Flussi di minerali nutrienti e sostanze tossiche in misura Piante con traccianti radioattivi

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

L'assorbimento e la distribuzione di nutrienti e sostanze tossiche influenzano fortemente la crescita delle piante. Di conseguenza, l'indagine dei processi di trasporto sottostanti costituisce un'importante area di ricerca in biologia vegetale e scienze agrarie ^1,2, soprattutto nei contesti di ottimizzazione nutrizionale e stress ambientali (ad esempio, stress salino, la tossicità di ammonio). Primo fra i metodi per la misurazione dei flussi nelle piante è l'uso di traccianti radioisotopici, che è stato sviluppato in modo significativo nel 1950 (si veda ad esempio, ³⁾ e continua ad essere ampiamente usato oggi. Altri metodi, come la misurazione di esaurimento degli elementi nutritivi dal mezzo di root e / o l'accumulo nei tessuti, l'uso di microelettrodi vibranti ione-selettivi, come MIFE (microelettrodo ion stima di flusso) e SIET (scansione tecnica elettrodo ione-selettivo), e l'uso di coloranti fluorescenti ione-selettivo, sono anche ampiamente applicati, ma sono limitati nella loro capacità di rilevare l'influenza nettassi (cioè, la differenza tra afflusso e l'efflusso). L'uso di radioisotopi, dall'altro, consente al ricercatore la capacità unica di isolare e quantificare flussi unidirezionali, che può essere utilizzato per risolvere parametri cinetici (ad esempio, K _M e V _max), e fornire una conoscenza della capacità, energetica, meccanismi e regolazione, dei sistemi di trasporto. Misure di flusso unidirezionali realizzati con radiotraccianti sono particolarmente utili in condizioni in cui il flusso nella direzione opposta è alto, e il fatturato delle piscine intracellulari è rapida ^4. Inoltre, i metodi radiotracciante consentono misurazioni condotte sotto concentrazioni piuttosto elevate di substrato, a differenza di molte altre tecniche (vedi 'Discussione', qui di seguito), perché l'isotopo tracciato si osserva su uno sfondo di un altro isotopo dello stesso elemento.

Qui, forniamo la procedura dettagliata per la misurazione di radioisotopi unidirezionale e net flussi di nutrienti minerali e di sostanze tossiche nelle piante intatte. L'accento verrà effettuato sulla misurazione del flusso di potassio (K ^+), un impianto di macronutrienti ^5, e ammoniaca / ammonio (NH ₃ / NH ₄ ^+), un'altra macronutrienti che è, tuttavia, tossici se presenti a concentrazioni elevate (ad esempio, 1- 10 mM) ^2. Useremo i radioisotopi ⁴² K ⁺ (t _mezzo = 12.36 ore) e ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ⁺ (t _1/2 = 9,98 min), rispettivamente in piantine intatte del orzo sistema modello (Hordeum vulgare L .), nella descrizione dei due protocolli principali: afflusso diretta (DI) e l'analisi compartimentale da tracciante efflusso (CATE). Dobbiamo notare fin dall'inizio che questo articolo descrive semplicemente i passaggi necessari per eseguire ogni protocollo da. Se del caso, brevi spiegazioni dei calcoli e la teoria sono forniti, ma dettagliate esposizioni di ogni tecnica'S sfondo e la teoria si possono trovare in diversi articoli importanti sull'argomento ^4,6-9. È importante sottolineare che questi protocolli sono ampiamente trasferibili ad flux analisi di altri nutrienti / sostanze tossiche (ad esempio, ²⁴ Na ^{+, 22} Na ^+, Rb ^{+ 86, 13} NO ₃ ^-) e di altre specie di piante, anche se con qualche distinguo (vedi sotto) . Sottolineiamo inoltre l'importanza che tutti i ricercatori che lavorano con materiali radioattivi devono lavorare sotto una licenza organizzato tramite ionizzanti regolatore di sicurezza di radiazione della loro istituzione.

1. coltura delle piante e preparazione

1. Crescere piante di orzo idroponica per 7 giorni in una camera di crescita a clima controllato (per i dettagli, vedi ^10).
   NOTA: E 'importante considerare l'esame di piante in una varietà di fasi di sviluppo, come esigenze nutrizionali cambiano con l'età.
2. Un giorno prima della sperimentazione, raggruppare diverse piantine insieme per fare una singola replica (3 piante per pacco per DI, 6 piante per pacco per CATE). Piantine Bundle avvolgendo un 2-cm pezzo di tubo Tygon attorno alla porzione basale dei germogli, e assicurare il tubo con del nastro adesivo per creare un "collare".
   NOTA: Il numero di piante per pacco può variare in base alle condizioni sperimentali ^10,13,14. Bundle viene fatto per migliorare le statistiche e precisione di misura, in particolare quando la massa radicale e / o attività specifica sono bassi.

2 Preparazione di Sperimentali Soluzioni / Materiali

1. Per la DI, raccogliere le seguenti: Pre-etichettatura, etichettatura e soluzioni di desorbimento (per i dettagli, vedi ^11), tubi di centrifugazione (per spin-essiccazione di campioni vegetali), e vial di campioni (per materiale vegetale e l'attività specifica [S _o; vedi sotto]). Aerare e mescolare tutte le soluzioni.
2. Per CATE, raccogliere le seguenti: soluzioni ben mescolato, etichettatura aerata e di eluizione (per i dettagli, vedi ^10), imbuti, tubi di efflusso centrifugazione (per spin-essiccazione di campioni vegetali), e fiale di campioni (per eluati, campioni vegetali, e determinazione di S _o fattore di diluizione e [D _f; vedere sotto]).

3 Preparare radiotracciante

ATTENZIONE: Le seguenti operazioni di sicurezza dovrebbero essere prese prima di lavorare con la radioattività.

1. Assicurarsi che i requisiti del radioactiva licenza materiali sono compresi e seguiti. Indossare un equipaggiamento di sicurezza (ad esempio, occhiali, guanti, camice da laboratorio, piombo maglia / collare) e dosimetri (ad esempio, l'anello TLD e distintivo). Impostazione di schermatura (cioè, plexiglas e mattoni di piombo) e svolgere un lavoro radioattivo dietro. Assicurarsi che un contatore Geiger-Müller è presente al fine di monitorare regolarmente per contaminazione.
2. Preparazione di ⁴² K ⁺
   1. Porre un bicchiere pulito e asciutto sulla bilancia. Azzerare la bilancia.
   2. Rimuovere fiala di tracciante (20 mCi di ⁴² K ₂ CO _3, in forma di polvere) dalla confezione e versare tracciante nel becher. Prendere nota della massa.
   3. Pipettare 19.93 ml di dH ₂ O, seguita da 0,07 ml di H ₂ SO _4, nel bicchiere. Questo guiderà la seguente reazione chimica:
      ⁴² K ₂ CO ₃ (S) + H ₂ SO ₄ (l) + H ₂ O (l) → ⁴² K ₂ SO ₄ (L) + CO ₂ (v) + 2H ₂ O (l)
   4. Calcolare la concentrazione della soluzione madre radioattivi, data la massa e il peso molecolare di K ₂ CO _3, e il volume (20 ml).
      NOTA: Se si lavora con ¹³ NH ^_3/13 NH ₄ ⁺ Il tracciante è prodotto in un ciclotrone mediante il bombardamento protone dell'atomo di ossigeno di acqua (tipicamente conseguente 100-200 mCi di attività, per dettagli di produzione, vedere ^12). Poiché la quantità di ¹⁴ NH ^_3/14 NH ₄ ⁺ è estremamente bassa in queste soluzioni, la concentrazione N della soluzione madre è trascurabile.

4 Afflusso diretta (DI) di misura

1. Per ⁴² K ^+, pipettare quantità di soluzione madre radioattivo necessario per raggiungere la concentrazione finale desiderata di K ⁺ nella soluzione di etichettatura.
   1. Per ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ^+, pipetta una piccola quantità (<0,5 ml) nella soluzione di etichettatura. Lasciare che la soluzione di etichettatura a mescolare bene (con aerazione).
2. Pipettare un sotto-campione di 1 ml di soluzione di etichettatura in una provetta e ripetere tre volte (4 campioni in totale).
   1. Misurare la radioattività in flaconcini (in "conteggi per minuto", CPM), utilizzando un contatore gamma. Verificare che il contatore è programmato in modo tale che le letture CPM sono corretti per il decadimento isotopico (questo è particolarmente importante per tali traccianti di breve durata).
   2. Calcola S _o (espressa come cpm mol ^-1), facendo la media dei conteggi dei quattro campioni (CPM ml ^-1) e dividendo per la concentrazione di substrato in soluzione (mmol ml ^-1).
3. Immergere le radici in pre-etichettatura soluzione (non radioattivo) per 5 minuti, a pre-equilibrare le piante in condizioni di prova (vediad esempio, ^10,13,14 per variazioni nel tempo di pre-label).
4. Immergere radici nella soluzione di etichettatura (radioattiva) per 5 min.
   NOTA: i tempi di etichettatura possono variare in base esperimento ^3,4,7-10.
5. Trasferire le radici di soluzione desorbimento per 5 secondi per rimuovere la maggior parte della radioattività-aderente di superficie. Trasferire le radici in un secondo bicchiere di soluzione di desorbimento per 5 minuti a ulteriori chiare radici del tracciante extracellulare.
6. Sezionare e germogli separati, germogli basali e radici.
7. Mettere radici in provette da centrifuga e campioni di spin per 30 secondi in un a bassa velocità, clinico-grade centrifuga (~ 5.000 xg) per rimuovere la superficie e l'acqua interstiziale.
8. Pesare radici (peso fresco, FW).
9. Contare la radioattività in campioni di piante (sparare, sparare basale, e la radice; vedere il punto 4.2.1).
10. Calcolare il flusso. Calcolare afflusso nella pianta utilizzando la formula
    Φ = Q * / S _o WT _L
    dove Φ è il flusso(G mol ^-1 h ^-1), Q * è la quantità di tracciante accumulata nei tessuti (cpm, di solito in radice, sparare e sparare basale, combinato), S _o è l'attività specifica della soluzione di etichettatura (cpm micromol ^{- 1),} w è il peso fresco radice (g), e _L t è il tempo di etichettatura (hr).
    NOTA: il calcolo più sofisticato può essere fatto per tenere conto di simultanea tracciante efflusso dalle radici durante l'etichettatura e desorbimento, in base ai parametri ottenuti da CATE (vedi sotto, per maggiori dettagli, vedi ^4).

5. Compartimentale Analisi per Tracer Efflux (CATE) Misurazione

1. Preparare la soluzione di etichettatura e misura S _o (vedere i punti 4,1-4,2, sopra).
2. Misura fattore di diluizione (D _f).
   NOTA: Spesso, la posizione del campione rispetto al rivelatore nel contatore gamma può influenzare la quantitàdi radiazione misurata. Vedi di discussione per i dettagli.
   1. Dopo aver misurato S _o, aggiungere 19 ml di H ₂ O per ogni campione (tale che il volume finale = volume eluito = 20 ml). Conteggio della radioattività in ogni campione da 20 ml (vedere il punto 4.2.1).
   2. Calcolare D _f dividendo il cpm medio dei campioni 1 ml dalla cpm media dei campioni di 20 ml.
3. Immergere radici nella soluzione di etichettatura per 1 ora.
4. Rimuovere le piante da soluzione di etichettatura e di trasferimento piante per efflusso imbuto, assicurando tutto il materiale principale è dentro l'imbuto. Delicatamente piante protetta a lato della efflusso imbuto applicando una piccola striscia di nastro adesivo sopra il collare di plastica.
5. Versare delicatamente il primo eluato nell'imbuto. Avviare il timer (contando verso l'alto).
6. Aprire il rubinetto e raccogliere l'eluato nel flaconcino campione dopo 15 sec (nota: tempo di eluizione può variare, vedi sotto). Chiudere il rubinetto. Versare delicatamente il prossimo eluato nell'imbuto.
7. Ripett passo 5.6 per il resto della serie eluizione, che segue, dal primo al eluato finale: 15 sec (quattro volte), 20 sec (tre volte), 30 sec (due volte), 40 sec (una volta), 50 sec (una volta), 1 min (25 volte), per un periodo di eluizione totale di 29,5 min
   NOTA: serie desorbimento può variare in base alle condizioni sperimentali ^7-10,13,14.
8. Una volta che il protocollo eluizione è completo, piante raccolta (passi 4,6-4,8, sopra).
9. Contare la radioattività in eluati e campioni vegetali in gamma counter (moltiplicando la lettura per ciascun eluato da D _f, vedi 5.2).
10. Rilascio della trama tracciante (cpm g (radice FW) ^-1 min ^-1) in funzione del tempo di eluizione. Per le condizioni di stato stazionario, eseguire regressioni lineari e calcoli di flussi, emivite di scambio, e le dimensioni della piscina (per i dettagli, vedere ^6-9).

La figura 1 mostra isoterme trovati con la tecnica DI (con ¹³ N), per l'afflusso di NH ₃ in radici di piante di orzo coltivate intatte ad alta (10 mm) NH ₄ ^+, e sia bassa (0,02 mm) o alto (5 mM ) K ^+. Le isoterme mostrano cinetica di Michaelis-Menten quando NH ₃ flussi sono riportati in grafico in funzione della concentrazione esterna NH ₃ ([NH _{3] ext;} rettificato dalla variazione del pH della soluzione ^13). NH ₃ flussi erano significativamente più alti a basso K ⁺ rispetto ad alto K ^+. Analisi dei parametri cinetici Michaelis-Menten ha mostrato che la K _M rimasto relativamente stabile tra i livelli di K ⁺ (150 vs 90 μ M a basso ed alto K ^+, rispettivamente), mentre la V _max è fortemente ridotta a ⁺ (205 vs alto K 80 g mol ^-1 h ^-1). Pertanto, i dati indicano che il livello K ⁺ regulates trasporto di azoto (effetto _max V), ma non dalla concorrenza diretta tra K ⁺ e NH ₃ per i siti di legame trasportatori (effetto K _M). Piuttosto, K ⁺ può disciplinare NH ₃ fondenti con altri mezzi, come ad esempio attraverso la modulazione dell'attività aquaporin (per i dettagli, vedi ^13).

DI è anche utile per il rilevamento delle variazioni relativamente veloci in afflusso causa di cambiamenti nutrizionali, o per l'applicazione di agenti farmacologici. Ad esempio, la Figura 2 evidenzia la rapida plasticità del sistema K ⁺ -uptake in radici di piante di orzo coltivate intatte a moderata (0,1 mm) -K ⁺ e alta (10 mm) -NH ₄ ⁺ condizioni. Qui, abbiamo osservato un aumento del ~ 350% in K ⁺ afflusso entro 5 minuti di recesso NH ₄ ⁺ dalla soluzione esterna. Questo "effetto di ammonio ritiro" ("AWE") è risultato essere sensibile al K ⁺ -canale bloccanti tetraetilammonio (TEA ^+), bario (Ba ^{2 +),} e il cesio (Cs ^+). Utilizzo di DI e misurazioni elettrofisiologiche in diversi genotipi di Arabidopsis, siamo stati in grado di attribuire definitivamente la stragrande maggioranza della AWE ai cambiamenti nelle attività del canale di Arabidopsis K ^+, AtAKT1, e ad alta affinità K ⁺ trasportatore, AtHAK5 ^14.

Figura 3 trame l'efflusso steady-state di ⁴² K ^+, nel corso del tempo, dalle radici di piante di orzo pre-etichettati coltivati ​​a bassa (0,1 mm) K ⁺ e moderata (1 mM) NO ₃ ^-. Queste tracce mostrano come il metodo CATE può rivelare cambiamenti rapidi e significativi nella efflusso su domanda di vari agenti farmacologici / nutrizionali. Sostanziale, l'inibizione immediata della K ⁺ efflusso è stato osservato dopo tanto ad una domanda di 10 mm Cs ^+, K ⁺ -canale, o un forte incrementoin K ⁺ disposizione (da 0,1 a 10 mM). Questi risultati sono coerenti con gli studi molecolari che descrivono le proprietà di gating uniche di andata-rettifica K ⁺ canali _^15. Per contro, l'applicazione di 10 mM NH ₄ ⁺ rapidamente e fortemente stimolato K ⁺ efflusso. Questo effetto può essere spiegato con l'attivazione di ⁺ canali verso l'esterno rettifica K tramite depolarizzazione del gradiente di potenziale elettrico attraverso la membrana plasmatica delle cellule radicali ^16, che è noto a verificarsi introduzione di NH ₄ ^{+ 17.} Così, con questo metodo, siamo stati in grado di dimostrare, in planta, che i canali K ⁺ K ⁺ mediano efflusso in radici di orzo ^10.

Infine, tabella 1 mostra i parametri CATE estratti da misure di steady-state ⁴² K ⁺ efflusso ([K ^+] _ext = 0,1 mm) nelle sementi di orzolings coltivate sia con 1 mM NO ₃ ^- o NH 10 mm ₄ ^+, questi ultimi rappresentano uno scenario tossico. L'alta NH ₄ ⁺ condizione determina una soppressione di tutti i K ⁺ flussi, e un calo significativo K ⁺ citosolico concentrazione ([K ^+] _cit), che è normalmente omeostaticamente mantenuta a ~ 100 mm sotto condizioni di crescita sani ¹⁸ (come osservato , ad esempio, in Tabella 1, sotto NO ₃ ^- fornitura).

Figura 1 ¹³ NH ₃ isoterme afflusso rivelano come K ⁺ alimentazione regola il trasporto di azoto. NH ₃ afflusso in funzione di concentrazioni variabili esterne di NH _{3 ([NH 3] ext) nelle radici intatte di piante di orzo coltivate ad alta (10 mm) NH 3 / NH 4 ⁺ e una bassa (0,02 mm, rosso) o alto (5 mM, blu) K ^+. Michaelis-Menten analisi delle isoterme di rivelare tale disposizione high-K ⁺ ha relativamente poco effetto sulla affinità substrato (ad esempio, K M) di NH 3 -uptake trasportatori, ma riduce in modo significativo la capacità di trasporto (ad esempio, V max, vedere "Rappresentante dei risultati '). Nota, cambiamenti nella [NH 3] ext sono stati istituiti spostando il pH della soluzione esterna con NaOH, e quindi i NH 3: ⁺ rapporti NH 4, secondo l'equazione di Henderson-Hasselbalch. Le barre di errore indicano SEM di 4-7 replica. (Tratto da Coskun et al. Conti di trasporto del gas ammoniaca rapidi per futili transmembrana ciclismo in NH 3 / NH 4 ⁺ tossicità nelle radici delle piante. Pianta Physiol. 163, 1859-1867 (2013).)}

Figura 2 NH ₄ ⁺ ritiro stimola significativamente canale K-mediata ⁺ afflusso. K ⁺ afflusso allo stato stazionario, e fino alla revoca di NH ₄ ^+, in radici di piante di orzo coltivate intatte a bassa (0,1 mm) K ⁺ e alta (10 mM) NH ₄ ^+. L'effetto di K ⁺ -canale bloccanti (10 mM TEA ^+, 5 mM Ba ^{2 +,} e 10 mM Cs ⁺⁾ sul stimolato K ⁺ afflusso è pronunciata. Gli asterischi indicano diversi livelli di significatività tra -NH ₄ ⁺ e trattamento coppie (* 0,01

4 ⁺ coppia (Student t-test). Le barre di errore indicano SEM di> 4 repliche. (Tratto da Coskun et al. Capacità e plasticità dei canali del potassio e trasportatori ad alta affinità in radici di orzo e di Arabidopsis. Physiol pianta. 162, 496-511 (2013).)

Figura 3 K ⁺ efflusso è il canale-mediata sotto-K ⁺ basse condizioni di steady-state ⁴² K ⁺ efflusso in radici di piante di orzo coltivate intatte a bassa (0,1 mm) K ⁺ e moderata (1 mM) NO ₃ ^-., E gli effetti immediati (a t = 15,5 min; vedi freccia) di CsCl 10 mm, 5 mm K ₂ SO4, e 5 mm (NH _{4) 2} SO ₄ su efflusso. Ogni trama rappresenta la media di 3-13 ripetizioni (SEM <15% della media). (Tratto da Coskun regolamento e il meccanismo di rilascio di potassio da radici di orzo et al:.. L'in planta ⁴² K ⁺ analisi New Phytol 188, 1028-1038 (2010)..)

Tabella 1 allo stato stazionario K ⁺ flussi e compartmentation sotto varie disposizioni N flusso steady-state e l'analisi compartimentale piante di orzo coltivate a 0.1 mM K ^+, e sia moderato NO ₃ ^-. (1 mM, come Ca ^{2 +} sale) o ad alta NH ₄ ⁺ (10 mM, come SO ₄ ² sale). Gli errori indicano ± SEM di> 8 repliche. (Tratto da Coskun regolamento e il meccanismo di rilascio di potassio da radici di orzo et al:.. L'in planta ⁴² K ⁺ analisi New Phytol 188, 1028-1038 (2010) e Coskun et al Capacità e plasticità dei canali del potassio e alta.. trasportatori affinità in radici di orzo e di Arabidopsis. Physiol pianta. 162, 496-511 (2013).)

Come dimostrato negli esempi precedenti, il metodo radiofarmaco è un potente mezzo di misurare flussi unidirezionali di nutrienti e sostanze tossiche in planta. Figura 1 mostra che NH ₃ afflusso può raggiungere superiore a 225 micromol g ^-1 h ^-1, che è forse la più alto bona fide flusso transmembrana mai riportato in un sistema impiantistico ^13, ma la grandezza di questo flusso non sarebbe visibile se sono stati misurati solo i flussi netti. Questo perché una grande efflusso di NH ₃ avviene contemporaneamente come afflusso, in uno scenario ciclismo inutile che può risultare in una sottostima pronunciato di afflusso che aumenta con il tempo di etichettatura ^13. Integrando la tecnica tracciante con l'analisi elettrofisiologica, siamo stati in grado di dimostrare che, nelle condizioni di figura 1, sia afflusso ed efflusso di ¹³ N è principalmente del gas neutro NH _3, e non di sua Conjugmangiato acido NH ₄ ⁺ (per i dettagli, vedi ^13). Questa è la prima dimostrazione in planta di flussi rapidi NH ₃ di gas nelle radici, e, come tale, fornisce importanti prove preliminari verso svelare il meccanismo di trasporto che si trova nel cuore di NH ₃ / NH ₄ ⁺ tossicità nelle piante superiori ^2,13. Lavoro molecolare in sistemi di espressione eterologhi ha dimostrato che NH ₃ può fluire attraverso acquaporine nelle piante ^19, ei dati di Figura 1, insieme a recenti prove farmacologiche, ha iniziato a corroborare tali risultati a livello dell'organismo intatto ^13.

Figure 2 e 3 forniscono anche ottimi esempi di utilità di misurare flussi unidirezionali con radiotraccianti. Utilizzo DI con ⁴² K ^+, siamo stati in grado di dimostrare che i canali di ioni non sono responsabili per stato stazionario K ⁺ assorbimento nelle radici di piante di orzo coltivate a basso K ⁺ e alta NH ₄ ^+, in contrasto con il sistema modello Arabidopsis ^14. Solo quando NH ₄ ⁺ è stato ritirato fatto che vediamo la prova per l'impegno di canali K ⁺ (Figura 2). Anche se il flusso netto di K ⁺ è anche stimolata da NH ₄ ⁺ ritiro (come indicato da un aumento del tessuto K ⁺ contenuti ^14), solo misurando flusso unidirezionale dove abbiamo potuto rivelare l'entità e la rapida insorgenza di questo fenomeno. Inoltre, effettuando misurazioni DI con mutanti e agenti farmacologici, siamo stati in grado di identificare quali proteine ​​di trasporto sono stati coinvolti. Allo stesso modo, applicando agenti nutrizionali e farmacologici durante il monitoraggio tracciante efflusso (Figura 3), siamo stati in grado di caratterizzare e identificare i meccanismi di efflusso K ⁺ dalle cellule della radice orzo ^10. Così, tecniche come DICATE e può essere strumentale alla comprensione delle caratteristiche di trasporto per una macronutrienti critica.

Come indicato nel protocollo, spesso la posizione del campione rispetto al rivelatore nel contatore gamma può influenzare la quantità di radiazione misurata. Quindi, se un campione di 1 ml viene "riempito" con 19 ml di H ₂ O, i conteggi misurati (cpm) nel campione da 20 ml può essere significativamente inferiore rispetto al campione di 1 ml, pur avendo la stessa quantità di radiofarmaco. Pertanto, un D _f può essere applicato per correggere questa apparente 'diluizione' di radioattività. Questo problema è spesso non esplicitamente dichiarato dai produttori di strumenti di rilevazione e deve essere elaborato dal ricercatore individuale. Allo stesso modo, l'efficacia della schermatura all'interno di rilevatori contro radiazioni ambientali (ad esempio, da campioni vicine all'interno del contatore) può essere esagerato dai produttori, e tali questioni dovrebbero essere lavoratoper sistemi di misura individuali.

Uno dei principali vantaggi della tecnica tracciante è la sua non-invasività, che fornisce un mezzo per misurare i flussi, dimensioni piscina intracellulari, e tassi di cambio, in condizioni di steady-state. Ad esempio, con CATE, potremmo non invasivo quantificare le concentrazioni citosoliche di K ⁺ (Tabella 1). Questo può essere preferibile metodi alternativi come impalement di cellule con microelettrodi ionoselettivi ^18, che conferisce disturbi fisici e chimici eventualmente alla cella. Inoltre, la tecnica tracciante è unico in quanto fornisce una visione globale dei flussi e compartimentazione per gli organi interi e piante intatti. Questo è importante se si è interessati a comprendere le dinamiche dei nutrienti intero impianto, tossicità, e in ultima analisi, le prestazioni sul campo. Infine, i metodi radiotracciante permette di misurazioni molto sensibili a venire condotte in concentrazioni piuttosto elevate di substrato. Tradiesperimenti esaurimento nali e tecniche di microelettrodi possono sperimentare problemi di interferenze di fondo e, quindi, possono richiedere che la concentrazione esterna del substrato di interesse si abbassa ben inferiore a quello previsto durante la crescita. Questo potrebbe essere problematico se si è interessati a studiare "steady-state" condizioni di alte concentrazioni di substrato (ad esempio con NH ₃ / NH ₄ ⁺ tossicità o condizioni "high-k ^+", vedi sopra).

Va notato che, come tutte le tecniche, misurando flussi con radiotraccianti non è priva di limitazioni. Ad esempio, la disponibilità di radiotraccianti può essere problematico, in particolare per isotopi molto breve come ¹³ N che richiedono la prossimità di un impianto di produzione come un ciclotrone. Un'altra importante limitazione è che a volte, può essere difficile discriminare tra flussi che si verificano attraverso le membrane e quelle che si verificano extracellularly. Tali distinzioni richiedono test di fase rigorosa ^7,10,20. Nel caso di K ⁺ efflusso, solo dopo un attento esame eravamo in grado di confermare che steady-state ⁴² K ⁺ liberazione dalle radici non era avvenendo attraverso le membrane cellulari ad alta _ext [K ^+] (> 1 mm) ^10, ma da extracellulare spazi (cf, Figura 3). Tali problemi possono essere risolti esaminando l'effetto di una vasta gamma di agenti farmacologici, o attraverso analisi termodinamiche, che hanno dimostrato, per esempio, che flussi molto elevati di Na ⁺ segnalati in condizioni saline sarebbero energeticamente irrealizzabile stavano per procedere attraverso le membrane cellulari ^21,22.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).