모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

단일 세포 접합자부터 초기 배 발생이 빠른 세포 분열 및 형태 형성을 통해 진행하고, 형태 학적으로 전 구형, 구형, 심장, 어뢰 및 자엽 단계를 특징으로한다. 이 진보적 개발 복잡한 분자 네트워크의 타이트한 규제 받고있다. 개발의 유사한 단계에서 충분한 초기 배아를 수확하는 것은 초기 배아의 세포 및 분자 규제 조사를 위해 필수적이다. Medicago 예 : 팔일이 초기 자엽 단계에 도달 truncatula 동안 초기 배 발생이 짧은 빠른 형태 형성을 거쳐 때문에 이것은 간단하지 않다. 여기서 우리는 두 가지 방법으로 문제를 해결. 첫 번째는 접합체 배아의 단계를 나타내는 데 배아 개발 및 포드 형태 사이의 연결을 설정합니다. 이것은 특히 포드 나선과 등뼈의 개발의 수에 기초한다. 생체의를 보완하는 다른 방법tudies는 체세포 배아를 생산하는 배양 잎 외식를 통해입니다. 매체는 비정상적인 호르몬의 조합을 포함 - 옥신 (1 naphthaleneacetic 산), 사이 토키 닌 (6 benzylaminopu​​rine), 아브 산, 지베렐린 산을. 다른 단계는 절개없이 캘러스의 성장 식별 할 수 있습니다.

수확 면적과 총 생산량 ¹ 곡물에 두 번째 콩은 약 20,000 종과 콩과 (또는 콩과 (Fabaceae)) 가족과 함께 고등 식물의 세 번째로 큰 가족입니다. 콩은 세 번째로 큰 재배 작물이다. 곡물 콩류는식이 단백질의 3 분의 1과 인간의 소비를 ² 식물성 기름의 3 분의 1에 대해 제공합니다. 자신의 N ₍₂₎ 고정 용량 콩은 그 씨앗의 자엽 콩, 저장 단백질과 기름처럼. 지속 가능한 농업 시스템에 Medicago의 truncatula 기여 상당한 유전자와 게놈 자원 ^3,4와 유전자 및 게놈 콩과 식물 모델이다. M. 동안 truncatula는 점점 콩과 식물 씨앗 생물학 ^5-7 및 배아 ^8,9을 연구하기 위해 사용 된 콩과 식물 - 근류균 공생 ⁽⁴⁾ 이해의 발전을 가능하게했다. 애기 배아 광범위 ^10,11 공부하지만 난되었습니다SA 비 콩과 식물과 배아의 세부 사항은 Medicago ^8,10 동일하지 않다. 엠의 접합체 배아 truncatula는 특유의 다세포 뇌하수체, endoployploid suspensor 및 기저 전송 세포 ^8, 흥미로운 기능을 가지고 있습니다.

체세포 배 (SE)는 일반적으로 식물 ^(12)를 재생하는 데 사용됩니다. 콩과 식물의 모델 (M)에서 truncatula는, 부모 Jemalong에서 개발 된 종자 라인 Jemalong 2HA (2HA)는 체세포 배 ^(13)의 높은 비율을 가지고있다. 생성 된 배아의 개수는 최근 실질적 노포 매체 ^(14)에 모두 산 지베렐린 (GA)과 아브 산 (ABA)을 추가하여 증가하고있다. GA와 ABA는 일반적으로 길항 ^(14)의 역할을 주어진 특이한 시너지이 경우 GA 및 ABA의 행동합니다. 캘러스로부터 생성 된 배아는 배아의 단계를 용이 visuall 결정될 수 있도록 표면에 개발Y 쉽게 수확. 체세포 배의 조사 (Jemalong) (2HA) 배 발생 및 비 배아있는 동종 라인 근처에 용이 갖는 생체 내에서 서로 다른 실험 가능성을 제공 체외 시스템을 모두 가지고.

배아 개발의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 이해 종자 및 식물 개발을위한 필수적이다. 콩에서 다른 쌍떡잎 식물에서와 같이, 이는 인간의 영양 섭취에 사용되는 제품을 저장 배아 자엽이다. 초기 배 발생이 빠른 세포 분열, 그리고 올바른 배아 패턴을 포함한다. 약 팔일 수정 후, M.에서 truncatula 배아 초기 자엽 단계에 도달한다. 형태 학적 특성은 정확하게 온실 조건의 수정 후 일에 의해 표시되지 않습니다. 따라서, 개발 배아의 무대를 표시 할 수있는 효율적인 표준화 된 접근 방식은 유전 regul 연구에 가치가있다초기 접합체 배아의 ATION.

본 논문에서는 콩과 식물 모델 엠에서 배아의 생물학적 연구 개발 배아를 수집하기 위해 두 개의 표준화 된 프로토콜을 제공 truncatula. 첫 번째를 손쉽게 대형 배아 번호를 제공하기 위해 배양 잎 외식 통해 체세포 배는 배 발생 동안 포드 형태를 연결하여 접합체 배아를 수집하는 것이다.

1. 접합체 배아 개발

1. 식물 재료
   1. 성장 Medicago는 14 시간의 광주와 유리 공장과 23 ° C / 19 ° C 일 / 밤 온도에서 야생형 Jemalong 또는 매우 다시 생성 가능한 그 근처 동종 (2HA라고도 함) 유전자형 Jemalong 2HA ¹³ truncatula.
      1. 물이 씨앗을 입력하고 물에 하룻밤 담가 허용되도록 씨앗을 파종하기 전에 피어스 (23 G 바늘) 씨 코트의 표면. 완전히 씨앗을 충당하기 위해 충분한 물을 추가합니다.
      2. 포팅 혼합물의 각 15cm 직경 냄비에 3의 씨앗을 뿌리고 (10 냄비의 총) (굵은 모래, 펄라이트, 야자 껍질의 섬유 - 이탄 (1 : 1 : 1)을 더한 Osmocote 정확한 표준의 5g : 느린 방출 비료) 및 전송 유리 공장. 식물이 올라 줄기를 위해 냄비와 서라운드 당 1 공장은 격자에 의해이 때문에 발아 후 건강한 묘목을 유지.
2. 수확 포드
   1. W에서 포드를 수집Jemalong 또는 2HA 적절한 초기 배아 단계를 얻기 ILD 유형은 제 ⁹ 기재.
      주의 : 다른 포드 스테이지가도 1에 도시되고 대응하는 배아 단계는도 2에 도시되어있다.
   2. 분리 스테이지 (6 및 7) (표 2)을 돕는 단계 (6)로부터의 경과 시간. 표 1에서와 같은 기준을 사용하여 수확에서 다른 포드 스테이지를 점검 측정한다.
3. 포드에서 난자를 해부 및 배아 단계를 확인
   1. 필요에 따라 단독으로 미세 집게를 사용하여 포드 또는 스테레오 해부 현미경과 집게에서 난자를 분리합니다. 필요한 경우 배아 단계 신속 표준 화합물 현미경 (도 3b)을 이용하여 확인할 수있다.
   2. 아랍어 7.5 g 검, 100g의 클로 랄 하이드레이트, 5 mL의 글리세롤, 증류수 60 mL의 탈 이온수를 함유하는 용액을 호이어의 변성 준비한다. 3-5 시간 또는 하룻​​밤 교반 용해.
   3. 더 조정을 위해D 현미경 수정 호이어의 솔루션 ^{(15, 16)의} 해부 난자을 취소합니다. 조심스럽게 명확 때까지 실온에서 (난자를 커버하기에 충분) 호이어의 솔루션의 작은 볼륨에서 그대로 난자와 장소를 선택하십시오.
   4. 미분 간섭 대비 (DIC) 광학 샘플을 볼 수 있습니다. 디지털 카메라 ⁽⁹⁾ (그림 2) iwth 이미지를 캡처합니다.
   5. 포드의 중심 지역에서 가장 균일 한 난자를​​ 확보하고 필요한 수를 축적. 일례가도 3a에 도시되어있다. 추가 분석을 위해 요구되는 온도에서 얼음 저장에 난자 (-80 ° C에 대한 핵산)를 수집합니다.
      참고 : 조직 학적 섹션의 분석, 투과 전자 현미경에 대한 자세한 내용 및 현장 하이브리드에 논문 ^{8, 9를} 참조하십시오.

체외 2. 체세포 배아 개발

1. 엠을 사용하여 truncatula 품종의 T모자는 쉽게 문화의 배아를 형성 할 수있다. 잎 외식이 프로토콜 2-4 개월이다 2HA 공장 ^{13, 17을} 사용합니다.
2. 신장 줄기의 최신 거의 완전히 확장 세 잎의 잎에서 전단지를 가져 가라.
3. 탈수를 방지하기 위해 문화 냄비에 축축한 종이 타월에 세 잎의 잎을 유지합니다.
   주 : 세 잎의 잎이 수확되면 그들이 최소한의 지연으로 활용 될 필요가있다.
4. 배양 배지의 제조
   1. 4 : 4 : 1 : 한천에 5 배지 (W 0.8 % : V)에 9cm 페트리 접시 (P4) (10)를 사용합니다.
      참고 : P4 10 : 4 : 1 : 5 매체는 P4의 기저 매체 ¹⁸ 플러스 10 μm의 1 naphthaleneacetic 산 (NAA), 4 μm의 6 benzylaminopurine (BAP), 1 μm의 아브 산 (ABA)와 5 μm의 지베렐린으로 구성 산 (GA). GA + ABA의 사용은 배아 형성을 가속화하고 배아 번호 ^14의 실질적인 증가를 야기한다.
   2. 1 리터의 P4의 기저 매체 메이크업; (calciu을 주요 염으로 구성된) 별도로 미터 사소한 염과 비타민 (표 3), 킬레이트 철 (별도 구성), 카사 미노산 (카제인 가수 분해물), 30g의 자당, 8g 한천.
   3. 적당한 분량 씩 -20 ° C에서 주요 염, 칼슘, 카사 미노산, 약간의 소금과 비타민의 상점 재고 솔루션을 제공합니다. 4 ℃에서 킬레이트 철을 저장합니다.
   4. • 7H _다음날에 FeSO4의 1.853 g을 추가하는 동안 교반하면서 탈 증류수 약 900 ml의 나 ₂ EDTA •의 7.44 g의 2H ₂ O를 용해하여 킬레이트 철 (200X)를 확인 후 98 ~ 99 ° C의 솔루션을 가지고 ₂ O 성분이 용해 될 때 마지막으로 1 리터까지합니다. 호박에 보관은 4 ℃에서 병 색깔.
   5. 표 4에서와 같이 주식 솔루션 (P4)의 기초 배지를 확인합니다. 매체의 호르몬은 10 μm의 NAA, 4 μM의 BAP, 1 μM의 ABA, 5 μm의 GA (표 4 및 특정 재료 표 참조). NAA 추가BAP 전에 가압 멸균 주사기에 부착 0.22 μm의 필터로 여과 멸균하여, 오토 클레이브 약 55 ° C로 냉각 후 ABA 및 GA를 추가한다. 부드러운 소용돌이에 의해 잘 섞는다.
   6. 고압 증기 멸균에 앞서 1 M KOH으로 pH 5.8로 미디어를 조정합니다. 20 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브.
   7. 필터 살균 ABA와 GA를 추가하고 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 멸균 9cm 페트리 접시에 미디어의 약 25 ml에 부어 고온 가압 멸균 한 후. 쿨과 한천은 뚜껑으로 설정할 수 있습니다. 그런 다음 뚜껑에 넣고 뚜껑에는 응축수가없는 있는지 확인하십시오. (뚜껑 응축을 방지하기 위해 판지 상자) 4 ° C에서 요구 및 저장소로 레이블.
5. 잎 조직의 살균
   1. 자외선 살균 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 작업 할 수 있습니다.
   2. 장소는 이전에 멸균 봄 차 주입기의 메쉬 볼에 나뭇잎.
   3. 막 다른 에탄올 70 %에 (V V)를 잎을 포함하는 차 주입기를 담가30 초 동안 진짜야 냄비.
      참고 :이 절차의 모든 단계를 사용할 250 ml의 멸균되는 캡 폴리 카보네이트 문화 냄비 나사.
   4. 배수 후 전송하고 1 잎 조직 몰입 : 8 (V : V)로 희석 표백제 (0.5 % 염소)을 10 분 동안. 때때로 부드럽게 소용돌이.
   5. 표백제를 배출하고 멸균 탈 증류수를 포함하는 문화 냄비에 차 주입기를 전송합니다. 부드럽게 소용돌이와 여분의 물을 배수. 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 한 번 더 반복한다.
   6. 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 멸균 집게와 차 주입기에서 잎을 제거합니다. 멸균 캡 나사와 반전과 소용돌이로 헹군다. 외식을 준비 할 준비가 될 때까지 멸균 물에 떠있는 나뭇잎을 남겨주세요.
6. 의 Explants 준비 및 도금
   1. 멸균 기법을 사용하여, 메스 에지로부터 개별 멸균 전단을 트림 및 2 개 THR로 나머지 직사각형을 잘라직사각형 이식편 각 이식편 (도 5a)의 중앙에 중간 정맥과 (80-10 X 3-5mm)를 EE.
      주 : 이식편의 크기는 제 캘러스를 개시에 매우 중요하다. 테이크 아웃 식품 용기에서 멸균 뚜껑에 절단을 수행하십시오.
   2. 플레이트 9cm 직경 페트리 접시 (그림 5B)에서 한천 화 배지에 6 외식. 보통 잎의 방향을 유지하기 위해 아래로 외식 배축 측 플레이트.
   3. 접시 주위에 뻗어 파라 필름 (그림 5C)와 페트리 접시를 밀봉합니다. 조직은 지금 배양을위한 준비가되어 있습니다.
7. 조직 배양
   1. 문화 기간 동안 온도 조절 실 또는 성장 캐비닛에 28 ° C에서 어둠 속에서 번호판을 품어.
      참고 : 외식이 탈분화를 시작 세포 분열, 증식 (캘러스 형성)과 배아 (차별화)을 받게 될 것이다.
   2. 차별화 expla을 배양신선한 매체에 3 주 후에 NTS. 이 계대 배양에서 층류 후드 또는 생물 캐비닛, 멸균 스테인리스 주걱과 집게를 사용하여 전체 이식편 옮긴다. 캘러스가 발생 캘러스는도 5C에서 가장 큰 하나의 크기를 초과하는 신선한 배지로 계대 배양 될 때, 개별 캘러스의 50 %를 전달.
   3. 약 4 주 만에 처음으로 배아를 관찰한다. 동시성의 정도가되지만, 4-8 주간의 배양 기간 동안 상이한 배아 수집 단계 (도 6a를, B). 실험 목적에 따라 해부 현미경 및 프로세스에 따라 수집합니다.
   4. 외식 3 개월 동안 배아를 생산하기 위해 계속 수 있도록 매 3 주 배양과 정기적으로 배아를 제거합니다.

F - 다른 배아 단계는도 2a에 도시 동안 F - 다른 배아 단계에 해당하는 접합체 배아 다른 포드 구조에 대해서는 그림 1A에 표시됩니다. 동일한 단계에서 포드를 선택함으로써, 난자의 샘플 상당히 균일 (도 3a)를 얻을 수 있음. RT-qPCR의 배아를 이용하여 특정 유전자는 쉽게 검출 및 시간 과정 연구 ^9를 평가할 수있다. 일부 추가 해부 배아 (그림 3B)의 추가 농축을 허용합니다. 제자리 혼성화 처리 전략을 용이하게 임의의 상보 광 관련된 연구 (도 4A, B) 및 전자 현미경 ^(8)뿐만 아니라 수행 할 수있다 위해. 이 시스템을 구성하는 특정 값의 뇌하수체 및 suspensor (도 4A, B)의 특수성이다.

체세포 배 C의 경우개별 folioles에서 초기 이식편의 utting 그림 5A에 표시됩니다. 외식은 한천 (그림 5B)에 밀착 배축 측면을 배치됩니다. 캘러스 후 형성 배아는 떡잎 단계 (그림 5C)에서 다수의 배아가 3-4 주 후 7 주에 의해 나타나기 시작합니다. 이산 단계에서 4 주 사이 7 배아를 통해 플레이트에 따라 위치 할 수 있습니다 (그림 6A, B). 다른 배아 단계는 쉽게 관찰하고 간단하게 분석을 위해 오프 포착 할 수 있습니다. 이것은 특정 유형의 정보를 얻을 수있는 매우 빠른 방법이 될 수 있습니다. 예를 들어 그림 7은 초기 자엽 단계에서 배아는 하나 MtOLEOSIN 유전자의 종류가 아닌 다른 사람의 표정을 보였다 방법을 보여줍니다. 관심의 유전자의 시간 과정 연구는 접합체 또는 체세포 배아를 사용하여 검사 할 수있다. 체세포 배아 시스템의 특별한 장점은 callu의 변형이며S는 GUS (β 글루 쿠로니다 아제) 또는 형광 라벨을 사용하여 시각 배아의 다른 단계에서 전체 식물 및 유전자 발현을 재생하지 않고 수행 될 수있다. 일례가도 6c에 도시된다.

그림 1 : 포드의 형태와 배아 개발 단계 포드 이산 단계에서 배아와 개발의 다른 단계에서.. 단계 2-7 지적했다. (A) 및 (B)는 스테이지 (2) 및 (3) 초기 및 전 구형 (C) 단계 초기 구상 4 (D) 단계 5 늦은 구상 (E) 단계 6 심장 및 (F) 단계 7 늦은 어뢰 초이다. 바 2 mm이다. 스테이지 I이 개화 (도시 생략).

그림 2 : 배 발달 단계. </ 다른 개발 단계에서 strong>을 해제 배아. (A) 단계 3 초 전 구형, (B) 4 단계 초기 구상, (C) 단계 5 늦게 구형, (D) 단계 6 심장, 및 (E) 단계 7 후반 어뢰. 바는 60 μm의입니다.

그림 3 : 절연 난자 단계 5 배아와 난자의 (a) 군.. (B)는 난자 "후크"끝 부분을 절제 할 수 배아를 보여 표준 화합물 현미경으로 볼. 바 1mm (A) 200 ㎛의 (B)이다.

그림 4 :. 초기 배아 쇼를 통해 초기 배아의 형태학 (A) 제난자 조직에 적절한 배아 (4 개의 셀), 뇌하수체 (다음 4 개의 셀), suspensor (큰 액포가 다음 4 개의 셀)과의 관계를 보내고. 눈에 띄는 suspensor (S)와 초기 어뢰 단계 배아 (E)를 통해 (B) 섹션을 참조하십시오. 톨루이딘 블루로 염색. 막대는 10 μm의 (A) 및 50 ㎛의 (B)이다.

그림 5 :. 체세포 배아를 생성하기 위해 외식을 배양 (A) foliole에서 외식이 촬영 세 잎의 잎을 보여주는. (B) 체외 이식편 아가 상에 플레이 팅. (C) 칠주 문화 후 외식에서 생산 체세포 배아. IS10 MM 바

도 6 : 체세포 배아 단계 유전자 expressio의 위치를 식별N 변환 및 GUS. (A) 체세포 배아 구상 (G)에서, 심장 (H)과 어뢰 (T) 단계를 사용하여. (나) 초기 자엽 단계에서 체세포 배아. (C) (E) 적절한 배아에서 MtWOX9 유전자에 대한 강한 GUS 발현을 보여주는 구상 단계 체세포 배아 및 뇌하수체 (H)과 suspensor (S)에서 감소 염색. 바 (A, B)는 100 ㎛이다. 바 (C)가 50 ㎛ 인 것이다.

도 7 :. 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)의 배아 발생 칼루스로부터 배아로부터 절단 초기 떡잎 단계 배아 OLEOSIN3 (A) 및 OLEOSIN4 (B)의 유전자 발현을 이용하여 시험관 내에서 배아 duing 유전자 발현. 표현은 상대 T입니다O 잎. 표준 오차는 지적했다.

표 1 : 포드 단계의 수확에 대한 기준 정의 배아 단계에 해당하는 포드의 단계를 식별에 사용되는 형태 학적 기준..

포드 수집 표 2 시간 코스. T까지의 시간그는 이전의 배아 개발 단계는 일 지적했다.

표 3 : P4 중간 P4 매체의 컴포넌트..

표 4 :. 호르몬 (P4) 매체를 구성하는 재고 솔루션에서 호르몬 (P4) 매체를 구성하는.

설명 프로토콜은 상대적으로 정직하고 모든 현대의 세포 및 분자 기술과 콩과 식물 배아의 조사를 할 수 있습니다. 우리는 장점과 생체 내 및 생체 외 접근 모두 단점이 있다는 것을 인정한다. 모두 미숙 씨 ^(19)의 문화에 비해 초기 배 발생에 더 초점을 수 있습니다.

생체 내 연구의 경우에 무엇을 설명하는 것은 주로 많은 배아 연구에 적합한 포드로부터 난자의 분리이다. 더 나아가 "후크"영역 (도 3B)를 오프 자르는 배아 조직을 위해 농축하는 것도 가능하다. 그것은 잘 유리한 난자의 활용, 인접 조직에 부착되지 않는 동안 disection 배아 종종 분실로서 배아 발달의 매우 초기 단계를 분리하는 것이 곤란하다. 꽃의 태그는 포드의 형태를 제거 사용 및 시간 C를 갖는각각의 꽃에 대한 ourse을 정권. 환경이 매우 엄격하게 제어되지 않는 한 또한 잠재적 인 변화는 발달 타이밍 방법에있다. 그 포드 형성 스트레스 조건 하에서 발생하지 않도록 최적의 식물의 성장이 중요하다. 포드 개발에 익숙해 약간의 조정은 특정 배아 발달 단계에 맞게 형태 단계를 정의 할 수있다.

체세포 배아 발생의 경우에는 배아 접합체에서 무성이 아닌 파생되는 것을 인식해야한다. 또한, 영양 소스는 접합체 배아 다릅니다. 체세포 배아 경우에는 배양액과 주변 캘러스이고 접합체 배아의 경우에 그것은 배젖이다. 이것은 훨씬 더 suspensor 접합체 배아의 경우에는 현상 수단 (도 4A, B). 엠의 특정 값 truncatula 시스템은 특이 네 hormon에 응답 배아 다수 인전자 정권. 많은 수의 후 호르몬과 매체에 자신의 추가를 만들기의 세부 사항을 확인 발생하지 않은 경우 확인해야합니다. 손상없이 절편 조직의 문화 방법론 불임과 마찬가지로 (에탄올이이 문제가 될 경우 차아 염소산 살균 시간의 타이밍에 작은 조정) 모든 예비 단계에서 불임을 유지 관리와 함께 중요합니다.

우리가 발견 한 것은 생체 내에서 체외 과정에서 보완 할 가치가 있다는 것입니다. 우리의 연구 예는 에틸렌 응답 전사 인자 유전자 전사 인자 MtSERF1 (SOMATIC 배아 RELATED FACTOR 1)에 조사된다. MtSERF1 먼저 RNAi의, 프로모터 GUS 융합과에서 현장 hybridisations를 이용하여 체세포 배아에서 발견되었다; 다음 배아 접합체 ^(20)에서 발현되는 것으로 도시.

콩과 식물 배아의 연구는 시간 동안 중요하다잃어버린 영양, 그리고 M.를 사용하여 truncatula이 지역을 향상시킬 수 있습니다 사용할 수 세포 및 분자 기술과 함께 배아. 통찰력 배아 크기 때문에 수율이 필요한 탄수화물, 단백질 및 오일 조성물과 함께 최적화 될 수있는 방법으로 얻을 수있다. 이러한 결정은 주로 초기 배 발생 ^8,9에 기차에서 설정됩니다.

The authors declare that they have no competing interests.

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.