Протоколы Получение зиготических и соматических эмбрионов для изучения Положение раннего развития эмбрионов в Типовом бобовых

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Раннего эмбриогенеза, начиная с одной зиготы клетки проходит быстрого деления клеток и морфогенеза, и морфологически характеризуются предварительно шаровидные, шаровых, сердце, торпедных и семядольных этапов. Это прогрессивное развитие находится под жесткой регуляции сложной молекулярной сети. Сбор достаточно ранние эмбрионы на аналогичной стадии развития имеет важное значение для исследования клеточного и молекулярного регулирование раннего эмбриогенеза. Это не просто, так как в начале эмбриогенеза подвергается быстрому морфогенез в короткое время например 8 дней для Medicago truncatula достичь ранней стадии семядолей. Здесь мы решить проблему двумя подходами. Первый устанавливает связь между развитием эмбриона и под-морфологии, помогая указать этап зиготического эмбриона. Это особенно на основе количества стручка спиралей и развитие шипов. Альтернативный способ, чтобы дополнить в естественных условиях сtudies осуществляется через культивирование листовых эксплантов для получения соматических эмбрионов. Носитель содержит необычное сочетание гормона - ауксин (1-нафталинуксусной кислоты) цитокинина (6-бензиламинопурина), абсцизовой кислоты и Гиббереллиновая кислоты. Различные этапы можно выделить растущие из каллуса без вскрытия.

Бобовые третий по величине семейство высших растений с примерно 20000 видов и (или) Fabaceae семейства бобовых являются второй зерновых в области собрано и общий объем производства ^1. Соя является третьим по величине урожай выращивается. Зерновые бобовые обеспечить около одной трети диетического белка и одной трети растительного масла для потребления человеком ^2. Бобовые с их N ₂ крепления емкости также способствуют устойчивых сельскохозяйственных систем. Medicago truncatula, как соя, магазины белка и масла в семядолях его семян и генетических и геномных модель бобовых со значительными генетическими и геномных ресурсов ^3,4. В то время как М. truncatula позволило достижения в понимании бобово-Rhizobium симбиоз ⁴ было больше используются для изучения бобовых семян биологии ^5-7 и эмбриогенеза ^8,9. Arabidopsis эмбриогенез была тщательно изучена ^10,11, но это яса небобовых и детали эмбриогенеза не идентичны Medicago ^8,10. Зиготических эмбриогенез в М. truncatula имеет интересные особенности, с характерным многоклеточного гипофиза, в endoployploid суспензорные и базальная передачи ячейки ^8.

Соматического эмбриогенеза (SE) обычно используется для регенерации растений ^12. В бобовых модели М. truncatula, семян линии Jemalong 2HA (2HA) была разработана с родителем Jemalong иметь высокие темпы соматического эмбриогенеза ^13. Количество эмбрионов, полученных в последнее время существенно увеличивается при добавлении как Гиббереллиновая кислоту (GA) и АБК (ABA) в давние среды ^14. В этом случае А. и ABA синергически, что является необычным, учитывая, что А. и АБК, как правило, действуют антагонистически ^14. Эмбрионы, полученные из каллуса развиваются на поверхности, которая позволяет стадии эмбриогенеза, чтобы быть легко определены visuallу и легко собирают. Имея рядом изогенных линий, которые эмбриогенный (2HA) и не эмбриогенный (Jemalong) облегчает исследование соматического эмбриогенеза и имеющий как в естественных условиях и в пробирке систем обеспечивает различные экспериментальные возможности.

Понимание клеточные и молекулярные механизмы развития эмбриона имеет важное значение для понимания семян и развития растений. В бобовых, как и в других двудольных, это семядоли зародыша, что хранить продукты, которые используются для питания человека. Раннего эмбриогенеза включает быстрое деление клеток, и правильное структурирование эмбриона. В примерно 8 дней после оплодотворения, в М. truncatula эмбрион достигает ранние стадии семядолей. Морфологическая характеристика точно не указывается дней после оплодотворения в условиях теплицы. Таким образом, эффективность стандартизированный подход, чтобы указать на сцену развивающихся эмбрионов является ценным в изучении генетического REGULвания раннего эмбриогенеза зиготического.

В этой статье, мы предоставляем два стандартизированных протоколов для сбора развивающиеся эмбрионы для биологических исследований эмбриогенеза в бобовых модели М. truncatula. Первый заключается в сборе зиготических эмбрионов, связывая эмбриогенеза и стручок морфологию, а второй соматического эмбриогенеза с помощью культивирования листовых эксплантов, чтобы обеспечить доступ легко большое количество эмбрионов.

1. зиготических развития эмбриона

1. Растительный Материал
   1. Расти люцерны truncatula дикого типа Jemalong или его почти изогенных, высоко повторно генерируемых генотип Jemalong 2HA ¹³ (известный как 2HA) в теплице с 14 ч фотопериода и 23 ° C / 19 ° C день / ночь температуре.
      1. Пирс поверхность кожуры (с 23 G иглой) до посева семена так, чтобы вода допускаются семена и замочить в воде на ночь. Добавить достаточно воды, чтобы полностью покрыть семена.
      2. Сейте семена 3 в каждом 15 см диаметр горшка (в общей сложности 10 горшков) в горшечной смеси (крупнозернистого песка, перлита, торфа кокосовой-(1: 1: 1) плюс 5 г Osmocote Точный стандарт: медленное высвобождение удобрений) и передачи теплицы. Сохранить здоровую рассаду после прорастания, так что 1 завод в горшок и окружают шпалере для стебли растений, чтобы подняться.
2. Сбор Бобы
   1. Соберите стручки от WМН тип Jemalong или 2HA получить соответствующие этапы раннего эмбриона, как впервые описано ^9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные этапы стручок показаны на рисунке 1, и соответствующие этапы эмбриона показано на рисунке 2.
   2. Проверьте различные этапы стручок на урожай, используя критерии, как показано в Таблице 1. Измерьте время, прошедшее с этапа 6, чтобы помочь отдельные этапы 6 и 7 (таблица 2).
3. Пройдя яйцеклетки из стручков и проверки зачаточном
   1. Изолировать яйцеклетки из стручков с использованием тонких щипцов одна или стерео микроскопом рассекает щипцов и по мере необходимости. При необходимости стадия эмбриона может быть быстро проверена с помощью стандартного соединения микроскопа (рис 3B).
   2. Готовят раствор модифицированного Hoyer, содержащей 7,5 г гуммиарабика 100 г хлоралгидрат, 5 мл глицерина, 60 мл деионизированной дистиллированной воды. Растворите перемешиванием в течение 3-5 ч или в течение ночи.
   3. Для получения более подробной Уточнитьд микроскопии очистить расчлененные яйцеклетки в растворе ^15,16 модифицированной Хойер в. Тщательно подобрать нетронутыми яйцеклеток и место в небольшом объеме раствора Хойер (в достаточно, чтобы покрыть яйцеклетки) при комнатной температуре до освобождения.
   4. Просмотреть образцы с дифференциальным вмешательство контрастности (ОПК) оптики. Захват изображений iwth цифровой камеры ⁹ (рисунок 2).
   5. Получить наиболее однородные яйцеклетки из центральной части стручка и накапливать необходимого количества. Пример показан на фигуре 3А. Сбор яйцеклеток на льду и хранят при необходимой температуре (-80 ° С в течение нуклеиновые кислоты) для дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации по анализу гистологических срезов, трансмиссионной электронной микроскопии, а в гибридизация см статей ^8,9.

2. соматического развития эмбриона в пробирке

1. Используйте М. truncatula сорт тшляпа может легко образуют эмбрионов в культуре. Для этого протокола для листовых эксплантов использовать 2HA растения ^13,17, которые 2-4 месяцев.
2. Возьмите листовки с последней почти полностью расширенной трехлистной лист с удлиняя стебля.
3. Держите тройчатые листья на влажной бумаге полотенец в культуральной горшок, чтобы избежать обезвоживания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как тройчатые листья собирают они должны быть использованы с минимальной задержкой.
4. Приготовление питательной среды
   1. Использование P4 10: 4: 1: 5 в среду агара (0,8% W: V) в 9 см чашки Петри.
      Примечание: P4 10: 4: 1: 5 среда состоит из минимальной среды Р4 ¹⁸ плюс 10 мкМ 1-нафтилуксусной кислоты (NAA), 4 мкМ 6-бензиламинопурин (БАП), 1 мкМ абсцизовой кислоты (ABA) и 5 мкМ гибберелловой кислота (ГК). Использование GA + ABA ускоряет образование эмбриона и вызывает существенные увеличения числа эмбрионов ^14.
   2. Макияж Р4 базальной среды в 1 л; состоящий из основных солей (сделать calciuм отдельно), незначительные соли и витамины (Таблица 3), хелатного железа (составляют отдельно), казаминокислот (гидролизат казеина), 30 г сахарозы, 8 г агара.
   3. Магазин исходные растворы основных солей, кальция, казаминокислот, незначительные солей и витаминов при -20 ° С в подходящих аликвотах. Хранить хелатного железа при 4 ° С.
   4. Составляют хелатного железа (200x) путем растворения 7,44 г Na ₂ EDTA • 2Н ₂ О приблизительно 900 мл деионизированной дистиллированной воды при перемешивании, а затем довести раствор до 98-99 ° С при добавлении 1,853 г FeSO ₄ • 7H ₂ О. Наконец составлять до 1 л, когда ингредиенты растворяются. Хранить в янтарную окраску бутылки на 4 ° C.
   5. Макияж P4 базальной среды с фондовых решений, как в таблице 4. Гормоны в среде 10 мкМ НУК, 4 мкМ БАП, 1 мкМ АБК, 5 мкМ Г.А. (см таблицу 4 и конкретные материалы таблицу). Добавить НААи БАТ перед автоклавированием и добавить ABA и GA после автоклавирования и охлаждения до примерно 55 ° С, используя фильтр стерилизации с помощью фильтра 0,22 мкм, прикрепленной к шприцу. Все хорошо перемешать, осторожно закрученного.
   6. Отрегулируйте СМИ до рН 5,8 с помощью 1 М КОН до автоклавирования. Автоклаве при 121 ° C в течение 20 мин.
   7. После автоклавирования добавить стерилизовали фильтрованием и ABA GA, и залить приблизительно 25 мл среды в стерильные 9 см чашки Петри в колпаке с ламинарным потоком или биологической шкафу. Круто и агар установить с крышкой прочь. Затем положить на крышке и убедитесь, что нет конденсата на крышке. Этикетка по мере необходимости, и хранят при температуре 4 ° С (в картонной коробке, чтобы предотвратить крышки конденсат).
5. Стерилизация ткань листа
   1. Работа в капюшоне ламинарного потока УФ-стерилизации или биологической кабинета.
   2. Место оставляет в сетчатый шар ранее автоклавного весной чайник для заварки.
   3. Погрузитесь чай заварочный, содержащий листья в 70% (по объему) этанола в кульра горшок в течение 30 сек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех шагов в этой процедуре использовать 250 мл винтовой крышкой из поликарбоната культуры горшки, которые автоклавного.
   4. Drain, а затем передать и погружают ткань листьев в 1: 8 (по объему) разбавляли отбеливателя (0,5% активного хлора) в течение 10 мин. Вихревой нежно время от времени.
   5. Слейте отбеливатель и передать чай заварочный в культуральной горшок, содержащей стерильную деионизированную дистиллированную воду. Аккуратно водоворот и слейте лишнюю воду. Повторите еще раз с свежей культуральной горшок стерильной деионизированной дистиллированной воде.
   6. Удалите листья из чая для заварки с стерильным пинцетом в свежей культуральной горшок стерильной деионизированной дистиллированной воде. Винт на стерильной крышкой и промыть обращением и закрученной. Оставьте листья не плавают на стерильной воде до готовности, чтобы подготовить эксплантов.
6. Подготовка и Покрытие ЭКСПЛАНТОВ
   1. Использование стерильных методов, отделка отдельных стерилизованных листовки от края с помощью скальпеля и сократить оставшееся прямоугольник в двух или Thrи ее прямоугольные эксплантов (8-10 х 3-5 мм) с середины вены в центре каждого эксплантов (рис 5А).
      Примечание: размер эксплантов очень важно в инициировании первый callusing. Провести резка на стерильных крышек от вынос пищевых контейнеров.
   2. Пластина 6 эксплантов на агар-затвердевает культуральной среде в 9 см в диаметре чашки Петри (рис 5б). Плита эксплантов абаксиальной стороной вниз, чтобы поддерживать обычный ориентацию листа.
   3. Печать на чашки Петри с Parafilm (рис 5в) растянутые вокруг блюдо. Ткань готов к инкубации.
7. Ткань Инкубационный
   1. Инкубируйте пластин в темноте при 28 ° С в контролируемой комнатной температуре или в шкафу роста в течение всего периода культивирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксплантаты будет инициировать дедифференцировку, пройти деление клеток, пролиферация (каллусообразования) и эмбриогенеза (дифференциации).
   2. Субкультуры дифференцирующего explaНТС после 3 недель на свежую среду. В этой субкультуры передать весь эксплантов с помощью стерильного шпателя из нержавеющей стали и щипцы, в ламинарном боксе или биологически опасных шкафу. В callusing происходит и каллуса превышает размер самого большого на рисунке 5С, передавать 50% от индивидуального каллуса при пересева в свежую среду.
   3. Соблюдайте первые эмбрионов в течение 4 недель. В то время как есть степень синхронности, собирать различные этапы эмбрионов в течение 4-8 недель инкубационного периода (рис 6а, б). Сбор при вскрытии микроскопом и способа согласно экспериментальных целей.
   4. Пересевают каждые 3 недели и периодически удалять эмбрионов, так что экспланты будет продолжать производить эмбрионов в течение 3 месяцев.

Для зиготических эмбриогенеза отличается стручок структур, отвечающих различных этапах эмбриона показаны на рисунке 1А - F в то время как различные этапы эмбриона показано на рисунке 2А - F. Выбрав стручки на той же стадии, образцы семяпочек, что достаточно равномерное могут быть получены (фиг.3А). С помощью RT-КПЦР эмбрион конкретные гены могут быть легко обнаружены и время курс исследования оценивали ^9. Некоторые дополнительные рассечение позволит для дальнейшего обогащения эмбриона (фиг.3В). Обработка для стратегии на месте гибридизации могут быть легко осуществляется, а также каких-либо дополнительных исследований с участием свет (рис 4А, Б) и электронной микроскопии ^8. Особую ценность в этой системе своеобразие гипофиза и Подвесы (рис 4А, Б).

Для соматического эмбриогенеза грUtting начального эксплантов из отдельных folioles показано на фиг.5А. В эксплантаты помещали абаксиальная стороной вверх в тесном контакте с агаром (фиг.5В). После мозоли эмбрионы образование начинают появляться через 3-4 недель и 7 недель имеются многочисленные эмбрионов на стадии семядоли (5С). Следуя пластины через между недель 4 и 7 эмбрионов в дискретных стадий может быть расположен (6А, В). Различные этапы эмбрион может быть легко и просто наблюдали снимается для анализа. Это может быть довольно быстрый способ получить определенные типы информации. Например 7 показано, как эмбрионы на ранней стадии семядоли показал выражение одного типа гена MtOLEOSIN, но не другой. Время курсы исследования интересующего гена затем может быть изучены с помощью зиготического или соматических эмбрионов. Особым преимуществом соматической системы эмбриона, что преобразование calluс может быть выполнено без регенерации в целое растение и экспрессию гена на разных стадиях эмбриогенеза визуализировали с использованием GUS (β-глюкуронидазы) или флуоресцентные метки. Пример показан на рисунке 6С.

Рисунок 1: Под морфология и этапы развития эмбриона Бобы на разных стадиях развития эмбрионов с на дискретных этапов.. Этапы 2-7 указывается. (А) и (Б) этапы 2 и 3 очень ранние и ранние предварительно шаровое (С) стадия 4 в начале шаровое (D), 5 этап поздно шаровое (Е) стадия 6 сердца и (F), этап 7 в конце торпеды. Бар 2 мм. Стадия I является цветения (не показан).

Рисунок 2: Этапы развития эмбриона. </ STRONG> Очищенные эмбрионов на разных стадиях развития. () Этап 3 в начале до шаровидные, (B), 4-й стадии раннего шаровидные, (С) 5 этап поздно шаровидные, (D), этап 6 сердце, и (Е) стадия 7 в конце торпеды. Бар 60 мкм.

Рисунок 3: Изолированные яйцеклетки () Группа яйцеклеток со стадией 5 эмбрионов.. (Б) Яйцеклетка смотреть под микроскопом стандартной соединения, чтобы показать эмбрион, который может быть вырезан на "крючок" конца. Бар 1 мм (А) и 200 мкм (Б).

Рисунок 4:. Морфология эмбриона на ранней стадии () Разрез очень ранней эмбриональной шоуING эмбриона надлежащего (четыре клетки), гипофиз (Следующие четыре клетки), суспензорные (следующие четыре клетки, которые имеют большие вакуоли) и отношения к яйцеклетка тканей. (Б) Разрез рано торпеды стадии эмбриона (Е) с видным суспензорные (S). Окраска толуидиновым синим. Бар 10 мкм (А) и 50 мкм (Б).

Рисунок 5:. Культивирование эксплантов для производства соматических эмбрионов () тройчатые листья, показывающие, где принимаются эксплантов из foliole. (B) Эксплантов покрытием на агаре. (С) Соматические эмбрионы, полученные из эксплантатов после 7 недель культуры. Бар IS10 мм

Рисунок 6: соматические этапы эмбрион и идентификации местоположения генов expressioп с помощью преобразования и GUS. () соматических эмбрионов в шаровом (G), сердце (H) и торпедных (T) этапов. (Б) Соматические эмбрионы на ранней стадии семядоли. (С) шаровых этап соматических эмбрионов, показывая сильное выражение GUS для гена MtWOX9 в собственно эмбриона (Е) и уменьшение окрашивание в гипофизе (H) и суспензорные (S). Бар (A, B) 100 мкм. Бар (С) составляет 50 мкм.

Рисунок 7: Экспрессия генов duing эмбриогенеза в пробирке с использованием количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) экспрессии генов OLEOSIN3 (A) и (B OLEOSIN4) в начале семядольных зародышей стадии, вырезанных из эмбрионов из каллуса эмбриогенного.. Выражение относительно тО лист. Стандартные ошибки указаны.

Таблица 1: Критерии для сбора стручков этапах Морфологические критерии, используемые при определении стручок этапы, соответствующие определенных этапов эмбриона..

Таблица 2. Время курс для сбора стручок. Время от тон предыдущем этапе развития эмбриона указано в днях.

Таблица 3: P4 среде компоненты среды P4..

Таблица 4: Составление P4 среду с гормонами Составление P4 среду с гормонами из растворов..

Протоколы, описанные относительно прямо вперед, и позволяют исследование бобовых эмбриогенеза со всей современной клетки и молекулярных методов. Мы признаем, что есть преимущества и недостатки как в естественных условиях и в пробирке подходов. Оба позволяют больше внимания на раннем эмбриогенезе сравнению с культурой незрелых семян ^19.

В случае исследований в естественных условиях, что описаны преимущественно выделение яйцеклетки из стручка, который подходит для многих исследований эмбриона. Это, конечно, можно дополнительно обогатить для эмбриона ткани отрезая "крючке" область (рис 3B). Это трудно отделить очень ранней стадии развития эмбриона в течение disection эмбрион часто теряются, как он не очень хорошо прикреплена к смежной ткани, что делает использование выгодных семяпочек. Использование стручок морфологию исключает пометки цветов и имеющий времени CМедведица режим для каждого цветка. Кроме того, есть потенциал изменчивости развития методов синхронизации, если среда не очень жестко контролируется. Оптимальная роста растений очень важно, чтобы формирование стручок не происходит в условиях стресса. Ознакомиться с развитием стручок и незначительные корректировки могут быть сделаны, чтобы определить морфологические этапы, чтобы соответствовать конкретным этапы развития эмбриона.

В случае соматического эмбриогенеза, он должен признать, что эмбрионы получены бесполым, а не из зиготы. Кроме того, источник питания отличается от зиготического эмбриона. В случае соматических эмбрионов, что культуральная среда и окружающие каллус, и в случае зиготического эмбриона это эндосперм. Это означает, Подвесы гораздо лучше разработаны в случае зиготического эмбриона (фиг.4А, В). Конкретное значение М. Система truncatula является большое количество эмбрионов в ответ на необычный четыре Hormonе режим. Если большое число не происходит, то проверять детали составления гормоны и их добавление к среде должны быть проверены. Как и в любой методологии культуры стерильности эксплантата ткани без повреждения (сделать небольшие корректировки сроков этанола и гипохлорита раз стерилизации, если это проблема) важно вместе с уходом в поддержании стерильности во всех препаративных шагов.

То, что мы обнаружили, что он ценен для дополнения в естественных условиях и в пробирке процессов. Пример из наших исследований является изучение фактора транскрипции MtSERF1 (соматических эмбрионов, СВЯЗАННЫЕ ФАКТОР 1), которая является ген фактора транскрипции ответ этилена. MtSERF1 был впервые обнаружен в соматических эмбрионов с использованием RNAi, промотор-GUS слияния и в месте гибридизации; и затем показано, что выражается в зиготического эмбриогенеза ^20.

Изучение эмбриогенеза бобовых важно для чУмань питание, и с помощью М. truncatula эмбрионов вместе с клеточных и молекулярных технологий в настоящее время доступных может повысить эту область. Понимание может быть получено в том размер эмбриона и, следовательно, выход могут быть оптимизированы с требуемой углеводной композиции, масла и протеина. Эти детерминанты во многом устанавливается в поезде в начале эмбриогенеза ^8,9.

The authors declare that they have no competing interests.

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.