellen in 6-Well-Platten mit 1x10 ⁶ Zellen / Vertiefung und inkubieren Sie die Platten in der Kulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO ₂ unter 85% befeuchteten Bedingungen) für 2 Stunden. Inkubieren Ad5-positiven Seren (0,1 & mgr; l bzw. 0 & mgr; l) mit 5 IP / Zelle viraler Vektor (Ad5 oder Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆₎ in dem Brutschrank 1 h vor der Zugabe der Mischungen auf die Platten mit 6 Vertiefungen, die Zellen enthält.
   3. Nach 24 Stunden nach der Infektion (hpi), spülen Zellen einmal mit PBS und lysieren Zellen in 0,5 ml Lysepuffer. Zentrifugieren bei 15.000 xg für 5 min und Sammeln des Überstandes. Mix 20 ul des Überstands mit 100 ul Luciferase-Substrat für die Luciferase-Signal das Lesen, da die Viren enthalten, die die Luciferase-Gens.

4. Immunologische Bewertung des rettete viralen Vektor

1. Bereiten Sie zwei Immunisierung Gruppen: Ad5 und Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His _6.
   1. Injizieren Mäusen (n = 8 / Gruppe) intramuskulär mit Viren zu 1x10 ¹⁰ VP / Maus, in einer homologen "Prime-Boost" Immunisierungsschema, mit einem Abstand von 2 Wochen.
   2. 2 Wochen nach jeder Injektion, bluten Mäuse ohne Betäubung durch Wange Blutungen mit Tierlanzetten (5 mm Spitzenlänge) bissammeln Blut in 1,5 ml-Röhrchen.
2. Mischen Sie das Blut in den Rohren durch Umdrehen auf und ab, und Inkubation das Blut bei Raumtemperatur 30 min. Dreh die Röhrchen bei 10.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Transfer Seren (Oberschicht), neue 1,5-ml-Röhrchen.
   1. Dreh die neue Röhrchen bei 10.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Transfer Seren neu bei -80 ° C markiert 1,5 ml Röhrchen für die Lagerung.
3. Auswertung der Antigen-spezifische humorale Immunität durch Seren basierenden ELISA
   1. Verdünnen Sein Peptid (Lager bei 1 mM) und HIV-1-Peptid (Lager bei 1 mM) separat in 100.
   2. mM Carbonatpuffer (pH 9,5), um das Peptid Beschichtungskonzentration auf 10 & mgr; M zu erreichen. Beschichtung der ELISA-Platten mit den Peptiden getrennt verdünnt durch Zugabe von 100 ul pro Vertiefung und Inkubation der Platten O / N bei 4 ° C.
   3. Waschen Sie die Platten mit PBST viermal mit 200 ul / Vertiefung und Block für 1 Stunde in 5% BSA in PBST. Gelten Mäuseseren auf die Platten in einer 1: 100 Verdünnung in Blockier buffer, 100 ul / Vertiefung. Inkubieren für 2 h bei RT inkubiert.
   4. Viermal Waschen Sie die Platten mit PBST. Die Platten durch Inkubation bei RT für 30 Minuten in Blockierungspuffer mit 100 ul / Vertiefung.
   5. Gelten Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP (1: 5000 in Blockierpuffer) mit 100 ul / Vertiefung zu den beiden mit seinem Peptid und HIV-1-Peptid einzeln beschichteten Platten. Inkubieren für 2 h bei RT. Mit PBST waschen die Teller.
   6. Lesen der Platten bei OD450 nm nach der Inkubation mit HRP-Substrat für 30 min.

Das Antigen Capsid-Incorporation Strategie (Abbildung 1A) wurde eingesetzt, um das zweiwertige Ad5 virale Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ zu erzeugen. Zunächst wird das Shuttle-Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ / pH5S wurde durch Subklonieren HVR1-KWAS Fragment in den früheren Shuttle-Plasmid konstruiert HVR5-His ₆ / pH5S ¹⁷ aufgebaut. Zweitens das Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ ¹⁴ wurde durch eine homologe Rekombination zwischen dem Fragment des "EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-His6-PmeI" und SwaI linearisierte pAd5 / ΔH5 konstruiert (GL ) ¹⁶ (1B). Transfektion von PacI verdaut pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ in einem T-25-Kolben führen zur Rettung der virale Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ ^14. Die geretteten Virus-Vektor wurde dann in großem Maßstab vermehrt und durch zwei Zyklen CsCl Gradienten Ultrazentrifuge gereinigt.

Damitdemonstrieren die Durchführbarkeit / Fitness des geretteten viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ ist die physikalische Titer wurde bei 1,3 x 10 ¹¹ VP / ml durch Messen der physikalischen Kopien viralen Genoms bestimmt, und der infektiöse Titer bei 1,4 x 10 ⁹ IP / ml durch Titration der tatsächlichen infektiösen Viruspartikeln bestimmt. Die VP / IP-Verhältnis wurde anschließend bei 92 ^14. In der Regel berechnet, Anzeigen mit einem VP / IP-Verhältnis unter 1,000 zeigt eine qualitative Eignung dieses Virus. Um zu zeigen, ob diese geretteten Virus zeigt die antigene HIV-Antigen und His-Tag, die jeweils auf der Oberfläche der Virushülle Hauptprotein hexon5 wurde ELISA mit menschlichen 2F5 mAb und Maus-Anti-His-Tag mAb bzw. vorgenommen. Ergebnisse zeigten, dass sowohl der menschliche mAk 2F5 (2A) ¹⁴ und Maus-anti-His-Tag-mAb (2B) ¹⁴ zeigten eine Bindung an Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6, wohingegen es keine Bindung mit dem negativen control Vektor Ad5. Western-Blot-Analyse wurde spezifischen Banden ungefähr 117 kDa nur im Ad5 Virus verwendet, um die Daten in der ELISA bestätigt, wie Human- 2F5 mAb (2C) ¹⁴ und Maus-anti-His-Tag-mAb (2D) ¹⁴ erfasst / H5- HVR1-KWAS-HVR5-His _6, die auf die Größe des hexon5 Proteins entspricht. Um das Potential der evaluieren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ bei der Umgehung Neutralisierung durch Ad5-positiven Seren, Neutralisationstest-Analyse durchgeführt, wie im Protokoll in Abschnitt 3.3 angegeben. Die Ergebnisse zeigten, daß die relative Lumineszenz-Einheit (RLU) Signal von dem viralen Vektor Ad5 mit 0 & mgr; l von Ad5-positve Seren behandelten 12-mal höher als die aus dem gleichen Vektor mit 0,1 ul des Ad5-positve Seren (p-Wert <0.001 behandelten ). Dies legte nahe, die Neutralisation des Vektors Ad5 durch den Ad5-positvive Seren. Im Gegensatz dazu gab es wenig Unterschied von den viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆mit 0 & mgr; l und 0,1 & mgr; l von Ad5-positve Seren (3) behandelt. Seit Hexon ist das Hauptziel der Ad NAbs und Hexon spezifische neutralisierende Epitope liegen in allen HVRS der Hexon ^12,18, oben gezeigt, dass Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ entkommen Neutralisation durch Ad5-positve sera die Daten in vitro und schlug vor, das Potenzial von Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ auf Umgehung Ad5 PEI in den Host.

Zu untersuchen, ob das modifizierte zweiwertige Ad5 virale Vektor mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie könnte robust humorale Immunität spezifisch für die Antigene einge von Interesse hervorzurufen, wurde die "Prime-Boost" Immunisierungsschema angewendet auf Mäuse, die mit Steuer viralen Vektor Ad5 und Immunisierung das zweiwertige Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His _6. Seren Basis ELISA mit HIV-1-Peptid beschichteten zeigte, dass Seren aus der Immunisierung Gruppe von Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ hatte significant die Bindung an das HIV-1-Peptid bei Verdünnungen zwischen 40 und 640, im Vergleich zu den Seren aus der Kontrollgruppe (p-Wert <0,001) (4A) ^14. Seren Basis ELISA mit seinem Peptid beschichteten zeigten, daß Seren von Immunisierungsgruppe Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ hatte eine signifikante Bindung an den His-Peptid im Vergleich zu den Seren aus der Kontrollgruppe, wie statistische p-Wert < 0,001 an den Seren-Verdünnungen von 40 und 80, p-Wert <0,01 bei einer Verdünnung von 160 und p-Wert <0,05 bei einem 320-Verdünnung (4B) ^14. Die obigen Ergebnisse zeigen die Erzeugung von humoralen Immunantwort gegen die Antigene auf der einge zweiwertige viraler Vektor ist.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der genetische Konstruktion von Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie. (A) Das Antigen Capsid-Incorporation Strategie ist gekennzeichnet durch direkt Antigen-of-Zinsen für die Kapsidproteine ​​(Hexon, penta Basis, pIX und / oder Faser) von Adenovirus anzuzeigen. Diese Zahl wurde von Nemerow angepasst et al., 2009, Virology 384 (2009) 380-388, Copyright Elsevier. (B) Genfragment (HVR1-KWAS) wurde synthetisiert und in einen pUC-Vektor von einem Unternehmen geklont. Dieses Fragment wurde in den zuvor konstruierten Shuttle-Plasmid subkloniert HVR5-His ₆ / pH5S von den Restriktionsenzymen AgeI und AccI zu HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ / pH5S generieren. Die resultierende Shuttle-Plasmid wurde mit den Enzymen EcoRI und PmeI und kotransformiert mit SwaI linearisierte Plasmid Rückgrat pAd5 / ΔH5 (GL) für die homologe Rekombination gespalten, was zu der Erzeugung des rekombinierten Plasmids Rückgrat pAd5 / H5-HVR1-KWAS -HVR5-His _6. In dieser Figur R1 HVR1 und R5 HVR5 und GL bezeichnet grün fluoreszierendes Protein (GFP) und luciferase, getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2. Bewertung der Antigenexposition von eingebauten Antigene auf der Kapsid-Oberfläche des zweiwertigen viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His _6. Whole viralen Vektor-ELISA wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die eingearbeiteten Antigene wurden auf Vektor exponierten Oberfläche, während antigenen Eigenschaften der eigenen. ELISA-Platten wurden mit dem zweiwertigen Vektor beschichtet und mit menschlichen 2F5 mAb (A) oder Maus-Anti-His-mAb (B) inkubiert. Daten wiesen auf die signifikante Bindung der Antikörper an das zweiwertige Vektor, aber nicht in dem Steuervektor Ad5. R1-KWAS-R5-His ₆ bezeichnet Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His _6. Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um die antigene Bindung des humanen 2F5 mAb (C) oder Maus-Anti-His-mAb (D) für die zugesetzten Antigene auf der zweiwertigen Vektor zu bestätigen. In beiden (C) und (D), Spur 1 zeigt Ad5, und Spur 2 anzuzeigen Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His _6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3. Bewertung der zweiwertigen viralen Vektors in der Lage ist, um die Neutralisation durch Ad5-positve Seren in vitro. Neutralisierungsassay entweichen wurde geprüft, ob das zweiwertige Vektor könnte die Neutralisation entziehen. Ergebnisse zeigten die Neutralisierung der Ad5-Virus durch den Seren, aber die esKap der Neutralisation des zweiwertigen Virus in vitro. In dieser Figur R1-KWAS-R5-His ₆ bezeichnet Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His _6. Die Sternchen *** kennzeichnet den p-Wert <0,001.

Figur 4. In vivo Erzeugung von humoraler Immunität durch das zweiwertige virale Vektor im Mausmodell. Sera basierenden ELISA wurde verwendet, um die humorale Immunität gegen das einge Proteine ​​auf der zweiwertigen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ evaluieren . HIV-1-Peptid (A) und seine Peptid (B) wurden in den ELISA-Platten getrennt aufgetragen, gefolgt von der Inkubation mit dem Mäuse-Seren von den beiden Immunisierungsgruppen (Ad5 und Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆₎ . Daten wiesen auf die signifikante Erzeugung von humoralen Immunantworten gegen das HIV-1-Antigen in HVR1 (A) und das His-Tag in HVR5 (B). Jeder Datenpunkt stellt Mittel und SD aus acht Wiederholungen. Die Sternchen *** kennzeichnet den p-Wert <0,001, ** bezeichnet den p-Wert <0,01, und * die p-Wert <0,05.

Die Anwendung des traditionellen Transgen Strategie Ad5 Modifikation für die Entwicklung von Impfstoffen wurde in erster Linie auf den Flaschenhals mit der Ad5 PEI ^4,6 zugeordnet vermindert worden. Dieser Engpass kann teilweise durch Anwendung der alternativen Antigen Capsid-Incorporation Strategie (Abbildung 1A) vermindert werden, da diese Strategie kann die Neutralisation von Ad5 NAbs entziehen indem neutralisierende Epitope von Ad5 mit Antigenen von Interesse, und erleichtert die Erzeugung von robusten Immunität zu den eingeAntiGene von Interesse. In dieser Studie wird die Erzeugung des modifizierten zweiwertige viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ wurde als Konzeptbeispiel (1B) eingebracht. Entsprechend dem Protokollabschnitt 1.1.1, das synthetisierte Fragment in der geordneten Plasmid enthält eine HIV-1 gp41 kurzen Gensubstitution im HVR1 locale hexon5. Die teilweise gp41-Gen kodiert für ein Epitop ELDKWAS, die ersetztTeil HVR1 von den Aminosäuren 139 bis 144 der hexon5 ^14. ELDKWAS ist eine potente neutralisierende Epitop in ^{HIV-1-gp41-19.}

Während der Klonierung, gab es zwei kritische Schritte. Einen Schritt war die Auswahl von zwei Restriktionsenzymen bei der Synthese der Genfragment Interesse an dem Protokollabschnitt 1.1.1. Die Auswahl der beiden Enzyme abhängig bedingt auf den Standort der Ad-Kapsid zu modifizieren, das heißt., Die in dieser Studie wurde Genfragment enthält KWAS bezeichnet in HVR1 hexon5 Protein einzubauen. Restriktionsenzymen AgeI und AccI vorhanden getrennt an N-terminalen und C-terminalen flankierenden Bereichen des HVR1 locale, und nicht in der HVR1-Fragment KWAS existieren somit AgeI und AccI wurden ausgewählt, um einzeln an N-Terminus und C gesetzt werden Terminus der synthetisierten Fragment HVR1-KWAS. Seit Hexon ist das Hauptziel der Ad NAbs und Hexon spezifische neutralisierende Epitope liegen in allen HVRS der Hexon ^12,18, möglich ist es, dass the Hexon modifizierten Ad5 Vektoren mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie könnte die Fähigkeit, die Neutralisation durch Ad5-positiven Seren in vitro umgehen zu gewinnen, und auch die Ad5 PEI im Wirt. In dieser Studie konnte sowohl HVR1 und HVR5 am zweiwertigen viralen Vektor zur Freisetzung von Neutralisation durch Ad5-positiven Seren bei. Die andere wichtige Schritt war im Protokoll Abschnitt 1.2.2. Nach dem O / N Inkubation von co-transformiert Mischung auf LB-Agar, müssen die Erwachsenen BJ5183 Kolonien in flüssigem LB sofort kultiviert O / N sein, und Plasmide müssen sofort von den BJ5183 Zellen extrahiert werden als gut. Eine Verzögerung der Verfahren wird wahrscheinlich auf mögliche Rekombination und Mutationen führen, da der kombinierte Plasmid in den Zellen BJ5183 ist nicht stabil. Das korrekte Plasmid aus der homologen Rekombination muss in DH5a, um eine stabile und richtige Genom Spezies aufrechtzuerhalten transformiert werden.

Nach dem Klonen wurden zwei weitere kritische Schritte. Dieerste Schritt in dem Protokollabschnitt ist etwa Transfektion. Es ist notwendig, die rekombiniert Ad Rückgrat Plasmids in Zellen, die Ad5 E1 (HEK293) ausdrücken, wenn das Rückgrat Plasmid E1-Gen deletiert transfizieren. Der andere Schritt in der Protokoll-Abschnitt 2.3 ist etwa Virus-Upscaling. Die grundsätzliche Vorgehensweise für die Virus-Upscaling folgt dem Prinzip der Standard-Virus-Upscaling von einem T-25-Kolben bis T-75-Flaschen und T-175-Kolben. Die Anzahl der Kolben (T-75 und / oder T-175) für die Verwendung ist jedoch abhängig von der Wachstumsgeschwindigkeit des Virus, das CPE Entwicklung durch die Virusinfektion verursacht wird, und der Menge des Virus erforderlich ist.

Das Antigen Capsid-Incorporation Strategie ermöglicht eine breite Anwendung auf Ad Modifikationen. Mit dieser Strategie ist es möglich, zu ändern oder zu übernehmen heterologe Antigene auf verschiedenen Kapsid Hauptproteine, wie ^2,4,20 Hexon, Pentonbasis ²¹ und Faser ^22. Das Kapsid kleinere Protein pIX C-Terminus zeigte auch, Versprechen für die heterollogen Antigen / Peptid Einarbeitung ^21,23. Neben der einzigen Änderung, erreicht auch mehrere Änderungen an Ad mit dieser Strategie Erfolg. Beispiele sind die Bildung von zweiwertigen Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ in dieser Studie durch Einbringungen sowohl HVR1 und HVR5 von hexon5 und den Einbau von zwei neutralisierende Epitope von Enterovirus Typ 71 in entweder HVR1 und HVR2 oder HVR1 und HVR4 oder HVR1 und HVR5 von hexon3 ^24. Diese Beispiele zeigen, die Machbarkeit der Hexon Modifikationen in anderen Serotypen von Ad, zum Zwecke der entweder Gentherapie oder Impfung Ansatzes. Unsere Daten zeigten auch die Eingemeindungen von zwei Trypanosoma cruzi Epitope in Hexon und pIX (unveröffentlichte Daten). Diese Strategie wurde ebenfalls erweitert, um chimären Ad Vektoren für die Impfung entweder oder Gentherapieansätze zu machen. Beispiele sind die Erzeugung von chimären Ad5H3 durch Umschalten hexon5 mit hexon3 ^16, die Erzeugung von chimären Ad3H7 durch Umschalten hexon3 with hexon7 ²⁵ und die Erzeugung von chimären Ad5F4 durch Ersetzen Ad5-Faser mit Ad4 Faser ^26.

In dieser Studie wurde die zweiwertige Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His ₆ gezeigt, die Auslösung der humoralen spezifisch für die Antigene eingeinteressiereImmunAntworten. Unsere aktuelle Projekt zeigt, dass das ASP2-spezifischen CD8-T-Zellantwort ist signifikant durch Immunisierung mit einem Vektor Ad5 pIX-ASP2, die durch den Einbau von ASP2 Peptid in ein Protein IX (pIX) von Ad5 generiert wurde grundiert, mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie (Daten nicht gezeigt). ASP2, auch amastigote Oberflächenprotein 2 genannt, ist eine immundominante Antigen des digenetic intrazellulärer einzelliger Parasit Trypanosoma cruzi (T. cruzi) ^27. Diese neue experimentelle Befund erstreckt sich unserer Kenntnis, dass die Anwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie Ad vektorisierte Impfstoffe können nicht nur die humorale Immunantworten hervorzurufen, sondern auch die zelluläre Immune Antworten spezifisch für die Antigene von Interesse.

Obwohl vergleichsweise vorteilhaft auf die traditionelle Transgen-Strategie hat das Capsid-Antigen Incorporation Strategie auch drei Nachteile. Erstens ist es nicht die Aufnahme von Gen von Interesse ermöglichen können, solange traditionelle Strategie tut. Es wurde berichtet, dass das Antigen Capsid-Incorporation Strategie hexon5 ermöglicht Insertionen von maximal 80 Aminosäuren (aa) in HVR1, 77 aa und 57 aa HVR5 in HVR2 ^2. Davon ist HVR1 die permissive Gebietsschema für den Einbau. Jedoch kann die weniger häufiges Kapsidprotein pIX eine Insertion von 1000 Aminosäuren ²⁸ aufzunehmen. Zweitens, einige Antigene von Interesse in der Natur versagen bei der Einbeziehung in die Ad-Capsidproteine, wegen der Faktoren wie Kosten und Kräfte der Aminosäuren, die die strukturelle Anordnung der Ad-Virus zu stören scheint. In diesem Fall ist die Einführung geeigneter Abstandshalter an die Antigene von Interesse verbunden sind, können helfen, the erfolgreiche Einarbeitung ^4. Drittens Eingemeindungen in einigen HVR locales, dh., HVR6 oder HVR7 könnte gescheitert Generation von lebensfähigen viralen Vektoren ¹² führen. Angesichts der Vorteile und Nachteile der beiden Strategien wird eine kluge Auswahl aus den beiden Strategien oder eine Kombination beider Strategien von den spezifischen Bedingungen / Anforderungen abhängen. Ein Beispiel für das Kämmen beide Strategien ist die Erzeugung von Ad5 / HVR2-MPER-L15 (GAG), wodurch die Membran-proximalen äußeren Bereich (MPER) von HIV-1 in gp41was HVR2 hexon5 mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie integriert, und HIV-1 Gag-Gen wurde eingesetzt, um das E1-Gen locale von Ad5 mit dem traditionellen transgene Strategie ² ersetzen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Arbeit wurde teilweise durch National Institutes of Health gewährt 5T32AI7493-20 und 5R01AI089337-03 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.