Измерение потоков минеральных питательных веществ и токсикантов в растениях с помощью радиоактивной метки

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Поглощение и распределение питательных веществ и токсикантов сильно влияют на рост растений. Соответственно, исследование основных транспортных процессов является одним из основных область исследований в биологии растений и сельскохозяйственных наук ^1,2, особенно в контекстах питательной оптимизации и экологических стрессов (например, соль стресс, токсичность аммония). Главным среди методов для измерения потоков в растениях является использование радиоизотопных индикаторов, которая была разработана значительно в 1950 (смотри, например, ³⁾ и продолжает быть широко используется сегодня. Другие методы, такие как измерения истощение питательных веществ из корневой среды и / или накопления в тканях, использование ионно-селективных вибрирующих микроэлектродов, такие как MIFE (микроэлектродной ионный оценки потока) и SIET (сканирование ионоселективная техники электрод), и использования ион-селективный флуоресцентные красители, также широко применяется, но ограничены в их способности обнаружить чистую гриппаРЭС (т.е. разница между притоком и оттоком). Использование радиоизотопов, с другой стороны, позволяет исследователю уникальную возможность изолировать и количественно однонаправленные потоки, которые могут быть использованы для решения кинетических параметров (например, К _М и V _макс), и дать представление о мощности, энергетика, механизмы и регулирование, транспортных систем. Однонаправленные измерения потока, сделанные с радиоактивных индикаторов являются особенно полезными в условиях, когда поток в противоположном направлении высока, а оборот внутриклеточных пулов происходит быстро ^4. Кроме того, радиоиндикаторные методы позволяют измерять, которые будут проводиться в довольно высоких концентрациях субстрата, в отличие от многих других методов (см 'Обсуждение', ниже), так как прослеживается изотоп наблюдается на фоне другого изотопа того же элемента.

Здесь мы предоставляем подробные инструкции для радиоизотопного измерения однонаправленной и пET потоки минеральных питательных веществ и токсикантов в целые растения. Акцент будет сделан на измерении потока калия (K ^+), растительного макро- ⁵ и аммиака / аммония (NH ₃ / NH ₄ ^+), другой макроэлементов, которые, однако, токсичным, когда он присутствует в высоких концентрациях (например, 1- 10 мМ) ^2. Мы будем использовать радиоизотопы ⁴² K ⁺ (т _1/2 = 12,36 ч) и ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ⁺ (т _1/2 = 9,98 мин), соответственно, в неповрежденных саженцев модель системы ячменя (Hordeum обыкновенной L .), в описании двух основных протоколов: прямой приток (DI) и полигамное анализа индикаторного оттока (CATE). Отметим, с самого начала, что эта статья просто описывает шаги, необходимые для выполнения каждого протокола. Где это уместно, краткие пояснения расчетов и теории предоставляются, но подробные экспозиции каждой техники'Ы фона и теория может быть найден в нескольких ключевых статей на эту тему ^4,6-9. Важно отметить, что эти протоколы в целом подлежит передаче потока анализ других питательных веществ / токсикантов (например, Na ^{+, 24, 22} Na ^+, Rb ^{+ 86, 13} NO ₃ ^-) и других видов растений, хотя и с некоторыми оговорками (смотри ниже) . Мы также подчеркиваем важность того, чтобы все исследователи, работающие с радиоактивными материалами должны работать в соответствии с лицензией, расположенной через ионизирующего регулятора радиационной безопасности их учреждения.

1 завод Культура и подготовка

1. Вырастить ячменя гидропонике в течение 7 дней в камере роста климат-контролем (подробнее см ^10).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно рассмотреть вопрос об изучении растений на различных стадиях развития, как питательные требования будут меняться с возрастом.
2. За день до экспериментов, расслоение несколько саженцев вместе, чтобы сделать единый копировщика (3 растения в пачку для DI, 6 заводов в пачку для ЗАТО). Bundle саженцы, обернув 2-см кусок Tygon трубки вокруг базальной части побегов, и обеспечение трубку с лентой, чтобы создать "воротник".
   ПРИМЕЧАНИЕ: Число растений в пачке может изменяться в зависимости от условий эксперимента ^10,13,14. Комплектация делается для улучшения статистики и точность измерения, особенно когда корневой массы и / или удельная активность низкая.

2 Получение экспериментальных решений / Материалы

1. Для DI, собрать следующее: Pre-маркировки, этикетирования и десорбции решения (подробнее см ^11), центрифугирования труб (для спин-сушки образцов растений), и ампулами (для растительного материала и удельной активности [S _°; смотри ниже]). Аэрацию и смешать все решения.
2. Для ЗАТО, собрать следующие: Хорошо смешанная, газобетон маркировки и элюирования решения (подробнее см ^10), эффлюксных воронки, центрифугирования труб (для спин-сушки образцов растений) и примеров флаконов (для элюатов, образцы растений, и определение S _о и коэффициент разбавления [D _F; ниже]).

3 Подготовьте радиоиндикаторные

ВНИМАНИЕ: Следующие шаги безопасности должны быть приняты до начала работы с радиоактивностью.

1. Убедитесь, что требования радиоакный материалы лицензия понимаются и последовал. Надевайте оборудование для обеспечения безопасности (т.е., очки, перчатки, лабораторный халат, свинец жилет / воротник) и дозиметры (например, TLD кольцо и значок). Настройка защиты (т.е., оргстекло и свинцовые кирпичи) и выполнять радиоактивный работу за ним. Убедитесь, что счетчик Гейгера-Мюллера присутствует для того, чтобы регулярно контролировать на предмет загрязнения.
2. Подготовка ⁴² K ⁺
   1. Поместите чистую, сухую мензурку на баланс. Нулевой баланс.
   2. Удалить пузырек индикатора (20 мКи ⁴² K ₂ CO _3, в виде порошка) из упаковки и залить трассирующими в стакан. Обратите внимание на массы.
   3. Внесите 19,93 мл дН ₂ O, а затем 0,07 мл H ₂ SO _4, в стакан. Это будет стимулировать следующую химическую реакцию:
      ⁴² K ₂ CO ₃ (Ы) + H ₂ SO ₄ (L) + H ₂ O (L) → ⁴² K ₂ SO ₄ (Л) + CO ₂ (V) + 2H ₂ O (л)
   4. Рассчитайте концентрацию радиоактивного раствора, учитывая массу и молекулярную массу K ₂ CO _3, и объем (20 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с ¹³ NH ^_3/13 NH ₄ ⁺ трассирующими производится в циклотроне через протонного облучения атома кислорода воды (как правило, в результате 100-200 мКи деятельности; для производства деталей, увидеть ^12). Поскольку количество ¹⁴ NH ^_3/14 NH ₄ ⁺ чрезвычайно низка в этих растворах, концентрация Н из маточного раствора можно пренебречь.

4 Прямая Приток (DI) Измерение

1. Для ⁴² K ^+, пипетки количество радиоактивного раствора, необходимое для достижения желаемого конечного концентрацию K ⁺ в маркировке решения.
   1. Для ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ^+, пипетку небольшое количество (<0,5 мл) в растворе маркировки. Разрешить маркировки решение тщательно перемешать (через аэрации).
2. Пипетки 1 мл подвыборки маркировки раствора в пробирку образца и повторить три раза (4 образцы в общей сложности).
   1. Измерьте радиоактивности во флаконах (в "импульсов в минуту", CPM), с помощью гамма-счетчика. Убедитесь, что счетчик запрограммирован таким образом, что качения показания корректируются для изотопного распада (это особенно важно для таких короткоживущих индикаторов).
   2. Рассчитать С _О (в виде копий в минуту мкмоль ^-1) путем усреднения подсчеты четырех образцов (CPM мл ^-1) и деления на концентрации субстрата в растворе (мкмоль мл ^-1).
3. Погрузите корни в предварительно маркировки (нерадиоактивного) решения в течение 5 мин, предварительно уравновесить растений в условиях испытаний (смнапример, ^10,13,14 для изменения во времени предварительно этикетки).
4. Погрузите корни в маркировке (радиоактивного) решения в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: раз Маркировка может меняться в зависимости от эксперимента ^3,4,7-10.
5. Трансфер корни десорбции решения в течение 5 сек, чтобы удалить большую часть поверхности-придерживаясь радиоактивности. Передача корни во второй стакан десорбирующего раствора в течение 5 мин и далее четких корней внеклеточного индикатора.
6. Проанализируйте и отдельные побеги, прикорневых побегов, и корни.
7. Поместите корни в центрифужные пробирки и образцы спина в течение 30 сек в низкой скорости, клинико-класса центрифуги (~ 5000 XG) для удаления поверхностных и иловой воды.
8. Взвесьте корни (сырого веса, FW).
9. Количество радиоактивности в пробах растений (стрелять, базального побега, и корня, см шаг 4.2.1).
10. Вычислить поток. Рассчитать приток в растение по формуле
    Φ = Q * / S _о мас _L
    где Φ является поток(Мкмоль г ^-1 ч ^-1), Q * является количество примеси накапливаются в ткани (копий в минуту, как правило, в корне, стрелять, и базальная стрелять, комбинированные), S _о является удельная активность маркировки решения (CPM мкмоль ^{- 1),} W есть корень свежий вес (г), а T _L это время маркировка (HR).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более сложные вычисления можно сделать для учета одновременного индикаторного истечения от корней во время маркировки и десорбции, на основе параметров, полученных из ЗАТО (см ниже; подробнее см ^4).

5 полигамное Анализ Tracer отток (CATE) измерения

1. Приготовьте раствор маркировки и мера S _о (см шаги 4,1 - 4,2, выше).
2. Измерьте коэффициент разбавления (D _F).
   Примечание: Часто, положение образца относительно детектора в гамма-счетчике может влиять на количествоизлучения измеряется. Смотреть обсуждение для деталей.
   1. После измерения С _О, добавить 19 мл H ₂ O к каждому образцу (таким образом, чтобы конечный объем = элюат объем = 20 мл). Количество радиоактивности в каждой пробе 20 мл (этап 4.2.1).
   2. Расчет D _F делением средней СРМ в 1-мл образцы средним импульсов в минуту на 20-мл пробы.
3. Погружают корни в маркировке раствора в течение 1 часа.
4. Удалить растения от решения маркировки и передачи растений отток воронку, обеспечивая весь корень материал в воронку. Мягко безопасные растения в стороне оттока воронку, применяя небольшую полоску ленты на пластиковой втулкой.
5. Аккуратно вылейте первый элюат в воронку. Включить таймер (подсчитывая).
6. Откройте кран и соберите элюат в пробирку образца после 15 сек (примечание: время элюирования будет меняться, смотрите ниже). Закройте кран. Аккуратно влить следующий элюата в воронку.
7. RepeaT шаг 5,6 в течение оставшейся части серии элюции, которое следует ниже, от первого до конечного элюата: 15 сек (четыре раза), 20 сек (три раза), 30 сек (дважды), 40 секунд (один раз), 50 секунд (один раз), 1 мин (в 25 раз), на общую элюции периода 29,5 мин
   ПРИМЕЧАНИЕ: десорбция серии может меняться в зависимости от условий эксперимента ^7-10,13,14.
8. После того, как протокол элюирование завершена, урожай растений (шаги 4,6 - 4,8, выше).
9. Количество радиоактивности в элюатов и растительных образцов в гамма-счетчике (умножения гороскоп для каждого элюата путем D _F, см 5,2).
10. Участок Tracer выпуск (CPM г (кубический FW) ^-1 мин ^-1) в виде функции времени элюирования. Для стационарных условиях, выполнять линейные регрессии и расчеты потоков, период полураспада валют и размеры пула (подробнее см ^6-9).

На рисунке 1 показаны изотермы найденные с помощью техники DI (с ¹³ N), для притока NH ₃ в корни интактных проростков ячменя, выращенных при высокой (10 мМ) NH ₄ ^+, и либо низкий (0,02 мм) или высокой (5 мМ ) K ^+. Изотермы отображения Михаэлис-Ментен кинетики, когда NH ₃ флюсы строится как функция внешнего NH ₃ концентрации ([NH _{3] доб;} скорректированной на изменения в рН раствора ^13). NH ₃ потоки были значительно выше при низкой K ^+, чем при высокой K ^+. Анализ Михаэлис-Ментен кинетических параметров показал, что К _М оставалась относительно стабильной между K ⁺ уровней (150 против 90 μ М при низкой и высокой K ^+, соответственно), в то время как V _макс сильно снижается при высокой K ⁺ (205 против 80 мкмоль г ^-1 ч ^-1). Таким образом, данные показывают, что уровень K ⁺ регламентациюэс транспорт азота (V _макс эффект), но не по прямой конкуренции между К ⁺ и NH ₃ для сайтов связывания транспортеров (эффект К _М). Скорее, K ⁺ может регулировать NH ₃ потоков с помощью других средств, например, путем модуляции аквапорин деятельности (подробнее см ^13).

Д.И. также полезно для захвата относительно быстрых изменений в связи с притоком питательных сдвигов, или с применением фармакологических агентов. Например, Рисунок 2 подчеркивается быстрое пластичности ⁺ системы K -uptake в корнях интактных проростков ячменя, выращенных при умеренной (0,1 ммоль) -K ⁺ и высокой (10 мм) -NH ₄ ⁺ условия. Здесь мы наблюдали ~ 350% увеличение K ⁺ притока в течение 5 мин NH ₄ ⁺ выходе из внешнего раствора. Этот "эффект отмены аммония" ("AWE") было установлено, что чувствительны к K ⁺ канальные блокаторы тетраэтиламмоний (TEA ^+), бария (Ba ^{2 +)} и цезия (Cs ^+). Использование DI и электрофизиологические измерения в нескольких Arabidopsis генотипов, мы смогли окончательно приписывают подавляющего большинства AWE к изменениям в деятельности канала Arabidopsis К ^+, AtAKT1 и высоким сродством K ⁺ транспортера, AtHAK5 ^14.

Фигура 3 участка стационарный истечения ⁴² K ^+, с течением времени, от корней предварительно помечены саженцев ячменя, выращенных при низкой (0,1 мм) K ⁺ и умеренный (1 мм) Нет ₃ ^-. Эти следы показать, как метод CATE может выявить быстрые и значительные изменения в оттоке по заявкам различных фармакологических / питательных веществ. Существенное, немедленное торможение K ⁺ оттока наблюдалось на любом приложении 10 мМ Cs ^+, в K ⁺ двухканальному блокатор, или резкого повышенияВ K ⁺ положения (от 0,1 до 10 мм). Эти результаты согласуются с молекулярной исследований, описывающих уникальные свойства стробирования наружу выпрямления К ⁺ каналов _^15. В отличие от этого, применение 10 мМ NH ₄ ⁺ быстро и сильно стимулировали отток К ^+. Этот эффект может быть связано с активацией наружу выпрямительных К ⁺ каналов с помощью деполяризации электрического градиента потенциала через плазматическую мембрану клеток корня ^16, которые, как известно, происходит при введении NH ₄ ^{+ 17.} Таким образом, с помощью этого метода, мы смогли продемонстрировать, в Планта, что K ⁺ каналы посредником K ⁺ отток в корнях ячменя ^10.

Наконец, Таблица 1 показывает параметры Кейт извлеченные из измерений стационарном ⁴² K ⁺ из клетки ([K ^+] _доб = 0,1 мм) в ячменного семениLings выращиваются либо с 1 мМ NO ₃ ^- или 10 мм NH ₄ ^+, причем последний будет представлять токсичное сценарий. Высокая NH ₄ ⁺ состояние приводит к подавлению всех K ⁺ потоков, и значительным снижением цитозольным концентрации К ⁺ ([K ^+] _цит), который обычно гомеостатически поддерживается на ~ 100 мм под здоровых условий роста ¹⁸ (как это наблюдается , например, в таблице 1, при NO ₃ ^{- поставка).}

Рисунок 1 ¹³ NH ₃ приток изотермы показывают, как K ⁺ питания регулирует транспорт азота. NH ₃ приток как функция изменения внешних концентрации NH _{3 ([NH 3] EXT) в интактных корней проростков ячменя, выращенных при высокой (10 мм) NH 3 / NH 4 ⁺ и либо низкой (0,02 мМ, красный) или высокой (5 мМ, синий) К ^+. Михаэлис-Ментен анализ изотерм показывают, что предоставление высокого K ⁺ имеет относительно небольшое влияние на подложки близости (т.е. К М) NH 3 -uptake перевозчиков, но значительно снижает транспортные мощности (т.е., V макс, см "Представитель Результаты '). Примечание, изменения в [NH 3] доб были созданы путем сдвига внешней рН раствора с помощью NaOH, и, таким образом NH 3: ⁺ отношения NH 4, в соответствии с уравнением Хендерсона-Hasselbalch. Столбики ошибок указывают СЭМ 4-7 повторяет. (Воспроизводится по Coskun соавт. Rapid газообразный аммиак транспорт приходится тщетной трансмембранного велосипеде под NH 3 / NH 4 ⁺ токсичность в корнях растений. Физиология растений. 163, 1859-1867 (2013).)}

Рисунок 2 NH ⁺ ₄ вывода значительно стимулирует канала опосредованного K ⁺ приток. Приток К ⁺ в стационарном состоянии, и при выводе NH ₄ ^+, в корни интактных проростков ячменя, выращенных при низкой (0,1 мм) K ⁺ и высокой (10 мМ) NH ₄ ^+. Эффект K ⁺ канальных блокаторов (10 мм чай ^+, 5 мМ Ba ^{2 +,} и 10 мМ Cs ⁺⁾ на вынужденное K ⁺ притоком произносится. Звездочки означают различные уровни значимости между -NH ₄ ⁺ и лечению пар (* 0.01 <Р <0,05, *** р <0,001; односторонним ANOVA с множественного сравнения Даннета после специальныхтест). Звездочки в скобках обозначает уровень значимости между контролем и -NH ₄ ⁺ пары (Стьюдента -теста). Столбики ошибок указывают СЭМ> 4 повторах. (Воспроизводится по Coskun др. Емкость и пластичности калиевых каналов и высоким сродством перевозчиков в корнях ячменя и арабидопсиса. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)

Рисунок 3 K ⁺ из клетки является канал опосредованного под-K низких ⁺ стационарных условиях ⁴² K ⁺ отток в корнях интактных проростков ячменя, выращенных при низкой (0,1 мм) K ⁺ и умеренный (1 мм) Нет ₃ ^-., И непосредственное воздействие (при Т = 15,5 мин; стрелка) из 10 мМ CsCl, 5 мМ K ₂ SO4, и 5 мМ (NH _{4) 2} SO ₄ на оттока. Каждый участок представляет собой среднее 3-13 повторов (СЭМ <15% от среднего значения). (Воспроизводится по Coskun др регулированию и механизма высвобождения калия из корней ячменя:.. Письмо в Планта ⁴² K ⁺ анализ новых фитол 188, 1028-1038 (2010)..)

Таблица 1 Стационарная K ⁺ потоки и сompartmentation под различными положениями N стационарный поток и на отсеки анализ ячменя выросла на 0,1 ммоль K ^+, и либо умеренное NO ₃ ^-. (1 мМ, как Ca ²⁺ соли) или высокой NH ₄ ⁺ (10 мМ, как SO ₄ ^2-соль). Ошибки указывают ± SEM из> 8 повторов. (Воспроизводится по Coskun др регулированию и механизма высвобождения калия из корней ячменя:.. Письмо в Планта ⁴² K ⁺ анализ новых фитол 188, 1028-1038 (2010) и Coskun др Объем и пластичность калиевых каналов и высокой.. сродства транспортеры в корнях ячменя и арабидопсиса. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)

Как показано в приведенных выше примерах, метод радиотрейсера является мощным средством измерения однонаправленных потоков питательных веществ и токсикантов в Планта. Рисунок 1 показывает, что NH ₃ приток может достигать свыше 225 мкмоль г ^-1 ч ^-1, которая является, пожалуй, высокая Bona поток ФИДЕ трансмембранный не сообщалось в системе растений ^13, но величина этого потока не было бы видно, если только чистые потоки были измерены. Это потому, что большое истечение NH ₃ происходит в то же самое время, что и притока, в бесполезной случае на велосипеде, что может привести к выраженной недооценке, что увеличивает приток со временем маркировки ^13. Дополняя технику трассирующими с электрофизиологического анализа, мы смогли показать, что в условиях рисунке 1, как приток и отток ¹³ N, прежде всего, из нейтрального газа NH _3, а не его conjugели кислоты NH ₄ ⁺ (подробнее см ^13). Это первый в Планта демонстрации быстрых потоков NH ₃ газа в корнях, и как таковой, предоставляет важную предварительные доказательства к разгадке транспортный механизм, который лежит в основе NH ₃ / NH ₄ ⁺ токсичность высших растений ^2,13. Молекулярная работа в гетерологичных системах экспрессии показал, что NH ₃ может течь через аквапоринов в растениях ^19, и данные из рисунка 1, наряду с недавним фармакологической данных, начала, чтобы подтвердить такие выводы на уровне в здоровом организме ^13.

На рисунках 2 и 3 также предоставляют прекрасные примеры полезности измерения однонаправленных потоков с радиоактивных индикаторов. Использование DI с ⁴² K ^+, мы смогли продемонстрировать, что ионные каналы не несет ответственности за стационарном K ⁺ поглощение в корни проростков ячменя, выращенных при низкой K ⁺ и высокой NH ₄ ^+, в отличие от модельной системе Arabidopsis ^14. Только тогда, когда NH ₄ ⁺ был снят сделал мы видим доказательства для привлечения К ⁺ каналов (Рисунок 2). Хотя чистый поток К ⁺ также стимулируется NH ₄ ⁺ вывода (как показано увеличением ткани K ⁺ содержанием ^14), только путем измерения однонаправленной приток мы смогли выявить величину и быстрое начало этого явления. Кроме того, путем проведения измерений DI с мутантами и фармакологических агентов, мы смогли определить, какие транспортные белки были вовлечены. Аналогично, применяя в питании и фармакологических агентов при мониторинге трассирующими отток (рисунок 3), мы смогли охарактеризовать и определить механизмы K ⁺ оттока из корневых ячмень ячеек ^10. Таким образом, методы, такие как дии CATE может сыграть важную роль в понимании транспортных характеристик для критического макро-.

Как отмечено в протоколе, часто позиция образца относительно детектора в гамма-счетчике может влиять на количество излучения, измеренный. Таким образом, если 1-мл образец "пополнен" с 19 мл H ₂ O, графы измеренные (CPM) в 20-мл образца может быть значительно ниже, чем в 1-мл образца, несмотря на наличие такого же количества из РФП. Таким образом, D _F могут быть применены для коррекции этого очевидного 'разбавления' радиоактивности. Этот вопрос часто прямо не указано производителями приборов для обнаружения и должны быть выработаны по отдельным исследователем. Аналогично, эффективность экранирования в детекторов против окружающего излучения (т.е. от близлежащих образцов в пределах счетчика) может быть преувеличена производителей, и такие вопросы должны быть разработаныдля отдельных измерительных систем.

Основным преимуществом метода меченых атомов является его неинвазивность, который предоставляет средства для измерения потоков, внутриклеточные размеры пула, и обменные курсы, в стационарных условиях. Например, с ЗАТО, мы могли неинвазивного количественного цитозольные концентрации K ⁺ (Таблица 1). Это может быть предпочтительным, чтобы альтернативных методов, таких как сажание на кол клеток с ионоселективных микроэлектродов ^18, что придает физические и химические помехи, возможно, в клетку. Кроме того, радиоизотопный метод уникален тем, что он обеспечивает всестороннее представление о потоках и раздробленности для целых органов и целые растения. Это важно, если человек заинтересован в понимании динамики питательных вся-растений, токсичность, и в конечном итоге, производительность в этой области. Наконец, радиоиндикаторные метод позволяет очень чувствительные измерения должны проводиться при довольно высоких концентрациях субстрата. Tradiные эксперименты с износом и методы микроэлектрода могут возникнуть проблемы фоновой помехи и, таким образом, может потребовать, чтобы внешний концентрации субстрата интереса опускается значительно ниже, чем при условии, во время роста. Это может быть проблематичным, если человек заинтересован в изучении "стационарные" условия высоких концентрациях субстрата (например, с NH ₃ / NH ₄ ⁺ токсичности или "высокие-K ^+" условиях; смотри выше).

Следует отметить, что, как и все методы, измерения потоков с радиоактивных индикаторов не без его ограничения. Например, наличие радиоактивных индикаторов может быть проблематичным, особенно для очень короткоживущих изотопов, как ¹³ N, которые требуют непосредственной близости от производственного объекта, такие как циклотрона. Другим важным ограничением является то, что время от времени, это может быть трудно провести различие между потоками, которые происходят через мембраны и те, которые происходят extracellularly. Такие различия требуют строгий фаза тестирования ^7,10,20. В случае K ⁺ оттока, только после тщательного изучения мы смогли подтвердить, что стационарные ⁴² K ⁺ освобождение от корней происходило не через клеточные мембраны при высоких [K ^+] _доб (> 1 мм) ^10, но с внеклеточной пространства (см, рис 3). Такие вопросы могут быть решены путем изучения влияния широкого спектра фармакологических агентов, или через термодинамических анализов, которые показали, например, что очень высокие потоки Na ⁺ сообщили в условиях засоления бы энергетически нецелесообразным были они, чтобы перейти через клеточные мембраны ^21,22.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).