モデルマメに初期胚発生の調節を研究するための接合体と体細胞胚を得るためのプロトコル

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

単一細胞受精卵から始まる初期胚は、急速な細胞分裂や形態形成を通過し、形態学的に前球状、球状、心臓、魚雷と子葉の段階によって特徴づけられます。この進歩的な開発は複雑な分子ネットワークの厳しい規制下にあります。開発の同様の段階で十分な初期胚を収穫することは初期胚の細胞および分子の規制を調査するために不可欠です。 Medicagoにするための、例えば 8日早い子葉段階に到達するためにtruncatulaながら初期胚発生が短い急速な形態形成を受けるので、これは簡単ではありません。ここでは、二つのアプローチによって問題を解決します。最初のものは、接合胚の段階を示すうえで胚発生とポッドの形態との間の結合を確立します。これは、特にポッドスパイラルと棘の開発の数に基づいています。 in vivoでのを補完する別の方法tudiesは体細胞胚を生産するために培養葉の外植片を介してです。オーキシン（1-ナフタレン酢酸）、サイトカイニン（6-ベンジルアミノプリン）、アブシジン酸およびジベレリン酸 - 媒体は珍しいホルモンの組み合わせを含みます。異なる段階は、解剖せずに、カルスから成長している識別することができます。

収穫面積と総生産¹で穀物に2つ目の豆類は、約20,000種およびマメ科（またはマメ科）家族と高等植物の第三位のファミリーです。大豆は第三位の栽培作物です。穀物豆類は、人間の消費の²のための食事性タンパク質と植物油の三分の一の約3分の1を提供します。それらのN ₂の固定容量のマメ科植物はまた、持続可能な農業システムに貢献しています。 のMedicago truncatula、大豆のように、その種子の子葉にタンパク質と油を格納し、かなりの遺伝的およびゲノム資源^3,4との遺伝的およびゲノムマメ科モデルです。 M.一方、 truncatulaは ​​、それがますますマメ科植物の種子生物学^5-7と胚^8,9を研究するために採用されているマメ科植物根粒共生^4の理解の進歩を可能にしました。シロイヌナズナの胚発生は広範囲に私は^10,11を研究し、それされていますSA非マメ及び胚発生の詳細はMedicagoに^8,10と同じではありません。 Mの接合体胚発生truncatulaは ​​独特の多下垂、endoployploid懸垂帯および基底転送セル⁸と、興味深い機能を備えています。

体細胞胚形成（SE）は、一般的に、植物^12を再生するために使用されます。マメ科モデルMのtruncatulaは ​​、シードラインJemalong 2HA（2HA）は体細胞胚形成¹³率の高さを持っている親Jemalongから開発されてきました。生産胚の数は、最近確立された実質的に長い媒体¹⁴にジベレリン酸（GA）およびアブシジン酸（ABA）の両方を添加することによって増加しています。 GAとABAは通常拮抗^14を作用することが与えられた珍しい相乗的にこの場合はGAとABAの作用します。カルスから生産胚は、胚発生の段階が容易にvisuallを決定することができる表面上で開発しますY、容易に回収しました。胚形成（2HA）と非胚形成されている同質遺伝子系統（Jemalong）の近くに持つことは、体細胞胚形成の調査を容易にし、 インビボおよびインビトロ系の両方持つことは、種々の実験の可能性を提供します。

胚発生の細胞および分子メカニズムを理解することは、種子及び植物の開発を理解するために不可欠です。マメ科植物では、他の双子葉植物のように、それは、ヒトの栄養のために使用される製品を保存胚の子葉です。初期胚は、急速な細胞分裂、正しい胚のパターン形成を伴います。受精後約8日、Mのtruncatula胚は、初期の子葉段階に達します。形態学的特徴を正確に温室条件下で受精後日数で示されていません。このように、発生中の胚の段階を示すために、効率的な標準化されたアプローチは、遺伝的regulの研究に貴重なものです初期の接合体胚のエーション。

本稿では、マメ科植物のモデルMに胚発生の生物学的研究のために開発した胚を収集するために、2つの標準化されたプロトコルを提供しますtruncatula。第1は、第二は、簡単にアクセス大きな胚番号を提供するために、培養葉移植片を介して、体細胞胚形成の間、胚発生およびポッド形態を関連付けることにより、接合胚を収集することです。

1.接合胚の開発

1. 植物素材
   1. 成長のMedicagoは、14時間の光周期と23℃/ 19℃の昼/夜の温度と温室で野生型Jemalongまたはその付近の同質遺伝子（2HAとして知られている）、非常に再生成可能な遺伝子型Jemalong 2HA ¹³ truncatula。
      1. ピアース水がシードを入力して、一晩水に浸漬させられるように種子を播種する前に（23 G針で）種皮の表面。完全種子をカバーするために十分な水を追加します。
      2. ポッティング混合物中の各直径15cmのポットに3種をまく（10ポットの合計）（粗砂、パーライト、コイア-泥炭（1：1：1）を加えたOsmocote正確な標準の5グラム：徐放性肥料）へと転送温室。植物が登る茎のためにポットとサラウンド当たり1植物はトレリスによってそこにあるように、発芽後の健康な苗を保持します。
2. 収穫ポッド
   1. Wからポッドを収集第^9に記載されているように、適切な初期胚の段階を取得するためにILDタイプJemalongまたは2HA。
      注：異なるポッド段は、図1に示され、対応する胚の段階は、図2に示されています。
   2. 表1のとおり基準を使用して、収穫時に異なるポッドステージを確認してください。別々の段階6および7（ 表2）を助けるためにステージ6からの経過時間を測定します。
3. ポッドから胚珠を解剖し、胚の段階を確認します
   1. 必要に応じて単独で微細な鉗子を使用してポッドまたはステレオ解剖顕微鏡とピンセットから胚珠を分離します。必要に応じて胚段階を迅速に標準複合顕微鏡（ 図3B）を用いて確認することができます。
   2. 7.5グラムのアラビアゴム、100gの抱水クロラール、5ミリリットルグリセロール、60ミリリットルの脱イオン蒸留水を含む改変ホイヤーの溶液を調製します。 3-5時間または一晩攪拌して溶解します。
   3. よりリファインのためD顕微鏡は、修正ホイヤーのソリューション^15,16における解剖胚珠をオフにします。慎重に透明になるまで室温で（胚珠をカバーするのに十分）ホイヤーの少量の溶液中で無傷の胚珠と場所を拾います。
   4. 微分干渉コントラスト（DIC）光学系を有するサンプルを表示します。デジタルカメラ^9（ 図2）iwth画像をキャプチャします。
   5. ポッドの中央領域から最も均一な胚珠を入手して、必要な数を蓄積します。例えば、 図3Aに示されています。さらに分析するために必要な温度で氷とストアの胚珠（-80°Cのための核酸）を収集します。
      注：組織切片の分析の詳細については、透過型電子顕微鏡の場合、およびin situハイブリダイゼーションの論文^8,9を参照してください。

インビトロでの 2体細胞胚発生

1. Mを使用しますtruncatula品種 T帽子は容易に培養中の胚を形成することができます。葉移植片は、このプロトコルでは2-4ヶ月の古い2HA所^13,17を使用しています。
2. 延伸ステムの最新ほぼ完全に膨張した三つ葉の葉からチラシを取ります。
3. 脱水を避けるために、培養ポットに湿ったペーパータオルで三つ葉の葉をしてください。
   注：三つ葉の葉が収穫されると、彼らは最小の遅延で利用する必要があります。
4. 培地の調製
   1. 9センチメートルペトリ皿で​​4：1：寒天で5培地（V 0.8％W）P4 10を使用してください。
      注：P4 10：4：1：5の媒体は、P4の基礎培地¹⁸ + 10μM1-ナフタレン酢酸（NAA）、4μM6-ベンジルアミノプリン（BAP）、1μMのアブシジン酸（ABA）および5μMジベレリンで構成されてい酸（GA）。 GA + ABAの使用は、胚形成を促進し、胚の数¹⁴での実質的な増加を引き起こします。
   2. 1 LのP4基礎媒体を構成します。主要な塩からなる（calciuを作ります、）別途アップメートルマイナー塩およびビタミン（ 表3）、キレート鉄（別途構成する）、カザミノ酸（カゼイン加水分解物）、30gのスクロース、8グラム寒天。
   3. 適切な分注して-20℃での主要な塩、カルシウム、カザミノ酸、マイナー塩およびビタミンの店舗在庫ソリューションを提供しています。 4℃でキレート鉄を保管してください。
   4. •7HのFeSO ₄の1.853グラムを添加しながら攪拌しながら、脱イオン蒸留水約900ミリリットル中のNa ₂ EDTA•の7.44グラム2H ₂ Oを溶解させることによりキレート鉄（200X）を構成する場合、98〜99°Cの解決策をもたらします₂ O.成分が溶解されたときに最後に1リットルに構成しています。 4℃で琥珀色の瓶に保管してください。
   5. 表4のように原液とP4の基礎媒体を構成する。培地中のホルモンは、10μMNAA、4μMBAP、1μMABA、5μMGA（ 表4および特定の材料表を参照してください）です。 NAAを追加とBAPオートクレーブ処理の前に、オートクレーブし、約55℃に冷却し、注射器に取り付けた0.22μmのフィルターで濾過滅菌を使用した後にABAとGAを追加します。穏やかな旋回によりよく混ぜます。
   6. オートクレーブの前に1 M KOHでpHを5.8にメディアを調整します。 20分間121℃でオートクレーブ。
   7. 濾過滅菌ABAとGAを追加し、層流フードやバイオハザードキャビネットに無菌9センチメートルペトリ皿に約25ミリリットルのメディアを注ぐオートクレーブ後。クールで寒天は蓋をオフにして設定してみましょう。そして、蓋の上に置き、蓋には凝縮水がないことを確認してください。 （蓋コンデンセートを防ぐためにダンボール箱に）4℃で必要とストアとしてラベル。
5. 葉組織の滅菌
   1. 紫外線滅菌層流フードやバイオハザードキャビネットに働きます。
   2. 場所は、以前にオートクレーブし、バネ茶注入器のメッシュボールに残します。
   3. CULエタノール：70％（V V）で葉を含む茶注入器を浸し30秒間トゥーレポット。
      注：この手順のすべてのステップが使用するために250ミリリットルのオートクレーブ処理されたキャップポリカーボネート培養ポットをねじ込みます。
   4. ドレインその後1葉組織を転送し、浸漬：10分間希釈漂白剤（0.5％塩素）：8（V V）。随時穏やかに渦巻きます。
   5. 漂白剤を排出し、滅菌脱イオン蒸留水を含む培養ポットに茶の注入器を転送します。優しくスワールや余分な水分を排出します。滅菌脱イオン蒸留水の新鮮な培養ポットに1より多くの時間を繰り返します。
   6. 滅菌脱イオン蒸留水の新鮮な培養ポットに滅菌ピンセットで茶注入器から葉を削除します。無菌キャップをして反転し、旋回によってすすいでください。外植片を調製する準備ができるまで、滅菌水に浮かぶ葉のままにしておきます。
6. 外植片を準備し、メッキ
   1. 無菌技術を使用して、メスでエッジから個々の滅菌リーフレットをトリミングし、2つまたはTHRに残りの長方形をカット各外植片（ 図5A）の中心部にあるミッド静脈とEE長方形の外植片（8-10 X 3〜5ミリメートル）。
      注：外植片の大きさは最初のカルスを開始で非常に重要です。持ち帰り食品容器から滅菌蓋の切削を行います。
   2. 直径9cmのペトリ皿（ 図5B）で寒天固化培地上でプレート6の外植片。通常の葉の向きを維持するために、下に植片の背軸側にプレート。
   3. 皿の周りに延伸パラフィルム（ 図5C）でペトリ皿を密封します。組織は現在、インキュベーションのために準備ができています。
7. 組織インキュベーション
   1. 培養期間を通して温度制御室または成長キャビネットに28℃の暗所でプレートをインキュベートします。
      注：外植片は、脱分化を開始する細胞分裂、増殖（カルス形成）と胚（分化）を受けることになります。
   2. 差別explaのサブカルチャー新鮮な培地への3週間後にNTS。この継代培養では、層流フードやバイオハザードキャビネットに、無菌のステンレス鋼製のへらと鉗子を用いて全植片を移します。カルスが発生し、カルスは、 図5Cの最大のもののサイズを超えるように新鮮な培地に継代培養したときに、個々のカルスの50％を転送します。
   3. 約4週間の最初の胚を観察します。同期の程度はありますが、4-8週間の潜伏期間（ 図6A、B）の上に別の胚の段階を収集します。実験の目的に応じて解剖顕微鏡およびプロセスの下で収集します。
   4. 外植片を3ヶ月間の胚を生産し続けるように、3週間ごとに継代培養し、定期的に胚を削除します。

F -異なる胚の段階は、 図2Aに示されているがF -接合体胚形成のために異なる胚段階に対応する異なるポッド構造が図1Aに示されています。同じ段階でポッドを選択することにより、非常に均一である胚珠のサンプルは、（ 図3A）を得ることができます。 RT-qPCRの胚を使用して、特定の遺伝子が容易に検出され、経時的研究は^、9を評価することができます。いくつかの追加の解剖は、胚（ 図3B）の更なる濃縮のためにできるようになります。処理in situハイブリダイゼーション戦略を容易に任意の相補的な光を含む研究（ 図4A、B）および電子顕微鏡⁸と同様に行うことができるために。このシステムでは特に価値が下垂体や懸垂帯（ 図4A、B）の独自性です。

体細胞胚形成cについて個々 foliolesからの初期外植片のuttingを図5（a）に示されています。外植片を、次いで寒天（ 図5B）に密着して背軸面を配置されています。カルス形成の胚は3〜4週間後に表示されるように開始し、7週間子葉期（ 図5C）で多数の胚があります後。離散的な段階で週の間に4,7の胚を介してプレートに従うことにより（ 図6A、B）に配置することができます。別の胚の段階は容易に観察し、単に分析のためにオフに取り出すことができます。これは、特定の種​​類の情報を得るための非常に簡単な方法であることができます。例えば、 図7は、初期の子葉段階の胚が1 MtOLEOSIN遺伝子のタイプではなく、別の発現を示した方法を示しています。目的の遺伝子の時間経過研究は、次に接合体または体細胞胚を用いて調べることができます。体細胞胚システムの特定の利点はcalluの変換でありますSは、GUS（βグルクロニダーゼ）または蛍光標識を用いて可視化胚形成の様々な段階で全植物遺伝子発現を再生することなく行うことができます。例えば、 図6Cに示されています。

図1：個別の段階で胚と開発のさまざまな段階でのポッド形態と胚の開発段階は、ポッド。ステージ2-7示します。 （A）及び（B）は、非常に初期の段階2及び3は、早期プレ球状（C）ステージ4初期の球状（D）ステージ5後期球状（E）ステージ6心臓および（F）ステージ7後期魚雷。バーは2mmです。 I期は開花である（図示せず）。

図2：胚の発生段階。 </ strong>のさまざまな開発段階で胚をクリア。 （A）ステージ3初期プレ球状、（B）ステージ4初期球状、（C）ステージ5後期球状、（D）ステージ6心、及び（E）ステージ7後期魚雷。バーは60μmです。

図3：絶縁胚珠ステージ5胚と胚珠の（A）グループ。 （B）胚珠は「フック」終了時に削除することができ、胚を表示するために、標準的な複合顕微鏡下で観察しました。バーは1mmで（A）と200μmの（B）です。

図4：非常に初期胚のショーを介して、 初期胚の形態（A）節胚珠組織に適切な胚（4セル）、下垂体（次の4つのセル）、懸垂帯（大きな空胞を持って次の4つのセル）との関係をる。著名な懸垂帯（S）との初期の魚雷期胚（E）から（B）セクション。トルイジンブルーで染色しました。バーは10ミクロン（A）と50ミクロン（B）です。

図5：外植片が体細胞胚を生成するために培養小葉から植片が採取されている（A）カラタチの葉を示します。 （B）外植片を寒天上にプレーティングしました。 （C）7週間の培養後の外植片から製造された体細胞胚。 MM IS10バー

図6：体細胞胚のステージと遺伝子expressioの位置を特定しますn個の形質転換およびGUS球状で（A）体細胞胚（G）、心臓（H）と魚雷（T）ステージを使用。 （B）は、初期子葉段階での体細胞胚。 （C）（E）適切な胚におけるMtWOX9遺伝子について強いGUS発現を示す球状ステージ不定胚および下垂体（H）と懸垂帯（S）で減少染色を。バー（A、B）は 100μmです。バー（C）は 50μmです。

図7：胚形成カルスの胚から摘出した初期の子葉期胚における遺伝子の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を用いて、in vitroで胚duing発現 OLEOSIN3の遺伝子発現（A）およびOLEOSIN4（B）。式は相対tとしますOの葉。標準誤差が示されています。

表1：ポッドステージの収穫のための基準に定義胚の段階に対応するポッド段を識別するのに使用される形態学的基準。

ポッドコレクションの表2時間経過。Tからの時間日に示されている彼は、前の胚発生段階。

表3：P4中 P4の培地の成分。

表4：ホルモンとP4媒体を構成するストック溶液からのホルモンとP4媒体を構成します。

記載されているプロトコルは比較的単純であり、すべての現代的な細胞および分子技術とマメ科植物の胚発生の調査を可能にします。我々は両方の利点と欠点は、インビボおよびインビトロの方法であることを認識しています。両方とも、未熟種子¹⁹の培養に比べて初期胚発生に関する詳細フォーカスを可能にします。

in vivo試験の場合にはどのような説明されていることは主に、多くの胚の研究に適しているポッドから胚珠の単離であります。さらに、「フック」の領域（ 図3B）をオフにスライスして、胚組織のために豊かにすることはもちろん可能です。これは、それが十分に有利胚珠を利用して、隣接する組織に接続されていないようdisection中の胚はしばしば失われているように胚発生のごく初期の段階を分離することは困難です。ポッドの形態を使用すると、花のタグ付けを排除し、時間cを有します各花のためのラース政権。環境は非常に厳密に制御されていない限り、また、発生のタイミング方法の潜在的な変動性があります。ポッドの形成は、ストレス条件下で生じないように、最適な植物成長に重要です。ポッドの開発に精通し、若干の調整は、特定の胚発生の段階に合わせて、形態学的段階を定義するために行うことができます。

体細胞胚形成の場合には、胚は受精卵から無性なく導出されることを認識しなければなりません。また、栄養源は、接合胚とは異なります。不定胚の場合には、培養培地と周囲カルスであり、接合子胚の場合には内胚乳です。これは、懸垂帯はより良い接合体胚の場合に開発されることを意味し（ 図4A、B）。 Mの特定の値truncatulaシステムは珍しい4 hormonに応じて、胚の数が多いですE政権。大きな数字は、その後ホルモンやメディアへの追加を構成するの詳細を確認する発生しない場合はチェックする必要があります。損傷なしに外植片組織のいずれかの培養方法論の無菌性と同様に（これが問題であれば、エタノールと次亜塩素殺菌時間のタイミングを微調整を行うこと）を一緒に全ての製造工程中に無菌性を維持する上で注意して重要です。

私たちが発見したことは、それは、in vivoおよびin vitroの方法で補完する価値があるということです。私たち自身の研究の例は、エチレン応答転写因子遺伝子である転写因子MtSERF1（不定胚関連因子1）の調査です。 MtSERF1は、最初のRNAi、プロモーターGUS融合体とのin-situハイブリダイゼーションを用いて、体細胞胚で発見されました。その後接合体胚形成²⁰で発現されることが示されます。

マメ科植物の胚発生の研究では、時間が重要ですUMAN栄養、およびMを使用して、利用可能になりました細胞および分子技術とtruncatula胚一緒に、この領域を強化することができます。 Insightは、どのように胚のサイズに得ることができ、歩留まりが必要な炭水化物、油およ​​びタンパク質の組成物と一緒に最適化することができます。これらの決定は、主に初期胚発生^8,9に電車の中で設定されています。

The authors declare that they have no competing interests.

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.