Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

La embriogénesis temprana a partir de una sola célula cigoto pasa a través de una rápida división celular y la morfogénesis, y se caracteriza morfológicamente por etapas pre-globular, globulares, corazón, de torpedos y de cotiledones. Este desarrollo progresivo está bajo la regulación estricta de una red molecular compleja. La recolección de suficientes embriones tempranos en una etapa similar de desarrollo es esencial para la investigación de la regulación celular y molecular de la embriogénesis temprana. Esto no es directo desde la embriogénesis temprana sufre morfogénesis rápido en un corto periodo de tiempo, por ejemplo 8 días para Medicago truncatula para llegar al estadio de cotiledones temprano. Aquí, abordamos el tema por dos enfoques. El primero establece una vinculación entre el desarrollo del embrión y la morfología pod en ayudar a indicar la etapa del embrión cigóticos. Esto se basa sobre todo en el número de espirales de la vaina y el desarrollo de las espinas. Una forma alternativa para complementar la in vivo sos estudios es a través de explantes de hoja de cultivo para producir embriones somáticos. El medio incluye una combinación de hormonas inusual - una auxina (ácido 1-naftalenacético), una citocinina (6-bencilaminopurina), el ácido abscísico y ácido giberélico. Las diferentes etapas se pueden discernir que crece fuera del callo sin disección.

Las legumbres son la tercera familia más grande de plantas superiores, con aproximadamente 20.000 especies y el (o Fabaceae) familia de las leguminosas son segundos a los cereales en la superficie cosechada y la producción total ^1. La soja es el cultivo cultivado tercera más grande. Leguminosas de grano proporcionan alrededor de un tercio de la proteína dietética y un tercio de aceite vegetal para el consumo humano ^2. Legumbres con su capacidad de fijación de _N2 también contribuyen a los sistemas agrícolas sostenibles. Medicago truncatula, como la soja, las tiendas de proteína y aceite en los cotiledones de las semillas y es una leguminosa modelo genética y genómica con considerables recursos genéticos y genómicos ^3,4. Mientras M. truncatula ha permitido avances en la comprensión de la leguminosa simbiosis Rhizobium ⁴ se ha empleado cada vez más para estudiar la biología de semillas de leguminosas ^5-7 y embriogénesis ^8,9. Embriogénesis Arabidopsis ha sido ampliamente estudiado ^10,11 pero isa no leguminosas y los detalles de la embriogénesis no son idénticos a Medicago ^8,10. Embriogénesis cigóticos en M. truncatula tiene características interesantes, con un hipófisis multicelular distintivo, un suspensor endoployploid y transferencia de células basales ^8.

La embriogénesis somática (SE) se utiliza comúnmente para la regeneración de plantas ^12. En el modelo de leguminosas M. truncatula, la línea de semillas Jemalong 2HA (2HA) se ha desarrollado a partir de la matriz Jemalong tener altas tasas de embriogénesis somática ^13. El número de embriones producidos recientemente se ha incrementado sustancialmente por la adición tanto de ácido giberélico (GA) y ácido abscísico (ABA) al medio de largo establecido ^14. En este caso, GA y actuar sinérgicamente ABA, que es inusual dado que GA y ABA generalmente actúan antagónicamente ^14. Los embriones producidos a partir de callos se desarrollan en la superficie que permite la etapa de la embriogénesis a ser determinada fácilmente Visually cosechado y fácilmente. Tener cerca de líneas isogénicas que son embriogénico (2HA) y no embriogénico (Jemalong) facilita la investigación de la embriogénesis somática y que tiene tanto in vivo como sistemas in vitro proporciona diferentes posibilidades experimentales.

La comprensión de los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo embrionario es esencial para la comprensión de semillas y desarrollo de la planta. En las legumbres, como en otras dicotiledóneas, son los cotiledones del embrión que almacenan los productos que se utilizan para la nutrición humana. Embriogénesis temprana implica la división de células, y los patrones de embriones correcta. En aproximadamente 8 días después de la fecundación, el M. truncatula embrión alcanza etapas tempranas de cotiledones. La caracterización morfológica no se indica exactamente por día después de la fecundación en condiciones de invernadero. Por lo tanto, un enfoque estandarizado eficiente para indicar la etapa de embriones en desarrollo es valioso en el estudio de la genética Regulación de principios de la embriogénesis cigóticos.

En este trabajo, ofrecemos dos protocolos estandarizados para recoger embriones en desarrollo para estudios biológicos de la embriogénesis en el modelo de leguminosas M. truncatula. El primero es recoger embriones cigóticos asociando la embriogénesis y pod morfología mientras que la segunda es la embriogénesis somática a través de explantes de hoja de cultivo para proporcionar los números de embriones grandes de fácil acceso.

1. Desarrollo de embriones cigóticos

1. Material Vegetal
   1. Crece la Medicago truncatula tipo salvaje Jemalong o su isogénica más cercana, altamente re-generable genotipo Jemalong 2HA ¹³ (conocido como 2HA) en un invernadero con un fotoperíodo de 14 horas y 23 ° C / 19 ° C de temperatura día / noche.
      1. Pierce la superficie de la cubierta de la semilla (con una aguja de 23 G) antes de sembrar la semilla de modo se permite que el agua para entrar en la semilla y en remojo en agua durante la noche. Agregar suficiente agua para cubrir la totalidad de la semilla.
      2. Siembre 3 semillas en cada maceta 15 cm de diámetro (un total de 10 macetas) en la mezcla para macetas (gruesa arena, perlita, fibra de coco, turba (1: 1: 1) más de 5 g de Osmocote Estándar exacta: fertilizante de liberación lenta) y traslado al invernadero. Conserve la plántula más saludable después de la germinación por lo que no es de 1 planta por maceta y rodeado de un enrejado para la planta proviene de escalar.
2. Vainas de cosecha
   1. Recoger las vainas de la wTipo ild Jemalong o 2HA para obtener las fases de embrión temprano adecuadas como primera describe ^9.
      NOTA: Las diferentes etapas de la vaina se muestran en la Figura 1 y las etapas de embriones correspondientes se muestran en la Figura 2.
   2. Compruebe las diferentes etapas de la vaina en la cosecha utilizando criterios como por la Tabla 1. Medir el tiempo transcurrido desde la etapa 6 para ayudar etapas separadas 6 y 7 (Tabla 2).
3. La disección de los óvulos de las vainas y la comprobación de la etapa de embrión
   1. Aislar óvulos de vainas utilizando unas pinzas finas sola o un microscopio de disección estéreo y pinzas si es necesario. Si se requiere la etapa de embrión se puede comprobar rápidamente usando un microscopio compuesto estándar (Figura 3B).
   2. Prepárese modificado solución de Hoyer que contiene 7,5 g de goma árabe, 100 g de hidrato de cloral, 5 ml de glicerol, 60 ml de agua desionizada destilada. Disolver por agitación durante 3-5 horas o durante la noche.
   3. Para obtener más refinard microscopía borrar los óvulos disecados en solución de ^15,16 Hoyer modificado. Recoja cuidadosamente los óvulos intactos y el lugar en un pequeño volumen de solución de Hoyer (suficiente para cubrir el óvulo) a temperatura ambiente hasta que se aclare.
   4. Ver las muestras con contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica. Captura las imágenes iwth una cámara digital ⁹ (Figura 2).
   5. Obtener los óvulos más uniformes de la región central de la vaina y acumular el número requerido. Un ejemplo se muestra en la Figura 3A. Recoge los óvulos en el hielo y almacenar a temperatura requerida (ácidos -80 ° C durante nucleicos) para su posterior análisis.
      NOTA: Para obtener más información sobre el análisis de las secciones histológicas, la microscopía electrónica de transmisión, y la hibridación in situ por favor vea los papeles ^8,9.

2. Desarrollo de embriones somáticos in vitro

1. Utilice una M. truncatula cultivar tsombrero es capaz de formar fácilmente embriones en cultivo. Para este protocolo para explantes de hoja utilizar las plantas 2HA ^13,17 que son 2-4 meses de edad.
2. Tome folletos de la última hoja trifoliada casi totalmente expandido de un vástago alargando.
3. Mantenga las hojas trifoliadas sobre toallas de papel húmedo en una olla de la cultura para evitar la deshidratación.
   NOTA: Una vez que las hojas trifoliadas se cosechan que necesitan para ser utilizado con la mínima demora.
4. Preparación del medio de cultivo
   1. Utilice el P4 10: 5 en medio de agar (0,8% w:: v) 4: 1 en 9 cm placas de Petri.
      NOTA: El P4 10: 4: 1: 5 medio consiste en el medio basal P4 ¹⁸ más 10 mM de ácido 1-naftalenacético (NAA), 4 M 6-bencilaminopurina (BAP), 1 mM de ácido abscísico (ABA) y 5 mM giberélico ácido (GA). El uso de GA + ABA acelera la formación del embrión y provoca aumentos sustanciales en el número de embriones ^14.
   2. Conforman el medio basal P4 en 1 L; que consiste en sales principales (hacer calcium hasta por separado), sales menores y vitaminas (Tabla 3), de hierro quelado (compensar por separado), casamino ácidos (hidrolizado de caseína), 30 g de sacarosa, 8 g de agar.
   3. Soluciones tienda del stock de las principales sales, calcio, casaminoácidos, sales menores y vitaminas a -20 ° C en alícuotas adecuadas. Guarde hierro quelado a 4 ° C.
   4. Completar el hierro quelado (200x) disolviendo 7,44 g de Na ₂ EDTA • 2H ₂ O en aproximadamente 900 ml de agua destilada desionizada Mientras se agita, a continuación, llevar la solución a 98-99 ° C, mientras que la adición de 1,853 g de _FeSO4 • 7H ₂ O. Finalmente hacer hasta 1 L cuando se disuelven los ingredientes. Almacenar en color ámbar botellas a 4 ° C.
   5. Completar el medio basal P4 con las soluciones madre como en la Tabla 4. Las hormonas en el medio son 10 M NAA, 4 BAP M, 1 ABA M, 5 M GA (ver Tabla 4 y Materiales Específicos Tabla). Añadir la NAAy BAP antes de tratamiento en autoclave y añadir ABA y GA después de tratamiento en autoclave y de enfriar a aproximadamente 55 ° C, utilizando esterilización por filtración con un filtro de 0,22 micras unida a una jeringa. Mezclar bien agitando suavemente.
   6. Ajuste los medios a pH 5,8 con 1 M de KOH antes de autoclave. Autoclave a 121 ° C durante 20 min.
   7. Después de autoclave agregar la ABA esterilizada filtro y GA, y vierta aproximadamente 25 ml de medio en 9 cm placas de Petri estériles en una campana de flujo laminar o gabinete de riesgo biológico. Enfriar y dejar que el agar establece con la tapa. A continuación, poner en la tapa y asegúrese de que no hay condensación en la tapa. Etiqueta según sea necesario y se almacena a 4 ° C (en una caja de cartón para evitar condensado tapa).
5. La esterilización de la hoja de tejido
   1. Trabajar en una campana de flujo laminar UV-esterilizados o gabinete de riesgo biológico.
   2. Coloque las hojas en la bola del acoplamiento de un infusor de té de primavera previamente tratada en autoclave.
   3. Sumerja infusor de té que contiene las hojas en el 70% (v: v) de etanol en una callepote tura durante 30 segundos.
      NOTA: Para todos los pasos de este procedimiento utilizan 250 ml tornillo de cabeza macetas de cultivo de policarbonato que son tratados en autoclave.
   4. Escurrir y luego transferir y sumergir el tejido de las hojas en 1: 8 (v: v) de blanqueador diluido (0,5% de cloro) durante 10 minutos. Agitar suavemente de vez en cuando.
   5. Escurrir la lejía y transferir el sistema de infusión de té en una olla de cultivo que contiene agua destilada desionizada estéril. Hacer girar suavemente y drenar el exceso de agua. Repetir una vez más con una olla de cultivo fresco de agua destilada desionizada estéril.
   6. Quite las hojas desde el infusor de té con unas pinzas estériles a una olla de cultivo fresco de agua destilada desionizada estéril. Tornillo en la tapa estéril y enjuague invirtiendo y remolinos. Deja las hojas que flotan en el agua estéril hasta que esté listo para preparar los explantes.
6. Preparación y Plating explantes
   1. Usando técnicas estériles, recorte folletos esterilizados individuales desde el borde con un bisturí, y cortar el rectángulo restante en dos o three explantes rectangulares (8-10 x 3-5 mm) con la mitad de la vena en el centro de cada explante (Figura 5A).
      NOTA: El tamaño del explante es muy importante en la iniciación de la primera formación de callos. Llevar a cabo el corte en las tapas de los recipientes estériles comida para llevar.
   2. Placa de 6 explantes en medio de cultivo agar-solidificado en 9 cm de diámetro placas de Petri (Figura 5B). Placa del lado abaxial explantes abajo para mantener la orientación habitual hoja.
   3. Sellar las placas de Petri con Parafilm (Figura 5C) se extendía alrededor del plato. El tejido está ahora listo para la incubación.
7. La incubación del tejido
   1. Incubar las placas en la oscuridad a 28 ° C en un ambiente de temperatura controlada o gabinete crecimiento en todo el período de cultivo.
      NOTA: Los explantes iniciarán desdiferenciación, someterse a la división celular, la proliferación (formación de callo) y la embriogénesis (diferenciación).
   2. Subcultivar la EXPOSICIÓN diferenciadornoches después de 3 semanas a un medio fresco. En este subcultivo transferir todo el explante usando una espátula de acero inoxidable estéril y pinzas, en una campana de flujo laminar o un armario de riesgo biológico. Como se produce formación de callos y el callo supera el tamaño de la más grande en la Figura 5C, transferir 50% del callo individual cuando el subcultivo a un medio fresco.
   3. Observe los primeros embriones en unos 4 semanas. Mientras que hay un grado de sincronía, recoger las diferentes etapas de embrión de más de un período de incubación de 4-8 semanas (Figura 6A, B). Reunir bajo un microscopio de disección y el proceso de acuerdo con los objetivos experimentales.
   4. Subcultivar cada 3 semanas y eliminar periódicamente los embriones de modo que los explantes continuarán produciendo embriones durante 3 meses.

Para embriogénesis diferentes estructuras vaina cigóticos correspondientes a las diferentes etapas de embriones se muestra en la Figura 1A - F, mientras que las diferentes etapas de embriones se muestran en la Figura 2A - F. Mediante la selección de las vainas en la misma etapa, las muestras de óvulos que son bastante uniforme puede obtenerse (Figura 3A). Mediante el uso de RT-qPCR embrión genes específicos se pueden detectar fácilmente y estudios de curso temporal evaluaron ^9. Algunos disección adicional permitirá un mayor enriquecimiento del embrión (Figura 3B). Procesamiento para estrategias de hibridación in situ se pueden llevar fácilmente a cabo, así como cualquier estudios complementarios que impliquen la luz (Figura 4A, B) y microscopía electrónica de ^8. De especial valor en este sistema es el carácter distintivo de la hipófisis y el suspensor (Figura 4A, B).

Para embriogénesis somática del cUtting del explante inicial de los foliolos individuales se muestra en la Figura 5A. Los explantes se colocan entonces lado abaxial hacia arriba en estrecho contacto con el agar (Figura 5B). Después de callo embriones de formación comienzan a aparecer después de 3-4 semanas y 7 semanas hay numerosos embriones en el estadio de cotiledones (Figura 5C). Siguiendo las placas a través de entre 4 y 7 semanas embriones en etapas discretas puede ser localizado (Figura 6A, B). Las diferentes etapas de embriones se pueden observar fácilmente y simplemente recogieron fuera para el análisis. Esta puede ser una manera rápida de obtener ciertos tipos de información. Por ejemplo la Figura 7 ilustra cómo los embriones en la etapa de cotiledón temprano mostraron expresión de un tipo de gen MtOLEOSIN pero no en otro. Cursos Tiempo estudios del gen de interés pueden ser examinadas usando cigóticos o embriones somáticos. Una ventaja particular del sistema de embrión somático es que la transformación de la Callus puede llevar a cabo sin regenerar una planta entera y la expresión génica en diferentes etapas de la embriogénesis visualizaron utilizando GUS (β-glucuronidasa) o marcadores fluorescentes. Un ejemplo se muestra en la Figura 6C.

Figura 1: Pod morfología y etapas de desarrollo de embriones Pods en diferentes etapas de desarrollo con embriones en etapas discretas.. Etapas 2-7 indicaron. (A) y (B) son las etapas 2 y 3 primeros y los primeros pre-globular (C) Etapa 4 principios globular (D) Etapa 5 finales globular (E) Etapa 6 del corazón y (F) Etapa 7 finales torpedo. Bar es 2 mm. Etapa I es la floración (no mostrado).

Figura 2: etapas de desarrollo del embrión. </ Strong> embriones aclarados en diferentes etapas de desarrollo. (A) Etapa 3 temprano, (B) etapa de pre-globular 4 globular temprana, (C) Etapa 5 finales globular, (D) Etapa 6 corazón, y (E) Etapa 7 finales torpedo. Bar es 60 micras.

Figura 3: Aislado óvulos (A) Grupo de los óvulos con la etapa 5 embriones.. (B) Óvulo observa bajo el microscopio compuesto estándar para mostrar embrión que puede ser extirpado en el extremo "gancho". Bar es 1 mm (A) y 200 m (B).

Figura 4:. Morfología del embrión temprano (A) Sección a través de la demostración embrión muy tempranoing embrión propiamente dicho (cuatro celdas), hipófisis (cuatro células próximos), suspensor (cuatro células próximas que tienen grandes vacuolas) y la relación con los tejidos óvulo. (B) Sección a través de embriones etapa torpedo temprano (E) con suspensor prominente (S). Tiñeron con azul de toluidina. Bar es 10 m (A) y 50 micras (B).

Figura 5:. El cultivo de explantes de producir embriones somáticos (A) de la hoja que muestra Trifoliado donde se toman explantes de foliolo. (B) Los explantes sembraron en agar. (C) Los embriones somáticos producidos a partir de explantes después de 7 semanas de cultivo. Bar mm IS10

Figura 6: etapas de embriones somáticos y la identificación de la ubicación de expressio genn usando la transformación y GUS. (A) Los embriones somáticos en globular (G), corazón (H) y del torpedo (T) etapas. (B) Los embriones somáticos en etapa de cotiledones temprano. (C) globular embrión somático etapa que muestra una fuerte expresión de GUS para el gen MtWOX9 en embrión propiamente dicho (E) y tinción decreciente en hipófisis (H) y suspensor (S). Bar (A, B) es de 100 micras. Bar (C) es 50 micras.

Figura 7: La expresión génica duing embriogénesis in vitro usando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) La expresión de genes de OLEOSIN3 (A) y OLEOSIN4 (B) en embriones en estadio de cotiledón temprano extirpados de embriones a partir de callo embriogénico.. Expresión es relativo to hoja. Los errores estándar indican.

Tabla 1: Criterios para la cosecha de etapas vaina criterios morfológicos utilizados en la identificación de las etapas de la vaina que corresponde a las etapas definidas de embriones..

Tabla curso 2. Tiempo para la recolección de las vainas. El tiempo desde tlo anterior etapa de desarrollo embrionario indica en día.

Tabla 3: P4 Medium Los componentes del medio de P4..

Tabla 4: Compensar el medio P4 con hormonas Preparacion el medio P4 con hormonas de soluciones madre..

Los protocolos descritos son relativamente sencillo y permiten la investigación de la embriogénesis leguminosa con toda la célula contemporánea y técnicas moleculares. Reconocemos que hay ventajas y desventajas de ambos in vivo e in vitro enfoques. Ambos permiten un mayor enfoque en la embriogénesis temprana en comparación con la cultura de las semillas inmaduras ^19.

En el caso de los estudios in vivo lo que se describe es predominantemente el aislamiento del óvulo de la vaina que es adecuado para muchos estudios de embriones. Por supuesto, es posible enriquecer aún más para el tejido de embriones por cercenar la zona de "gancho" (Figura 3B). Es difícil aislar el muy etapa más temprana del desarrollo embrionario como durante disección el embrión se pierde a menudo, ya que no está bien unido al tejido adyacente, por lo que el uso de óvulos ventajosas. El uso de la morfología pod elimina el marcado de las flores y tener un tiempo crégimen ourse para cada flor. Además existe la posibilidad de variabilidad en los métodos de sincronización de desarrollo a menos que el entorno está muy estrechamente controlada. Crecimiento de la planta óptima es importante para que la formación de la vaina no se produce bajo condiciones de estrés. Familiarizarse con el desarrollo de las vainas y pequeños ajustes se pueden hacer para definir etapas morfológicas para que coincida con las etapas de desarrollo del embrión específicos.

En el caso de la embriogénesis somática, que tiene que ser reconocido que los embriones se derivan asexualmente y no de un cigoto. Además, la fuente nutricional es diferente al embrión cigóticos. En caso de que el embrión somático, es el medio de cultivo y callo circundante, y en el caso del embrión cigóticos es el endospermo. Esto significa que el suspensor se desarrolló mucho mejor en el caso del embrión cigóticos (Figura 4A, B). El valor particular de la M. truncatula sistema es el gran número de embriones en respuesta a la inusual cuatro hormonrégimen e. Si no se producen los grandes números a continuación, comprobar los detalles de lo que las hormonas y su adición al medio se debe comprobar. Como con cualquier esterilidad metodología de cultivo del tejido explante y sin daños (hacer pequeños ajustes en el calendario de etanol y tiempos de esterilización hipoclorito si esto es un problema) es importante, junto con el cuidado en el mantenimiento de la esterilidad durante todas las etapas de preparación.

Lo que hemos encontrado es que es valiosa para complementar in vivo e in vitro procesos. Un ejemplo de nuestros propios estudios es la investigación del factor de transcripción MtSERF1 (embrión somático RELACIONADOS FACTOR 1) que es un factor de transcripción de genes de respuesta de etileno. MtSERF1 fue descubierto por primera vez en embriones somáticos utilizando RNAi, fusiones promotor-GUS y hibridaciones in situ; y luego demostrado que se expresa en la embriogénesis cigóticos ^20.

El estudio de la embriogénesis leguminosa es importante para hnutrición Uman, y el uso de M. truncatula embriones junto con las tecnologías celulares y moleculares disponibles ahora puede mejorar esta área. Insight se puede conseguir en cómo el tamaño del embrión y por lo tanto el rendimiento puede ser optimizado junto con la composición de carbohidratos, aceite y proteína requerida. Estos determinantes se encuentran en gran parte en tren en la embriogénesis temprana ^8,9.

The authors declare that they have no competing interests.

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.