Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Embriogenesi precoce a partire da una singola cellula zigote attraversa rapida divisione cellulare e la morfogenesi, ed è morfologicamente caratterizzato da fasi di pre-globulare, globulari, cuore, siluri e cotyledon. Questo progressivo sviluppo è sotto la stretta regolazione di una rete molecolare complessa. Raccolta sufficienti embrioni in uno stadio di sviluppo è essenziale per studiare la regolazione cellulare e molecolare del primo embriogenesi. Questo non è semplice da inizio embriogenesi subisce una rapida morfogenesi in breve tempo ad esempio, 8 giorni per i Medicago truncatula per raggiungere la fase cotyledon precoce. Qui, affrontiamo il problema da due approcci. Il primo stabilisce un legame tra lo sviluppo embrionale e pod morfologia nell'aiutare indica la fase dell'embrione zigotico. Questo è particolarmente basa sul numero di spirali pod e sviluppo delle spine. Un modo alternativo per integrare in vivo sTUDI è via espianti fogliari coltura per la produzione di embrioni somatici. Il supporto include una combinazione di ormoni insolito - un'auxina (acido 1-naftalenacetico), un citochinine (6-benzilaminopurina), acido abscissico e acido gibberellico. Le diverse fasi possono essere individuate a crescere senza il callo senza dissezione.

I legumi sono la terza più grande famiglia di piante superiori con circa 20.000 specie e la (o Fabaceae) famiglia delle leguminose sono secondi a cereali in superficie coltivata e produzione totale ^1. La soia è la terza più grande coltivato. Legumi granella forniscono circa un terzo delle proteine ​​alimentari e un terzo di olio vegetale per il consumo umano ^2. Legumi con la loro capacità di fissaggio N ₂ contribuiscono a sistemi agricoli sostenibili. Medicago truncatula, come la soia, i negozi di proteine ​​e olio nelle cotiledoni di suoi semi ed è un modello di legume genetica e genomica, con notevoli risorse genetiche e genomiche ^3,4. Mentre M. truncatula ha consentito progressi nella comprensione del legume-rhizobium simbiosi ⁴ è stato sempre impiegato per studiare sementi di leguminose biologia ^5-7 e embriogenesi ^8,9. Arabidopsis embriogenesi è stato ampiamente studiato ^10,11 ma isa non legume ei dettagli dell'embriogenesi non sono identici a Medicago ^8,10. Zigotica in M. truncatula ha caratteristiche interessanti, con un ipofisi multicellulare distintivo, un suspensor endoployploid e cellule basali trasferimento ^8.

Embriogenesi somatica (SE) è comunemente utilizzato per la rigenerazione piante ^12. Nel modello legume M. truncatula, la linea seme Jemalong 2HA (2HA) è stato sviluppato dal genitore Jemalong di avere alti tassi di embriogenesi somatica ^13. Il numero di embrioni prodotti è stata recentemente sostanzialmente aumentato aggiungendo sia l'acido gibberellico (GA) e l'acido abscissico (ABA) al mezzo di lunga data ^14. In questo caso, GA e ABA agiscono in sinergia, che è inusuale visto che GA e ABA di solito agiscono antagonisticamente ^14. Gli embrioni ottenuti da callo sviluppano sulla superficie che permette la fase dell'embriogenesi per essere facilmente determinata Visually e prontamente raccolto. Avendo in prossimità di linee isogeniche che sono embryogenic (2HA) e non-embriogenetica (Jemalong) facilita l'indagine di embriogenesi somatica e avendo sia in vivo che in vitro sistemi fornisce diverse possibilità sperimentali.

La comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari di sviluppo embrionale è essenziale per le sementi di comprensione e lo sviluppo delle piante. In legumi, come in altre dicotiledoni, sono i cotiledoni dell'embrione che immagazzinare i prodotti che vengono utilizzati per l'alimentazione umana. Embriogenesi precoce coinvolge rapida divisione cellulare, e corretta patterning dell'embrione. In circa 8 giorni dopo la fecondazione, la M. truncatula embrione raggiunge stadi cotyledon iniziali. La caratterizzazione morfologica non è esattamente indicato da giorni dopo la fecondazione in condizioni serra. Così, un approccio standardizzato efficace per indicare la fase di embrioni in via di sviluppo è prezioso per lo studio della genetica regulzione del primo zigotica.

In questo lavoro, mettiamo a disposizione due protocolli standardizzati per raccogliere embrioni in via di sviluppo per gli studi biologici della embriogenesi nel modello legume M. truncatula. Il primo è quello di raccogliere gli embrioni zigotici associando embriogenesi e pod morfologia mentre il secondo è embriogenesi somatica via espianti fogliari coltura di fornire un gran numero di embrioni facilmente accessibili.

1. Zygotic Sviluppo embrionale

1. Impianto Materiale
   1. Far crescere la Medicago truncatula wild type Jemalong o il suo vicino isogenico, altamente ri-generabile genotipo Jemalong 2HA ¹³ (noto come 2HA) in una serra con un fotoperiodo 14 ore e 23 ° C / 19 ° C di temperatura giorno / notte.
      1. Pierce la superficie del rivestimento del seme (con un ago G 23) prima di seminare il seme in modo che l'acqua è permesso di entrare il seme e ammollo in acqua durante la notte. Aggiungere acqua sufficiente a coprire interamente il seme.
      2. Seminare 3 semi in ogni 15 centimetri pentola diametro (totale di 10 vasi) in miscela di impregnazione (grossa sabbia, perlite, fibra di cocco-peat (1: 1: 1) più 5 g di Osmocote standard Exact: concime a lenta cessione) e trasferimento serra. Conservare la piantina più sano dopo la germinazione per cui vi è 1 pianta per vaso e surround un traliccio per l'impianto nasce a salire.
2. Baccelli raccolta
   1. Raccogliere baccelli del wtipo ild Jemalong o 2HA per ottenere le opportune fasi embrione precoce come prima descritto ^9.
      NOTA: Le diverse fasi pod sono mostrati in figura 1 e le fasi embrionali corrispondenti sono mostrati nella Figura 2.
   2. Verificare le diverse fasi pod al momento della raccolta in base a criteri come da tabella 1. Misurare il tempo trascorso dallo stadio 6 per aiutare fasi distinte 6 e 7 (Tabella 2).
3. Dissezione ovuli da baccelli e controllando la fase embrionale
   1. Isolare ovuli da cialde utilizzando una pinza sottile da solo o un microscopio da dissezione stereo e pinze, se necessario. Se necessario, la fase embrionale può essere rapidamente controllata usando un microscopio composto standard (Figura 3B).
   2. Preparare modificato soluzione di Hoyer contenente 7,5 g gomma arabica, 100 g di cloralio idrato, 5 ml di glicerolo, 60 ml di acqua distillata deionizzata. Sciogliere mescolando per 3-5 ore o durante la notte.
   3. Per ulteriori affinared microscopia cancellare gli ovuli sezionato in soluzione ^15,16 modificata di Hoyer. Prendere con cautela ovuli intatti e posto in un piccolo volume di soluzione di Hoyer (sufficiente a coprire l'ovulo) a temperatura ambiente fino chiaro.
   4. Guarda i campioni con contrasto interferenziale differenziale (DIC) ottica. Catturare le immagini iwth una fotocamera digitale ⁹ (Figura 2).
   5. Ottenere gli ovuli più uniformi dalla regione centrale del baccello e accumulare il numero desiderato. Un esempio è mostrato in Figura 3A. Raccogliere gli ovuli su ghiaccio e conservare a temperatura desiderata (acidi -80 ° C per nucleici) per ulteriori analisi.
      NOTA: Per i dettagli sulla analisi delle sezioni istologiche, microscopia elettronica a trasmissione, e ibridazione in situ consultare documenti ^8,9.

2. Somatic sviluppo embrione in vitro

1. Utilizzare un M. truncatula cultivar tcappello è in grado di formare facilmente embrioni in coltura. Per questo protocollo per espianti fogliari utilizzare le piante 2HA ^13,17 che sono 2-4 mesi di età.
2. Prendere volantini dall'ultima foglia trifogliato quasi completamente ampliata di uno stelo allungamento.
3. Mantenere le foglie trifogliolate su carta umida spugna in una pentola coltura per evitare la disidratazione.
   NOTA: Una volta che le foglie trifogliolate vengono raccolti hanno bisogno di essere utilizzato con un ritardo minimo.
4. Preparazione del terreno di coltura
   1. Utilizzare il P4 10: 4: 1: 5 medie agar (0,8% w: v) in 9 piatti cm Petri.
      NOTA: Il P4 10: 4: 1: 5 media consiste mezzo P4 basale ¹⁸ più 10 mM di acido 1-naftalenacetico (NAA), 4 mM 6-benzilaminopurina (BAP), 1 mM di acido abscissico (ABA) e 5 mM gibberellico Acido (GA). L'uso di GA + ABA accelera la formazione dell'embrione e provoca un aumento sostanziale nel numero di embrioni ^14.
   2. Portare il supporto basale P4 in 1 L; costituito da importanti sali (fare Calcium separatamente), sali e vitamine minori (Tabella 3), di ferro chelato (make up a parte), Casamino acidi (caseina idrolizzato), 30 g di saccarosio, 8 g di agar.
   3. Conservare le soluzioni stock di grandi sali, calcio, acidi, sali Casamino minori e vitamine a -20 ° C in aliquote adatti. Conservare ferro chelato a 4 ° C.
   4. Portare il ferro chelato (200x) sciogliendo 7,44 g di Na ₂ EDTA • 2H ₂ O in circa 900 ml di acqua distillata deionizzata agitando, quindi portare la soluzione a 98-99 ° C durante l'aggiunta di 1.853 g di FeSO ₄ • 7H ₂ O. Infine portare a 1 L quando gli ingredienti sono sciolti. Conservare in ambra bottiglie a 4 ° C colorato.
   5. Portare il mezzo basale P4 con le soluzioni madre come in Tabella 4. Gli ormoni nel mezzo sono 10 pM NAA, 4 mM BAP, 1 pM ABA, 5 mM GA (vedere Tabella 4 e Materiali specifici Tabella). Aggiungere la NAAe BAP prima autoclave e aggiungere ABA e GA dopo autoclavaggio e raffreddamento a circa 55 ° C, per mezzo del filtro di sterilizzazione con un filtro di 0,22 micron attaccato ad una siringa. Mescolare bene agitando delicatamente.
   6. Regolare i media a pH 5,8 con 1 M KOH prima della sterilizzazione in autoclave. Autoclave a 121 ° C per 20 min.
   7. Dopo autoclave aggiungere il filtro ABA sterilizzato e GA, e versare circa 25 ml di media in sterili 9 centimetri piastre di Petri in una cappa a flusso laminare o un armadietto a rischio biologico. Fresco e lasciare che l'agar impostato con il coperchio. Poi mettere il coperchio e assicurarsi che non vi è alcuna condensa sul coperchio. Etichetta come richiesto e conservare a 4 ° C (in una scatola di cartone per evitare che il coperchio di condensa).
5. Sterilizzazione di Leaf Tissue
   1. Lavorare in una cappa a flusso laminare-UV sterilizzati o armadio rischio biologico.
   2. Inserire lascia in palla maglie di una precedenza autoclavato tè primavera infusore.
   3. Immergere tè infusore contenente le foglie nel 70% (v: v) di etanolo in un culpentola ture per 30 sec.
      NOTA: per tutti i passaggi di questa procedura usa da 250 ml con tappo a vite pentole cultura policarbonato che vengono sterilizzati in autoclave.
   4. Scolare e poi trasferire e immergere il tessuto fogliare in 1: 8 (v: v) candeggina diluita (0,5% cloro) per 10 min. Agitare delicatamente di tanto in tanto.
   5. Scolare la candeggina e trasferire l'infusore tè in una pentola di coltura contenente acqua distillata deionizzata sterile. Agitare delicatamente e drenare l'acqua in eccesso. Ripetere ancora una volta con una cultura pentola fresco di acqua distillata deionizzata sterile.
   6. Togliere le foglie dalla infusore tè con pinza sterile a una cultura pentola fresco di acqua distillata deionizzata sterile. Avvitare il tappo sterile e lavare capovolgendo e vorticoso. Lascia foglie galleggianti in acqua sterile fino al momento di preparare espianti.
6. Preparazione e placcatura espianti
   1. Usando tecniche sterili, tagliare singoli depliant sterilizzati dal bordo con un bisturi, e tagliare il rettangolo rimanenti in due o three espianti rettangolari (8-10 x 3-5 mm) con la metà vena del centro di ogni espianto (Figura 5A).
      NOTA: La dimensione del espianto è molto importante nell'avvio del prima formazione del callo. Effettuare il taglio sui coperchi sterili da contenitori di cibo take-away.
   2. Piastra 6 espianti di agar-solidificato terreno di coltura in 9 cm di diametro di Petri (Figura 5B). Piatto il espianti lato abaxial giù per mantenere consueto orientamento foglia.
   3. Sigillare le piastre di Petri con Parafilm (Figura 5C) allungate intorno al piatto. Il tessuto è ora pronto per l'incubazione.
7. Tissue Incubazione
   1. Incubare le piastre al buio a 28 ° C in un ambiente a temperatura controllata o armadio crescita durante il periodo di coltura.
      NOTA: Le espianti avvieranno dedifferenziazione, subire la divisione cellulare, la proliferazione (formazione del callo) e embriogenesi (differenziazione).
   2. Sottocultura il fornire i chiarimenti di differenziazionenti dopo 3 settimane a mezzo fresco. A questo subcultura trasferire l'intera espianto usando una spatola inox sterili e pinze, in una cappa a flusso laminare o un armadietto rischio biologico. Come avviene formazione del callo e il callo supera la dimensione del più grande in figura 5C, trasferire il 50% del callo specifico quando subcoltura terreno fresco.
   3. Osservare i primi embrioni in circa 4 settimane. Mentre vi è un grado di sincronia, raccogliere diverse fasi di embrione in un periodo di incubazione di 4-8 settimane (Figura 6A, B). Raccogliere sotto un microscopio e di processo dissezione in funzione degli obiettivi sperimentali.
   4. Sottocultura ogni 3 settimane e rimuovere periodicamente embrioni in modo che gli espianti continueranno a produrre embrioni per 3 mesi.

Per zigotici embriogenesi differenti strutture pod corrispondenti alle diverse fasi embrionali sono mostrate in Figura 1A - F mentre le diverse fasi embrionali sono mostrati in Figura 2A - F. Selezionando baccelli nella stessa fase, campioni di ovuli che sono piuttosto uniforme può essere ottenuta (Figura 3A). Usando RT-qPCR embrione geni specifici possono essere facilmente individuati e gli studi del corso di tempo valutato ^9. Alcuni dissezione addizionale permetterà un ulteriore arricchimento dell'embrione (Figura 3B). Elaborazione per ibridazione in situ strategie possono essere facilmente eseguite nonché eventuali studi complementari coinvolgono luce (Figura 4A, B) e microscopia elettronica ^8. Di particolare valore in questo sistema è il carattere distintivo del (4A Figura, B) ipofisi e suspensor.

Per embriogenesi somatica la cUtting del trapianto iniziale singole foglioline è mostrato in Figura 5A. Gli espianti vengono quindi collocati fianco abaxial in stretto contatto con l'agar (Figura 5B). Dopo callo embrioni di formazione iniziano ad apparire dopo 3-4 settimane e da sette settimane ci sono numerosi embrioni allo stadio cotyledon (Figura 5C). Seguendo le piastre attraverso settimane tra 4 e 7 embrioni in fasi discrete possono essere localizzati (Figura 6A, B). Le diverse fasi embrionali possono essere facilmente osservati e semplicemente prelevati per l'analisi. Questo può essere un bel modo rapido per ottenere certi tipi di informazioni. Per esempio la figura 7 illustra come gli embrioni nella fase cotyledon precoce mostravano espressione di un tipo di gene MtOLEOSIN ma non un altro. Corsi di tempo studi del gene di interesse possono essere esaminati con zygotic o embrioni somatici. Un vantaggio particolare del sistema di embrione somatico è che la trasformazione della callus può essere eseguita senza rigenerare un intero impianto e l'espressione genica nelle diverse fasi della embriogenesi visualizzato per mezzo di GUS (β-glucuronidasi) o le etichette fluorescenti. Un esempio è mostrato nella Figura 6C.

Figura 1: Pod morfologia e fasi di sviluppo dell'embrione Baccelli a diversi stadi di sviluppo con embrioni nelle fasi distinte.. Fasi 2-7 indicato. (A) e (B) sono fasi 2 e 3 molto presto e l'inizio del pre-globulare (C) fase 4 precoce globulare (D) fase 5 tardi globulare (E) fase 6 di cuore e (F) fase 7 ritardo siluro. Bar è di 2 mm. Fase I è fioritura (non mostrato).

Figura 2: fasi di sviluppo dell'embrione. </ Strong> embrioni sgomberati a diversi stadi di sviluppo. (A) fase 3 precoce pre-globulare, (B) fase 4 precoce globulare, (C) fase 5 tardi globulare, (D) fase 6 di cuore, e (E) fase 7 ritardo siluro. Bar è 60 micron.

Figura 3: Isolato ovuli (A) Gruppo di ovuli con la fase 5 embrioni.. (B) Ovulo visto sotto microscopio composto standard per mostrare embrione che può essere asportato alla fine "gancio". Bar è 1 mm (A) e 200 micron (B).

Figura 4:. Morfologia del primo embrione (A) Sezione di molto embrione precoce spettacoloing embrione vero e proprio (quattro celle), ipofisi (prossimi quattro celle), suspensor (prossimi quattro cellule che hanno grandi vacuoli) e rapporto ai tessuti ovuli. (B) Sezione di precoce siluro fase embrionale (E) con suspensor prominente (S). Stained con toluidina blu. Bar è 10 micron (A) e 50 um (B).

Figura 5:. Coltura espianti per produrre embrioni somatici (A) trifogliate foglia che mostra in cui vengono prese espianti da foliole. (B) espianti placcato su agar. (C) embrioni somatici ottenuti da espianti Dopo 7 settimane cultura. Bar è 10 mm

Figura 6: stadi embrionali somatiche e di individuare la posizione di gene expression utilizzando trasformazione e GUS. (A) embrioni somatici in globulare (G), cuore (H) e siluro (T) fasi. (B) gli embrioni somatici in fase cotyledon precoce. (C) globulare fase embrionale somatiche mostrando forte espressione GUS per il gene MtWOX9 in embrione vero e proprio (E) e diminuendo la colorazione a ipofisi (H) e suspensor (S). Bar (A, B) è di 100 micron. Bar (C) è di 50 micron.

Figura 7: Espressione genica duing embriogenesi in vitro utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) espressione genica di OLEOSIN3 (A) e OLEOSIN4 (B) nei primi mesi del cotiledone embrioni fase asportati dagli embrioni da callo embriogenetica.. L'espressione è relativa to foglia. Errori standard indicati.

Tabella 1: Criteri per la raccolta delle fasi pod criteri morfologici utilizzati per identificare fasi pod corrispondente alle fasi embrionali definite..

Tabella corso 2. Tempo per la raccolta pod. Il tempo da tegli precedente fase di sviluppo embrionale indicato in giorni.

Tabella 3: P4 Media I componenti del mezzo P4..

Tabella 4: Redazione il medium P4 con gli ormoni Rendere il mezzo P4 con gli ormoni da soluzioni stock..

I protocolli descritti sono relativamente semplice e permettono indagini dell'embriogenesi legume con tutta la cellula contemporanea e tecniche molecolari. Si riconosce che ci sono vantaggi e svantaggi di entrambi in vivo e in vitro approcci. Entrambi permettono maggiore attenzione per embriogenesi precoce rispetto alla cultura dei semi immaturi ^19.

Nel caso di studi in vivo quanto descritto è prevalentemente l'isolamento dell'ovulo dal baccello che è adatto per molti studi embrionali. Naturalmente è possibile arricchire ulteriormente per tessuto embrionale mediante tranciatura fuori dalla zona "gancio" (Figura 3B). È difficile isolare la primissima fase dello sviluppo embrionale come durante Resezione l'embrione è spesso persa in quanto non è ben attaccato al tessuto adiacente, rendendo l'uso di ovuli vantaggiose. Utilizzando pod morfologia elimina la codifica di fiori e con un tempo cregime ourse per ogni fiore. Inoltre vi è il potenziale variabilità nei metodi di temporizzazione di sviluppo a meno che l'ambiente è molto strettamente controllato. La crescita ottimale pianta è importante in modo che la formazione pod non si verifica in condizioni di stress. Acquisire familiarità con lo sviluppo pod e lievi regolazioni possono essere effettuate per definire le fasi morfologiche per soddisfare specifiche fasi di sviluppo embrionale.

Nel caso di embriogenesi somatica, deve essere riconosciuto che gli embrioni sono derivati ​​asessualmente e non da uno zigote. Inoltre, la fonte nutrizionale è differente all'embrione zigotico. Nel caso dell'embrione somatica, è il mezzo di coltura e callo circostante, e nel caso dell'embrione zigotico è l'endosperma. Questo significa che il sospensori è molto meglio sviluppata nel caso dell'embrione zigotico (Figura 4A, B). Il valore particolare della M. Sistema truncatula è il gran numero di embrioni in risposta alla insolita quattro ormonee regime. Se i grandi numeri non si verificano quindi controllare i dettagli che compongono gli ormoni e la loro aggiunta al mezzo deve essere controllato. Come con qualsiasi sterilità metodologia della coltura del tessuto espianto senza danni (fare piccoli aggiustamenti ai tempi di etanolo e tempi di sterilizzazione ipoclorito se questo è un problema) è importante insieme alla cura per mantenere la sterilità durante tutte le fasi di preparazione.

Quello che abbiamo trovato è che è prezioso per integrare in vivo e in vitro processi. Un esempio da nostri studi è l'indagine del fattore di trascrizione MtSERF1 (EMBRIONI SOMATIC CONNESSO FATTORE 1), che è una risposta di etilene fattore di trascrizione genica. MtSERF1 fu scoperto nel embrioni somatici utilizzando RNAi, fusioni promotore-GUS e ibridazioni in situ; e poi dimostrato di essere espresso in zigotica ^20.

Lo studio di embriogenesi legume è importante per hnutrizione uman, e con M. truncatula embrioni insieme con le tecnologie cellulari e molecolari oggi disponibili possono migliorare questa zona. Insight può essere ottenuto in modo formato embrione e, quindi, resa possibile ottimizzare insieme carboidrati, olio e proteine ​​composizione richiesta. Questi fattori determinanti sono in gran parte avviata nel embriogenesi precoce ^8,9.

The authors declare that they have no competing interests.

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.