Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

A absorção e distribuição dos nutrientes e toxinas influenciar fortemente o crescimento da planta. Assim, a investigação de processos de transporte subjacentes constitui uma importante área de pesquisa em biologia de plantas e ciências agrárias ^1,2, especialmente nos contextos de otimização nutricional e estresse ambiental (por exemplo, estresse salino, a toxicidade de amônio). O chefe entre os métodos para a medição de fluxos em plantas é o uso de traçadores radioisótopos, que foi desenvolvido de forma significativa na década de 1950 (ver, por exemplo, ³⁾ e continua a ser amplamente utilizado hoje. Outros métodos, como a medição de esgotamento dos nutrientes do meio de raiz e / ou acumulação nos tecidos, o uso de microeletrodos vibrando íon-seletivo, tais como Mife (microeletrodos ion estimativa de fluxo) e SIET (varredura técnica do eletrodo íon-seletivo), e uso de corantes fluorescentes íon-seletivo, também são amplamente aplicadas, mas são limitados em sua capacidade de detectar gripe netxes (isto é, a diferença entre o influxo e de efluxo). A utilização de radioisótopos, por outro lado, permite que o investigador a capacidade única para isolar e quantificação dos fluxos unidireccionais, que pode ser usada para resolver os parâmetros cinéticos (por exemplo, K _M e V _max), e fornecer informações sobre a capacidade, energética, mecanismos e regulação, dos sistemas de transporte. Medições de fluxos unidirecionais feitos com radiofármacos são particularmente úteis em condições onde o fluxo na direção oposta é alta, eo volume de negócios de pools intracelulares é rápida ^4. Além disso, métodos de radiofármaco permite que as medições sejam realizadas sob concentrações bastante elevadas de substrato, ao contrário de muitas outras técnicas (ver "Discussão", abaixo), porque o isótopo traçado observa-se contra um fundo de outro isótopo do mesmo elemento.

Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a medição de radioisótopos unidirecional e net fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas intactas. A ênfase será feita na medição de fluxo de potássio (K ^+), um macronutriente planta ^5, e de amoníaco / amónio (NH ₃ / NH ₄ ^+), que é um outro macronutriente, no entanto, tóxicos quando presente em concentrações elevadas (por exemplo, 1 10 mM) ^2. Vamos usar os radioisótopos ⁴² K ⁺ (t = 12,36 _meia hr) e ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ⁺ (t _1/2 = 9,98 min), respectivamente, em plântulas intactas do sistema modelo de cevada (Hordeum vulgare L .), na descrição de dois protocolos principais: influxo directa (DI) e análise compartimental por efluxo do marcador (CATE). Devemos notar desde o início que este artigo simplesmente descreve as etapas necessárias para realizar cada protocolo. Sempre que necessário, breves explicações sobre cálculos e teoria são fornecidos, mas detalhadas exposições de cada técnica'S de fundo e teoria pode ser encontrada em vários artigos importantes sobre o assunto ^4,6-9. É importante ressaltar que estes protocolos são amplamente transferíveis ao fluxo análise de outros nutrientes / tóxicos (por exemplo, ^{24 de} Na ^+, Na ^{+ 22, 86} Rb ^{+, 13} NO ₃ ^-) e outras espécies de plantas, embora com algumas ressalvas (veja abaixo) . Ressaltamos também a importância de que todos os pesquisadores que trabalham com materiais radioativos devem trabalhar sob uma licença organizadas através ionizante regulador de segurança de radiação de sua instituição.

1 Planta Cultura e Preparação

1. A produção de mudas de cevada hidropônico durante 7 dias em câmara de crescimento com clima controlado (para detalhes, ver ^10).
   NOTA: É importante considerar examinando plantas em uma variedade de estágios de desenvolvimento, como as necessidades de nutrientes vai mudar com a idade.
2. Um dia antes da experimentação, agrupar várias mudas em conjunto para fazer uma única repetição (3 unidades por conjunto de DI, 6 plantas por pacote para CATE). Mudas Bundle envolvendo um pedaço de 2 cm de Tygon tubulação ao redor da porção basal dos brotos e proteger a tubulação com fita adesiva para criar um "colar".
   NOTA: O número de plantas por pacote pode variar de acordo com as condições experimentais ^10,13,14. Agrupamento é feito para melhorar as estatísticas e precisão de medição, particularmente quando a massa de raízes e / ou atividade específica são baixos.

2 Preparação das soluções experimentais / Materiais

1. Para DI, reúna as seguintes: Pré-etiquetagem, rotulagem, e soluções de dessorção (para detalhes, ver ^11), tubos de centrifugação (por spin-secagem de amostras de plantas) e frascos de amostra (para material vegetal e atividade específica [S _o; Veja abaixo]). Arejar e misture todas as soluções.
2. Para CATE, reunir os seguintes: soluções, rotulagem aerado bem misturado e de eluição (para detalhes, ver ^10), funis de efluxo, tubos de centrifugação (spin-para secagem de amostras de plantas) e frascos de amostra (para eluatos, amostras de plantas e determinação de _{S o} fator de diluição e [D _f, veja abaixo]).

3 Prepare radiofármaco

ATENÇÃO: Os seguintes passos de segurança devem ser tomadas antes de trabalhar com radioatividade.

1. Certifique-se de que os requisitos da Radioaclicença materiais tiva são entendidas e seguidas. Use equipamento de segurança adequado (ou seja, óculos de proteção, luvas, jaleco, chumbo colete / colar) e dosímetros (por exemplo, anel de TLD e crachá). Configure blindagem (ou seja, Plexiglas e tijolos de chumbo) e realizar o trabalho radioativo por trás dele. Certifique-se de que um contador de Geiger-Muller está presente, a fim de monitorizar por rotina para a contaminação.
2. Preparação de ⁴² K ⁺
   1. Colocar num copo limpo e seco sobre o equilíbrio. Zero o equilíbrio.
   2. Remover o frasco de marcador (20 mCi de ⁴² K ₂ CO _3, em forma de pó), a partir de embalagens e despejar traçador para o copo. Tome nota da massa.
   3. Pipeta 19,93 ml de dH ₂ O, seguido por 0,07 mL de H ₂ SO _4, para o copo. Isto irá conduzir a seguinte reação química:
      ⁴² K ₂ CO ₃ (S) + H ₂ SO ₄ (l) + _H2O (l) ⁴² → K ₂ SO ₄ (L) + _CO2 (v) + 2H ₂ O (l)
   4. Calcula-se a concentração da solução de estoque radioactivo, determinada a massa e o peso molecular de K ₂ CO _3, e o volume (20 ml).
      NOTA: Se estiver trabalhando com ¹³ NH ^_3/13 NH ₄ ⁺ O marcador é produzido em um ciclotrão através do bombardeio de prótons do átomo de oxigênio da água (geralmente resultando em 100-200 atividade mCi, pois detalhes da produção, ver ^12). Porque a quantidade de ¹⁴ NH ^_3/14 NH ₄ ⁺ é extremamente baixo nessas soluções, a concentração de N na solução estoque é negligenciável.

4. Influx direta (DI) Medição

1. Para ⁴² K ^+, pipetar a quantidade de solução de estoque radioactivos necessária para alcançar a concentração final desejada de K ⁺ na solução de marcação.
   1. Para ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ^+, pipeta uma pequena quantidade (<0,5 ml) para a solução de etiquetagem. Permitir que a solução de etiquetagem para misturar bem (via aeração).
2. Pipete 1 mL de uma sub-amostra de solução de etiquetagem para um frasco de amostra e repetir três vezes (quatro amostras no total).
   1. Medir a radioatividade em frascos (em "contagens por minuto", CPM), utilizando um contador gama. Certifique-se de que o contador é programado de modo que as leituras de cpm são corrigidos para o decaimento de isótopos (isto é particularmente importante para estes marcadores de curta duração).
   2. Calcule _o S (expresso como cpm ^mol-1) pela média das contagens das quatro amostras (cpm ml ^-1) e dividindo pela concentração de substrato em solução (mol ml ^-1).
3. Imergir raízes na solução de pré-marcação (não radioactivo) durante 5 minutos, para pré-equilibrar as plantas sob condições de ensaio (verpor exemplo, ^10,13,14 a variações no tempo de pré-etiqueta).
4. Mergulhe raízes na solução de etiquetagem (radioativo) por 5 min.
   OBSERVAÇÃO: O tempo de inscrição podem variar de acordo com experiência ^3,4,7-10.
5. Transferir a solução de dessorção raízes durante 5 segundos para remover a maior parte da radioactividade aderente superfície. Transferir raízes em um segundo recipiente de dessorção solução durante 5 min para as raízes mais claras do traçador extracelular.
6. Dissecar e tiros separados, brotos basais e raízes.
7. Coloque raízes em tubos de centrífuga e amostras de rotação durante 30 segundos em baixa velocidade, clínico-grade centrífuga (~ 5.000 xg) para remover água superficial e intersticial.
8. Pesar raízes (peso fresco, FW).
9. Contagem radioatividade em amostras de plantas (caule, basal e raiz; veja o passo 4.2.1).
10. Calcula-se o fluxo. Calcular o influxo para a planta por meio da fórmula
    Φ = Q * / _{S o} peso _L
    onde o fluxo é Φ(Mmol g ^-1 h ^-1), Q * é a quantidade de traçador acumulada no tecido (cpm, geralmente em raiz, caule e broto basal, combinado), _o S é a atividade específica da solução de etiquetagem (cpm mol ^{- 1),} W é o peso fresco (g), e t é o tempo _L rotulagem (hr).
    NOTA: cálculo mais sofisticado pode ser feito para dar conta de efluxo tracer simultânea das raízes durante a rotulagem e dessorção, com base em parâmetros obtidos a partir CATE (veja abaixo; para detalhes, ver ^4).

5. compartimental Análise por Tracer efluxo (CATE) Medição

1. Preparar a solução de rotulagem e medida S _o (ver passos 4,1-4,2, acima).
2. Medir factor de diluição (D _f).
   NOTA: Muitas vezes, a posição da amostra em relação ao detector, no contador de raios gama pode influenciar a quantidadeda radiação medida. Veja a discussão para mais detalhes.
   1. Depois de medir _o S, adicionar 19 ml de _H2O a cada amostra (de tal modo que o volume final = volume de eluato = 20 ml). Contagem radioatividade em cada amostra de 20 ml (veja o passo 4.2.1).
   2. Calcular _f D dividindo a cpm média das amostras de 1 ml da cpm média das amostras de 20 ml.
3. Mergulhe raízes na solução de etiquetagem por 1 hora.
4. Retirar as plantas de solução de etiquetagem e de transferência de plantas para efluxo funil, garantindo todo o material de raiz está dentro do funil. Suavemente plantas seguras para o lado de efluxo de funil através da aplicação de uma pequena tira de fita adesiva sobre o colar de plástico.
5. Suavemente despeje o primeiro eluato de dentro do funil. Comece temporizador (contando).
6. Abra a torneira e recolher o fluido no frasco da amostra após 15 seg (note: tempo de eluição irá variar, veja abaixo). Feche a torneira. Delicadamente despeje a próxima fluido dentro do funil.
7. REPEAt passo 5.6 para o restante da série de eluição, o que se segue, a partir do primeiro para o eluato final: 15 seg (quatro vezes), 20 s (três vezes), 30 s (duas vezes), 40 sec (uma vez), 50 seg (uma vez), 1 min (25 vezes), para um período total de eluição de 29,5 minutos
   NOTA: Série A dessorção pode variar de acordo com as condições experimentais ^7-10,13,14.
8. Uma vez que o protocolo de eluição é completa, as plantas de colheita (passos de 4,6-4,8, acima).
9. Contagem de radioactividade em eluatos e as amostras de plantas no contador gama (multiplicando a leitura para cada eluato por D _f, ver 5.2).
10. Lote libertação do marcador (cpm g (FW raiz) ^-1 min ^-1) como uma função de tempo de eluição. Para condições de estado estacionário, realizar regressões lineares e cálculos de fluxos, meias-vidas de troca e tamanhos de piscina (para detalhes, ver ^6-9).

A Figura 1 mostra isotérmicas encontrados utilizando a técnica DI (com ¹³ N), para o influxo de NH ₃ em raízes de plântulas de cevada intactos cultivados em alta (10 mM), NH ₄ ^+, e qualquer baixa (0,02 mM) ou alta (5 mM ) K ^+. As isotérmicas de apresentar uma cinética de Michaelis-Menten, quando NH ₃ fluxos são representados como uma função da concentração externa _de NH _{3 ([NH3] ext;} ajustados por alterações no pH da solução ^13). NH ₃ fluxos foram significativamente maiores em baixas de K ⁺ do que a K ⁺ elevado. Análise de Michaelis-Menten parâmetros cinéticos mostraram que o K _M manteve-se relativamente estável entre os níveis de K ⁺ (150 vs 90 μ M em baixo e K ⁺ elevado, respectivamente), enquanto _Vmax é fortemente reduzida a K ⁺ elevado (205 vs 80 umol g ^-1 h ^-1). Assim, os dados indicam que o nível de K ⁺ reges de transporte de azoto (V efeito _máximo), mas não por competição directa entre K ⁺ e NH ₃ para os locais de ligação dos transportadores (K _M efeito). Em vez disso, K ⁺ pode regular NH ₃ fluxos por outros meios, tais como através da modulação da atividade de aquaporinas (para detalhes, ver ^13).

DI também é útil para a captura de mudanças relativamente rápidas em influxo devido a desvios nutricionais, ou para a aplicação de agentes farmacológicos. Por exemplo, A Figura 2 destaca o rápido plasticidade do sistema K ⁺ -uptake em raízes de mudas de cevada intactas cultivadas em moderada (0,1 mM) K ⁺ e alta (10 mM) -NH ₄ ⁺ condições. Aqui, observa-se um aumento de ~ 350%, em K ⁺ influxo dentro de 5 min de NH ₄ ⁺ retirada da solução externa. Este "efeito de amônio retirada" ("pavor") foi encontrado para ser sensível ao K ⁺ -Channel bloqueadores tetraetilam�io (TEA ^+), bário (Ba ^{2 +),} e de césio (Cs ^+). Usando DI e medidas eletrofisiológicas em vários genótipos de Arabidopsis, pudemos conclusivamente atribuem a grande maioria da AWE para mudanças nas atividades do canal de Arabidopsis K ^+, AtAKT1 e de alta afinidade K ⁺ transportador, AtHAK5 ^14.

Figura 3 parcelas o efluxo de estado estacionário de ⁴² K ^+, com o tempo, a partir de raízes de mudas de cevada pré-rotulados cultivadas em baixa (0,1 mM) K ⁺ e moderada (1 mM) NO ₃ ^-. Esses traços mostram como o método CATE pode revelar mudanças rápidas e significativas no efluxo mediante aplicação de vários agentes farmacológicos / nutricionais. Inibição substancial e imediata de efluxo de K ⁺ foi observado em cima ou uma aplicação de 10 mM de Cs ^+, K ^+-channel blocker, ou um aumento acentuadoem K ⁺ disposição (de 0,1 a 10 mM). Estes resultados são consistentes com estudos moleculares que descrevem as propriedades de propagação de ida únicas rectificadora canais de K ^{+ _15.} Em contraste, a aplicação de 10 mM de NH ₄ ⁺ rapidamente e fortemente estimulado efluxo de K ^+. Este efeito pode ser explicado pela activação dos canais de ida-K ⁺ de rectificação através da despolarização do gradiente de potencial eléctrico através da membrana plasmática de células de raiz ^{16, a} qual é conhecida para ocorrer após a introdução de NH ₄ ^{+, 17.} Assim, através deste método, temos sido capazes de demonstrar, em planta, que os canais de K ⁺ K ⁺ mediar efluxo em raízes de cevada ^10.

Por fim, a Tabela 1 mostra os parâmetros extraídos a partir das medições CATE de estado estacionário ⁴² efluxo de K ⁺ ([K ^+] _ext = 0,1 mM) em sementes de cevadalings crescido tanto com 1 mM NO ₃ ^- ou NH ₄ ⁺ 10 mM, este último representando um cenário tóxico. A alta _NH4 ⁺ condição provoca uma supressão de todos os fluxos de K ^+, e uma redução significativa na concentração de K ⁺ citosólico ([K ^+] _cit), o qual é normalmente mantido a ~ homeostaticamente 100 mM sob condições de crescimento saudáveis ^​​18 (como observado , por exemplo, na Tabela 1, sob NO ₃ ^- alimentação).

Figura 1 ¹³ NH ₃ isotérmicas influxo revelar como K ⁺ fornecimento regula o transporte de azoto. _NH3 influxo como uma função de várias concentrações externas de NH _{3 ([NH3] ext) na raiz intacta de plântulas de cevada cresceram a alta (10 mM) de NH 3 / NH 4 ⁺ e ou baixo (0,02 mM, vermelho) ou alta (5 mM, azul) K ^+. Análise de Michaelis-Menten de isotérmicas de revelar a referida disposição de elevado K ⁺ tem um efeito relativamente pequeno sobre a afinidade do substrato (isto é, K M) de NH 3 -uptake transportadores, mas reduz significativamente a capacidade de transporte (isto é, V max, ver 'Resultados representativos '). Note-se, alterações no [NH3] ext foram estabelecidas pelo desvio do pH da solução com NaOH externo, e, portanto, os NH3: NH 4 ⁺ proporções, de acordo com a equação de Henderson-Hasselbalch. As barras de erro indicam SEM de 4-7 repetições. (Reproduzido de Coskun et al. Rápidas contas de transporte de gás amônia para fútil ciclismo transmembrana sob NH 3 / NH 4 ⁺ toxicidade em raízes de plantas. Plant Physiol163., 1859-1867 (2013).)}

Figura 2 NH ₄ ⁺ estimula significativamente retirada K ⁺ mediados por influxo de canal. K ⁺ afluxo, no estado estacionário, e após a retirada de NH ₄ ^+, em raízes de plântulas de cevada intactos cultivados a baixa (0,1 mM) de K ⁺ e alta (10 mM) _de NH ₄ ^+. O efeito do K ⁺ Canais de bloqueadores (10 mM de TEA ^+, 5 mM Ba ^{2 +,} e 10 mM Cs ⁺⁾ no K ⁺ influxo estimulado é pronunciado. Os asteriscos indicam diferentes níveis de significância entre -NH ₄ ⁺ e tratamento pares (* 0,01

4 ⁺ par (t -test de Student). As barras de erro indicam SEM de> 4 repetições. (Reproduzido de Coskun et al. Capacidade e plasticidade dos canais de potássio e transportadores de alta afinidade em raízes de cevada e Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)

A Figura 3 é o efluxo de K ^{+ +} sob condições de baixa-K mediada por canal em estado estacionário ⁴² efluxo de K ⁺ em raízes de plântulas de cevada intactos cultivados a baixa (0,1 mM) de K ⁺ e moderada (1 mM), NO ₃ ^-. E os efeitos imediatos (em t = 15,5 min; ver seta) de CsCl 10 mM, 5 mM de K ₂ SO4 e 5 mm (NH _{4) 2} SO ₄ em efluxo. Cada gráfico representa a média de 3-13 réplicas (SEM <15% da média). (Reproduzido de Coskun et al regulamento e mecanismo de liberação de potássio a partir de raízes de cevada.:. Um in planta ⁴² K ⁺ análise New Fitol 188, 1028-1038 (2010).).

⁺ Fluxos Tabela 1 em estado estacionário K e compartmentation sob várias disposições N fluxo em estado estacionário e análise compartimental de plântulas de cevada cresceram em 0,1 mM de K ^+, e nenhum moderado ₃ ^-. (1 mM, como sais de Ca ^{2 +)} ou alta NH ₄ ⁺ (10 mM, em SO ₄ ² sal). Erros indicam ± SEM de> 8 repetições. (Reproduzido de Coskun et al regulamento e mecanismo de liberação de potássio a partir de raízes de cevada.:. Um in planta ⁴² K ⁺ análise New Fitol 188, 1028-1038 (2010) e Coskun et al Capacidade e plasticidade dos canais de potássio e alta.. transportadores de afinidade em raízes de cevada e Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)

Tal como demonstrado nos exemplos acima, o método de traçador é um meio poderoso para medir fluxos unidireccionais de nutrientes e de agentes tóxicos in planta. Figura 1 mostra que o influxo _{de NH3} pode chegar a mais de 225 g mol ^-1 hora ^-1, o que é, talvez, o maior bona fide fluxo transmembrana já registrado em um sistema de planta ^13, mas a magnitude deste fluxo não seria visível se apenas fluxos líquidos foram medidos. Isto acontece porque uma grande efluxo de _NH3 ocorre ao mesmo tempo que o influxo, num cenário de ciclismo fútil que pode resultar numa sub-estimativa do fluxo pronunciado que aumenta com o tempo de rotulagem ^13. Ao completar a técnica de traçador com análise eletrofisiológica, fomos capazes de demonstrar que, nas condições da Figura 1, tanto influxo e efluxo de ¹³ N é principalmente do gás neutro NH _3, e não da sua Conjugcomeu ácido NH ₄ ⁺ (para detalhes, ver ^13). Esta é a primeira demonstração na planta dos fluxos de _NH3 gás rápidos nas raízes e, como tal, fornece evidências preliminares importante para desvendar o mecanismo de transporte que está no coração de NH ₃ / NH ₄ ⁺ toxicidade em plantas superiores ^2,13. Trabalho molecular em sistemas de expressão heterólogos demonstrou que _NH3 pode fluir através aquaporinas em plantas ^19, e os dados a partir da Figura 1, juntamente com evidências farmacológicas recente, passou a corroborando esses resultados ao nível do organismo intacta ^13.

Figuras 2 e 3 também fornecem excelentes exemplos da utilidade de medir fluxos unidirecionais com radiofármacos. Usando DI com ⁴² K ^+, fomos capazes de demonstrar que canais iônicos não são responsáveis ​​pelo estado de equilíbrio K ⁺ absorção em raízes de plântulas de cevada cultivadas em baixa e alta K ⁺ NH ₄ ^+, em contraste com o sistema de modelo de Arabidopsis ^14. Somente quando NH ₄ ⁺ foi retirado fez vemos evidência para a contratação de canais de K ⁺ (Figura 2). Embora o fluxo líquido de K ⁺ também é estimulada por NH ₄ ⁺ retirada (como mostrado pelo aumento do K ⁺ tecido conteúdo ^14), apenas medindo fluxo unidirecional fomos capazes revelar a magnitude e rápido início desse fenômeno. Além disso, através da realização de medições de DI com mutantes e agentes farmacológicos, fomos capazes de identificar quais proteínas de transporte estavam envolvidos. Do mesmo modo, através da aplicação de agentes nutricionais e farmacológicas enquanto monitorando traçador de efluxo (Figura 3), que foram capazes de identificar e caracterizar os mecanismos de efluxo de K ⁺ a partir de células de raízes de cevada ^10. Assim, as técnicas tais como DICATE e pode ser fundamental para a compreensão das características de transporte para um macronutriente fundamental.

Como foi observado no protocolo, muitas vezes a posição da amostra em relação ao detector, no contador de raios gama pode influenciar a quantidade de radiação medida. Assim, se uma amostra de 1 ml é "tampo" com 19 ml de H ₂ O, as contagens medidos (cpm) na amostra de 20 ml pode ser significativamente menor do que na amostra de 1 ml, apesar de ter a mesma quantidade do radiofármaco. Portanto, uma D _f pode ser aplicada para corrigir esta 'diluição' aparente da radioactividade. Esse problema muitas vezes não é explicitamente indicado pelos fabricantes de instrumentos de detecção e deve ser trabalhado pelo pesquisador individual. Da mesma forma, a eficácia da blindagem dentro de detectores de radiação contra o ambiente (ou seja, a partir de amostras vizinhas dentro do balcão) pode ser exagerada pelos fabricantes, e essas questões devem ser trabalhadasfora para sistemas de medição individuais.

Uma grande vantagem da técnica de traçador é sua não-invasiva, o que fornece um meio para medir os fluxos, tamanhos de piscina intracelulares, e taxas de câmbio, em condições de estado estacionário. Por exemplo, com CATE, que poderia de forma não invasiva quantificar as concentrações citosólicas de K ⁺ (Tabela 1). Isto pode ser preferível para métodos alternativos, tais como células de empalação com microeléctrodos selectivos de iões ^18, que transmite os distúrbios físicos e químicos possivelmente para a célula. Além disso, a técnica de marcador é o único que oferece uma visão abrangente de fluxos e compartimentalização de órgãos inteiros e plantas intactas. Isso é importante quando se está interessado em compreender a dinâmica dos nutrientes da planta inteira de toxicidade, e, finalmente, o desempenho no campo. Por fim, os métodos de radiofármaco permite medições muito sensíveis a ser conduzido sob concentrações bastante elevadas de substrato. Traditécnicas de depleção nais e técnicas de microeletrodos pode ter problemas de interferência de fundo e, portanto, pode exigir que a concentração externa do substrato de juros é reduzida bem inferior ao previsto durante o crescimento. Isto pode ser problemático se alguém estiver interessado em estudar as condições de "steady-state" de altas concentrações de substrato (como com NH ₃ / NH ₄ ⁺ toxicidade ou condições "High-K ^+"; veja acima).

Note-se que, como todas as técnicas, medindo os fluxos com radiotracers não é sem suas limitações. Por exemplo, a disponibilidade de radiofármacos pode ser problemático, especialmente para os isótopos de vida muito curta, como ¹³ N que exigem proximidade de uma unidade de produção como um ciclotron. Outra importante limitação é que, por vezes, pode ser difícil discriminar entre fluxos que ocorrem através das membranas e aqueles que ocorrem extracellularly. Tais distinções chamar para fase de testes rigoroso ^7,10,20. No caso de efluxo de K ^+, somente após um exame cuidadoso fomos capazes de confirmar que em estado estacionário ⁴² K ⁺ liberação de raízes estava ocorrendo não através das membranas celulares em alta [K ^+] _ext (> 1 mm) ^10, mas a partir extracelular espaços (cf figura 3). Tais problemas podem ser resolvidos através da análise do efeito de uma ampla variedade de agentes farmacológicos, ou através de análises termodinâmicas, que demonstraram, por exemplo, que os fluxos de Na ⁺ muito elevados relatados sob condições de salinidade seriam energeticamente inviável foram eles para avançar através das membranas celulares ^21,22.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).