قياس تدفقاتها من المغذيات المعدنية والمواد السامة في النباتات مع المشعة الراسمات

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

امتصاص وتوزيع المواد الغذائية والمواد السامة تؤثر بقوة نمو النبات. وفقا لذلك، والتحقيق في عمليات النقل الأساسية يشكل أحد المجالات الرئيسية للبحوث في بيولوجيا النبات والعلوم الزراعية ^1،2، خاصة في سياقات تحسين التغذية والضغوط البيئية (مثل الإجهاد الملحي والسمية الأمونيوم). ومن أهم الطرق لقياس التدفقات في النباتات هو استخدام استشفاف نظائر مشعة، والذي تم تطويره بشكل كبير في 1950s (انظر على سبيل المثال، ³⁾ ولا يزال يستخدم على نطاق واسع اليوم. أساليب أخرى، مثل قياس نضوب المغذيات من الجذر المتوسطة و / أو تراكم في الأنسجة، واستخدام الميكروية تهتز ايون انتقائية مثل MIFE (مسرى مكروي أيون تقدير التدفق) وSIET (مسح ايون انتقائية تقنية القطب)، واستخدام ايون انتقائية الأصباغ الفلورية، كما تطبق على نطاق واسع، ولكن محدودة في قدرتها على اكتشاف انفلونزا صافيXES (أي الفرق بين تدفق وهروب رأس المال). استخدام النظائر المشعة، من ناحية أخرى، يسمح للباحث قدرة فريدة على عزل وقياس تدفقات أحادي الاتجاه، والتي يمكن استخدامها لحل المعلمات الحركية (على سبيل المثال، K _M و V _{كحد أقصى)،} وتوفير نظرة ثاقبة وقدرة، علم الطاقة، الآليات، والتنظيم، ونظم النقل. قياسات تدفق أحادي الاتجاه المصنوع من بالدلائل المشعة هي مفيدة بشكل خاص في ظل ظروف حيث تدفق في الاتجاه المعاكس عالية، ودوران حمامات داخل الخلايا سريع ^4. وعلاوة على ذلك، أساليب المشع تسمح قياسات لإجراء تحت تركيزات الركيزة عالية نسبيا، على عكس العديد من التقنيات الأخرى (انظر "مناقشة"، أدناه)، وذلك لأن لاحظ النظائر تتبع على خلفية نظير آخر من نفس العنصر.

هنا، ونحن نقدم خطوات تفصيلية لقياس بالنظائر المشعة من أحادي الاتجاه و nآخرون تدفقات المغذيات المعدنية والمواد السامة في النباتات سليمة. سوف يتم التركيز على قياس تدفق البوتاسيوم (K ^+)، والمغذيات الكبيرة المصنع ^5، والأمونيا / الأمونيوم (NH ₃ / NH ₄ ^+)، المغذيات الكبيرة آخر الذي هو، ومع ذلك، سامة عندما تكون موجودة بتركيزات عالية (على سبيل المثال، 1- 10 ملي) ^2. سوف نستخدم النظائر المشعة ⁴² K ⁺ (ر _1/2 = 12.36 ساعة) و ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ⁺ (ر = 9.98 _1/2 دقيقة)، على التوالي، في شتلات سليمة من الشعير النظام النموذجي (شعير فولغاري L .)، في وصف بروتوكولين الرئيسية: تدفق مباشر (DI) والتحليل المجزئ من هروب رأس المال التتبع (CATE). ينبغي أن نلاحظ منذ البداية أن هذه المادة تصف ببساطة الخطوات اللازمة لتنفيذ كل بروتوكول. ، وتقدم عند الاقتضاء شروح موجزة من العمليات الحسابية والنظرية، ولكن مفصلة المعارض من كل تقنيةخلفية الصورة والنظرية يمكن العثور عليها في العديد من المواد الأساسية في موضوع ^4،6-9. الأهم من ذلك، هذه البروتوكولات قابلة للتحويل على نطاق واسع لتحليل تدفق المواد المغذية الأخرى / المواد السامة (مثل ²⁴ غ ^{+ 22} غ ^{+ 86 +} الروبيديوم، ¹³ NO ₃ ^-) والأنواع النباتية الأخرى، ولكن مع بعض المحاذير (انظر أدناه) . كما نؤكد على أهمية أن جميع الباحثين العاملين مع المواد المشعة يجب أن تعمل بموجب ترخيص ترتيبها من خلال تنظيم السلامة من الإشعاع المؤين المؤسسات الخاصة بهم.

1. الثقافة النبات وإعداد

1. زراعة الشتلات الشعير المائي لمدة 7 أيام في غرفة النمو التي تسيطر عليها المناخ (لمزيد من التفاصيل، انظر ^10).
   ملاحظة: من المهم أن تنظر في دراسة النباتات في مجموعة متنوعة من مراحل النمو، والاحتياجات الغذائية سوف تتغير مع تقدم العمر.
2. يوم واحد قبل التجريب، تحتوي العديد من الشتلات معا لجعل تكرار واحد (3 مصانع في كل ملزمة للDI و 6 محطات في كل ملزمة للCATE). الشتلات الحزم بلف 2 سم قطعة من أنابيب Tygon حول الجزء القاعدي من يطلق النار، وتأمين الأنبوب بشريط لإنشاء "طوق".
   ملاحظة: إن عدد النباتات في كل ملزمة قد تختلف بناء على الظروف التجريبية ^10،13،14. ويتم تجميع لتحسين الإحصاءات ودقة القياس، لا سيما عندما كتلة الجذر و / أو نشاط محدد منخفضة.

2. إعداد حلول تجريبية / المواد

1. لDI، وجمع ما يلي: قبل وضع العلامات، ووضع العلامات، والحلول الامتزاز (لمزيد من التفاصيل، انظر ^11)، أنابيب الطرد المركزي (لتدور تجفيف العينات النباتية)، وقارورة العينة (للمواد النباتية ونشاط محدد [S _س؛ انظر أدناه]). تهوية وخلط جميع الحلول.
2. لCATE، وجمع ما يلي: حلول حسنا مختلطة، ووضع العلامات الهوائية وشطف (لمزيد من التفاصيل، انظر ^10)، ومداخل هروب رأس المال، وأنابيب الطرد المركزي (لتدور تجفيف العينات النباتية)، وقارورة العينة (لeluates، والعينات النباتية، و تحديد S _س وعامل التخفيف [D _و، انظر أدناه]).

3. إعداد المشع

تنبيه: ينبغي اتخاذ الخطوات السلامة التالية قبل العمل مع النشاط الإشعاعي.

1. تأكد من أن متطلبات radioacمفهومة TIVE ترخيص المواد واتباعها. ارتداء معدات السلامة المناسبة (أي نظارات واقية، وقفازات، معطف المختبر، سترة الرصاص / طوق)، ومقاييس الجرعات (على سبيل المثال، خاتم وشارة TLD). انشاء الكابلات (أي زجاجي الطوب والرصاص) وأداء العمل الاشعاعي وراء ذلك. تأكد من أن عداد جيجر مولر، موجودة من أجل مراقبة روتينية للتلوث.
2. إعداد ⁴² K ⁺
   1. وضع، كوب جافة ونظيفة على التوازن. الصفر التوازن.
   2. إزالة قارورة من التتبع (20 ميلي كوري من ⁴² K ₂ CO _3، في شكل مسحوق) من التعبئة والتغليف التتبع وتصب في كوب. يحيط علما كتلة.
   3. ماصة 19.93 مل من DH ₂ O، تليها 0.07 مل من H ₂ SO ₄ في الكأس. ودفع هذا التفاعل الكيميائي التالية:
      ⁴² K ₂ CO ₃ (ق) + H ₂ SO ₄₎ ل (+ H ₂ O (ل) → ⁴² K ₂ SO ₄ (ل) + CO ₂ (V) + 2H ₂ O (ل)
   4. حساب تركيز محلول المخزون الإشعاعي، وبالنظر إلى الكتلة والوزن الجزيئي للK ₂ CO _3، وحجم (20 مل).
      ملاحظة: إذا كان العمل مع وينتج ¹³ NH ^_3/13 NH ₄ ⁺ والتتبع في سيكلوترون عبر القصف بروتون من ذرة الأكسجين من الماء (الناتج عادة في النشاط 100-200 ميلي كوري؛ على تفاصيل الإنتاج، انظر ^12). لأن كمية ¹⁴ NH ^_3/14 NH ₄ ⁺ منخفضة للغاية في هذه الحلول، وتركيز N من الحل الأسهم لا يكاد يذكر.

4. تدفق المباشر (DI) قياس

1. ⁴² K ^+، ماصة كمية من محلول المخزون المشعة المطلوبة للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب من K ⁺ في حل وضع العلامات.
   1. لمدة ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ^+، ماصة كمية صغيرة (<0.5 مل) في حل وضع العلامات. يسمح الحل وضع العلامات على مزيج دقيق (عن طريق التهوية).
2. ماصة 1 مل عينة فرعية من حل العلامات إلى قارورة العينة، وكرر ثلاث مرات (4 عينات في المجموع).
   1. قياس النشاط الإشعاعي في قارورة (في "التهم في الدقيقة الواحدة"، CPM)، وذلك باستخدام عداد غاما. ضمان العداد مبرمجة بحيث قراءات التدوير يتم تصحيح لتسوس النظائر (وهذا مهم بشكل خاص لمثل هذه استشفاف قصيرة الأجل).
   2. حساب S _س (كنسبة نسخة في الدقيقة مكرومول ^-1) عن طريق حساب متوسط ​​التهم من العينات الأربع (CPM مل ^-1) وقسمة تركيز الركيزة في حل (مكرومول مل ^-1).
3. تزج جذور في مرحلة ما قبل وضع العلامات (غير المشعة) حل لمدة 5 دقائق، إلى ما قبل تتوازن النباتات تحت ظروف الاختبار (انظرعلى سبيل المثال، ^10،13،14 للاختلافات في وقت ما قبل التسمية).
4. تزج جذور في وضع العلامات (المشع) حل لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: يمكن وصفها مرة تختلف استنادا إلى التجربة ^3،4،7-10.
5. نقل الجذور إلى حل الامتزاز لمدة 5 ثانية لإزالة الجزء الأكبر من النشاط الإشعاعي الالتصاق السطح. نقل جذور في كوب الثاني من الحل الامتزاز لمدة 5 دقائق إلى جذور أبعد واضحة من التتبع خارج الخلية.
6. تشريح ويطلق النار منفصلة، ​​يطلق النار القاعدية، والجذور.
7. وضع جذور في أنابيب الطرد المركزي وعينات تدور لمدة 30 ثانية في سرعة منخفضة، السريرية الصف الطرد المركزي (~ 5،000 x ج) لإزالة المياه السطحية والخلالي.
8. وزن الجذور (الوزن الطازج، FW).
9. عد نشاط اشعاعي في عينات نبات (تبادل لاطلاق النار، تبادل لاطلاق النار القاعدية، والجذر، راجع الخطوة 4.2.1).
10. حساب التدفق. حساب التدفق الى المحطة باستخدام الصيغة
    Φ = Q * / S _س وزن _L
    حيث Φ هو تدفق(مكرومول ز ^-1 ساعة ^-1)، Q * هو كمية التتبع المتراكمة في الأنسجة (CPM، وعادة في الجذر، واطلاق النار، واطلاق النار القاعدية، مجتمعة)، S _س هو نشاط محدد من الحل وضع العلامات (CPM مكرومول ^{- 1)،} ث هو الجذر الوزن الطازج (ز)، و ر _L هو الوقت وضع العلامات (الموارد البشرية).
    ملاحظة: حساب أكثر تطورا ويمكن إجراء لحساب المتزامن التتبع هروب رأس المال من الجذور خلال وضع العلامات والامتزاز، استنادا إلى معايير تم الحصول عليها من CATE (انظر أدناه؛ لمزيد من التفاصيل، انظر ^4).

5. تحليل المجزئ بواسطة الراسم الدفق (CATE) قياس

1. إعداد حل التوسيم وقياس S _س (انظر الخطوات 4،1-4،2 أعلاه).
2. قياس عامل التخفيف (D _و).
   ملاحظة: في كثير من الأحيان، والموقف من العينة نسبة إلى كشف في مكافحة جاما يمكن أن تؤثر كميةالإشعاع المقاسة. انظر المناقشة للحصول على التفاصيل.
   1. بعد قياس S _س، إضافة 19 مل من H ₂ O لكل عينة (مثل أن الحجم النهائي = حجم الشطافة = 20 مل). عد النشاط الإشعاعي في كل عينة 20 مل (راجع الخطوة 4.2.1).
   2. حساب D _و بقسمة متوسط ​​الكلفة لكل ألف من العينات 1 مل من متوسط ​​الكلفة لكل ألف من العينات 20 مل.
3. تزج الجذور في محلول وضع العلامات لمدة 1 ساعة.
4. إزالة النباتات من النباتات حل وضع العلامات ونقل إلى هروب رأس المال القمع، وضمان جميع المواد هي الجذر داخل القمع. بلطف محطات آمنة إلى جانب قمع هروب رأس المال من خلال تطبيق شريط صغير من الشريط عبر طوق من البلاستيك.
5. تصب بلطف شطافة الأولى في القمع. بدء الموقت (عد متابعة).
6. فتح حنفية وجمع شطافة في عينة قارورة بعد 15 ثانية (ملاحظة: وقت شطف سوف تختلف، وانظر أدناه). إغلاق حنفية. تصب بلطف شطافة المقبلة في القمع.
7. Repeaر خطوة 5.6 للفترة المتبقية من سلسلة شطف، والذي يتبع، من الأول إلى شطافة النهائية: 15 ثانية (أربع مرات)، و 20 ثانية (ثلاث مرات)، و 30 ثانية (مرتين)، 40 ثانية (مرة واحدة)، 50 ثانية (مرة واحدة)، 1 دقيقة (25 مرة)، لمدة شطف إجمالية قدرها 29.5 دقيقة
   ملاحظة: سلسلة الامتزاز يمكن أن تختلف بناء على الظروف التجريبية ^{7-10،13،14.}
8. بروتوكول شطف مرة واحدة اكتمال والنباتات الحصاد (خطوات 4،6-4،8 أعلاه).
9. عد النشاط الإشعاعي في eluates والعينات النباتية في مكافحة جاما (ضرب القراءة لكل شطافة بواسطة D _و، انظر 5.2).
10. مؤامرة إطلاق التتبع (CPM ز (FW الجذر) ^-1 دقيقة ^-1) بوصفها وظيفة من الوقت شطف. لظروف الحالة المستقرة، نفذ الانحدار الخطي وحسابات التدفقات، حياة نصف الصرف، والأحجام سباحة (للمزيد من التفاصيل، انظر ^6-9).

ويبين الشكل 1 الأيسوثرم العثور على استخدام تقنية DI (مع ¹³ N)، لتدفق NH ₃ إلى جذور شتلات سليمة الشعير المزروعة في عالية (10 ملم) NH ₄ ^+، وإما منخفضا (0.02 ملم) أو عالية (5 ملم ) K ^+. تعرض الأيسوثرم حركية ميكايليس-مينتن عندما يتم رسم NH ₃ تدفقات كدالة للتركيز خارجي NH ₃ ([NH _{3] تحويلة.} تعديل بالتغيرات في حل الرقم الهيدروجيني ^13). كانت NH ₃ تدفقات أعلى بشكل ملحوظ في انخفاض K ⁺ من على ارتفاع K ^+. وأظهر تحليل ميكايليس-مينتن المعلمات الحركية أن K _M بقيت مستقرة نسبيا بين K ⁺ المستويات (150 مقابل 90 μ M في انخفاض وارتفاع K ^+، على التوالي)، في حين يتم تقليل V بقوة في _أقصى ارتفاع K ⁺ (205 مقابل 80 ميكرومول ز ^-1 ساعة ^-1). وبالتالي، فإن البيانات تشير إلى أن مستوى K ⁺ regulatوفاق النقل النيتروجين (V تأثير _{كحد أقصى)،} ولكن ليس عن طريق المنافسة المباشرة بين K ⁺ وNH ₃ لمواقع النقل ملزم (K _M المفعول). بدلا من ذلك، قد K ⁺ تنظيم NH ₃ تدفقات بوسائل أخرى، مثل من خلال تعديل النشاط aquaporin (لمزيد من التفاصيل، انظر ^13).

DI مفيد أيضا لالتقاط التغيرات السريعة في تدفق نسبيا بسبب التحولات الغذائية، أو لتطبيق كلاء الدوائية. على سبيل المثال، الشكل 2 يبرز اللدونة السريع لK ⁺ -uptake النظام في جذور شتلات سليمة الشعير المزروعة في معتدلة (0.1 ملم) وارتفاع -K ⁺ (10 ملم) -NH ₄ ⁺ الظروف. هنا، لاحظنا زيادة ~ 350٪ في K ⁺ تدفق ضمن 5 دقائق من NH ₄ ⁺ الانسحاب من حل خارجي. تم العثور على هذه "الأمونيوم تأثير انسحاب" ("الرعب") أن تكون حساسة للK ⁺ و-قناة حاصرات رباعي إيثيل الأمونيوم (TEA ^+)، الباريوم (با ^2+)، والسيزيوم (CS ^+). باستخدام DI والقياسات الكهربية في العديد من المورثات نبات الأرابيدوبسيس، تمكنا من قاطع تنسب الغالبية العظمى من AWE للتغيرات في أنشطة قناة نبات الأرابيدوبسيس K ^+، AtAKT1، وارتفاع تقارب-K ⁺ نقل، AtHAK5 ^14.

الرقم 3 قطع هروب رأس المال ثابت للدولة من ⁴² K ^+، مع مرور الوقت، من جذور الشتلات الشعير المسمى قبل زراعتها في منخفضة (0.1 ملم) K ⁺ ومعتدلة (1 ملم) NO ₃ ^-. تظهر هذه الآثار كيف طريقة CATE يمكن أن تكشف عن التغيرات السريعة والكبيرة في هروب رأس المال بناء على طلب من مختلف وكلاء الدوائية / التغذية. وقد لوحظ كبير، وتثبيط المباشر للK ⁺ هروب رأس المال على إما تطبيق 10 ملي جيم ^+، K ^+-قناة لمانع، أو زيادة حادةفي K ⁺ توفير (0،1 حتي 10 ملم). هذه النتائج تتفق مع الدراسات الجزيئية التي تصف خصائص فريدة من الخارج النابضة تصحيح-K ⁺ قنوات _^15. على النقيض من ذلك، تطبيق 10 ملي NH ₄ ⁺ بسرعة وبقوة حفز K ⁺ هروب رأس المال. هذا التأثير يمكن تفسيرها من خلال تفعيل تصحيح الخارج-K ⁺ قنوات الاستقطاب عبر التدرج الجهد الكهربائي عبر الغشاء البلازمي للخلايا الجذرية ^16، والذي يعرف أن تحدث عند إدخال NH ₄ ^{+ 17.} وهكذا، وذلك باستخدام هذا الأسلوب، كنا قادرين على إثبات، في بلانتا، أن K ⁺ K ⁺ قنوات توسط هروب رأس المال في جذور الشعير ^10.

وأخيرا، يبين الجدول 1 المعلمات CATE المستخرجة من قياسات الحالة المستقرة ⁴² K ⁺ هروب رأس المال ([K ^+] _تحويلة = 0.1 ملم) في بذور الشعيرلينجز نمت إما مع 1 ملي NO ₃ ^- أو 10 ملي NH ₄ ^+، تمثل هذا الأخير سيناريو السامة. ارتفاع NH ₄ ⁺ حالة يجلب حول قمع كل K ⁺ التدفقات، وانخفاض كبير في تركيز K ⁺ عصاري خلوي ([K ^+] _CYT)، والذي عادة ما يحتفظ homeostatically في ~ 100 ملم في ظل ظروف نمو صحية ¹⁸ (كما لوحظ ، على سبيل المثال، في الجدول 1، تحت NO ₃ ^- العرض).

تكشف الرقم 1. ¹³ NH ₃ الأيسوثرم تدفق كيف K ⁺ العرض ينظم نقل النيتروجين. NH ₃ تدفق بوصفها وظيفة من تركيزات متفاوتة الخارجية NH _{3 ([NH 3] تحويلة) في الجذور سليمة من الشتلات الشعير المزروعة في عالية (10 ملم) NH 3 / NH 4 ⁺ وإما منخفضا (0.02 ملم، أحمر) أو عالية (5 ملم والأزرق) K ^+. ميكايليس-مينتن تحليلات الأيسوثرم تكشف هذا الحكم عالية K ⁺ له تأثير ضئيل نسبيا على تقارب الركيزة (أي K M) من NH 3 -uptake النقل، ولكن بشكل ملحوظ يقلل من قدرة النقل (أي V كحد أقصى، وانظر "ممثل النتائج '). ملاحظة تم إنشاء التغيرات في [NH 3] تحويلة طريق تحويل الرقم الهيدروجيني حل الخارجية مع هيدروكسيد الصوديوم، وبالتالي NH 3: نسب ⁺ NH 4، وفقا لمعادلة هندرسون-Hasselbalch. أشرطة الخطأ تشير SEM من يعيد 4-7. (مستنسخة من كوسكون آخرون حسابات نقل الغاز الأمونيا السريع لعقيمة عبر الغشاء الدراجات تحت NH 3 / NH 4 ⁺ سمية في جذور النباتات. الفيزيولوجيا النباتية163، 1859-1867 (2013).)}

الشكل 2. NH ₄ ⁺ يحفز الانسحاب بشكل ملحوظ K بوساطة قناة ⁺ تدفق. K ⁺ تدفق في حالة مستقرة، وعند الانسحاب من NH ₄ ^+، في جذور الشتلات الشعير سليمة نمت عند أدنى (0.1 ملم) K ⁺ وعالية (10 ملي) NH ₄ ^+. هو واضح تأثير ⁺ K-قناة حاصرات (10 ملي TEA ^+، 5 ملي با ^2+، و 10 ملي جيم ⁺⁾ على حفز K ⁺ تدفق. النجمة دلالة مستويات مختلفة من الأهمية بين -NH ₄ ⁺ والعلاج أزواج (* 0.01

4 ⁺ زوج (الطالب ر -test). أشرطة الخطأ تشير SEM من> 4 مكررات. (مستنسخة من كوسكون آخرون القدرات واللدونة من قنوات البوتاسيوم والناقلين عالية تقارب في جذور الشعير ونبات الأرابيدوبسيس. الفيزيولوجيا النباتية. 162، 496-511 (2013).)

الرقم 3. K ⁺ هروب رأس المال تحت منخفضة-K ⁺ الظروف بوساطة قناة ثابت للدولة ⁴² K ⁺ هروب رأس المال في جذور الشتلات الشعير سليمة نمت عند أدنى (0.1 ملم) K ⁺ ومعتدلة (1 ملم) NO ₃ ^-، و الآثار المباشرة (في تي = 15.5 دقيقة، وانظر السهم) من 10 ملي CSCL، 5 ملي K ₂ SO4، و 5 ملي (NH _{4) 2} SO ₄ على هروب رأس المال. وتمثل كل قطعة يعني من 3-13 مكررات (SEM <15٪ من المتوسط). (مستنسخة من كوسكون آخرون التنظيم وآلية الإفراج البوتاسيوم من جذور الشعير:. لفي بلانتا ⁴² K ⁺ تحليل جديد الفيتول 188، 1028-1038 (2010).)

الجدول 1. K ثابت للدولة ⁺ تدفقات وجompartmentation تحت أحكام N مختلف تدفق ثابت للدولة والتحليل المجزئ من الشعير الشتلات نمت بمعدل 0.1 ملي K ^+، وإما NO المعتدل ₃ ^- (1 ملم، والكالسيوم ²⁺ الملح) أو ارتفاع NH ₄ ⁺ (10 ملم، كما SO ₄ ^2- الملح). أخطاء تشير ± SEM من> 8 مكررات. (مستنسخة من كوسكون آخرون التنظيم وآلية الإفراج البوتاسيوم من جذور الشعير:. لفي بلانتا ⁴² K ⁺ تحليل جديد الفيتول 188، 1028-1038 (2010) وكوسكون آخرون القدرات واللدونة من قنوات البوتاسيوم والعالية. النقل تقارب في جذور الشعير ونبات الأرابيدوبسيس. الفيزيولوجيا النباتية. 162، 496-511 (2013).)

كما هو موضح في الأمثلة أعلاه، وطريقة المشع هو وسيلة قوية لقياس تدفقات أحادي الاتجاه من المواد الغذائية والمواد السامة في بلانتا الشكل 1 يبين أن NH ₃ تدفق يمكن أن تصل إلى ما يزيد على 225 ميكرومول ز ^-1 ساعة ^-1، التي ربما تكون أعلى حسن تدفق عبر الغشاء بحسن أبلغ من أي وقت مضى في نظام مصنع ^13، ولكن حجم هذا التدفق لا تكون مرئية إذا تم قياس صافي التدفقات فقط. وذلك لأن هروب رأس المال كبير من NH ₃ يحدث في نفس الوقت الذي تدفق، في سيناريو عقيم الدراجات التي يمكن أن تؤدي في أقل من الواقع وضوحا من تدفق الذي يزيد مع الوقت وضع العلامات ^13. بواسطة المكمل لتقنية التتبع مع ​​تحليل الكهربية، كنا قادرين على إثبات أن في ظل ظروف الشكل 1، سواء تدفق وهروب رأس المال من ¹³ N هو في المقام الأول للغاز محايد NH _3، وليس لها من conjugتناولوا حمض NH ₄ ⁺ (لمزيد من التفاصيل، انظر ^13). هذا هو الأول في مظاهرة بلانتا من تدفقات NH ₃ الغاز السريعة في الجذور، وعلى هذا النحو، يقدم دليلا أوليا هاما نحو كشف آلية النقل التي تقع في قلب NH ₃ / NH ₄ ⁺ سمية في النباتات العليا ^2،13. وقد أثبتت عمل الجزيئية في أنظمة تعبير مغايرة أن NH ₃ يمكن أن تتدفق عبر aquaporins في النباتات ^19، والبيانات من الشكل 1، جنبا إلى جنب مع الأدلة الدوائية مؤخرا، بدأت تثبت هذه النتائج على مستوى الكائن الحي سليمة ^13.

الأرقام 2 و 3 أيضا أمثلة ممتازة من الأداة لقياس تدفقات أحادي الاتجاه مع بالدلائل المشعة. باستخدام DI مع ⁴² K ^+، كنا قادرين على إثبات أن أيون قنوات ليست مسؤولة عن مطردة للدولة K ⁺ في امتصاص جذور الشتلات الشعير المزروعة في K ⁺ انخفاض وارتفاع NH ₄ ^+، على النقيض من النظام النموذجي نبات الأرابيدوبسيس ^14. فقط عندما تم سحب NH ₄ ⁺ لم نرى دليلا لإشراك K ⁺ قنوات (الشكل 2). على الرغم من أن تدفق صافي K ⁺ هو حفز أيضا NH ₄ ⁺ الانسحاب (كما يتضح من زيادة الأنسجة K ⁺ محتوى ^14)، فقط من خلال قياس تدفق أحادي الاتجاه تمكنا تكشف عن حجم وسرعة ظهور هذه الظاهرة. وعلاوة على ذلك، عن طريق إجراء القياسات DI مع المسوخ وكلاء الدوائية، كنا قادرين على تحديد أي نقل البروتينات متورطون. وبالمثل، من خلال تطبيق وكلاء الغذائية والدوائية في حين رصد التتبع هروب رأس المال (الشكل 3)، كنا قادرين على توصيف وتحديد آليات K ⁺ هروب رأس المال من خلايا الجذر الشعير ^10. وبالتالي، تقنيات مثل DIوCATE يمكن أن يكون مفيدا في فهم خصائص النقل لالمغذيات الكبيرة حرجة.

كما لوحظ في البروتوكول، وغالبا ما موقف العينة نسبة إلى كشف في مكافحة جاما يمكن أن تؤثر كمية الإشعاع المقاسة. وبالتالي، إذا تم "تصدر عن" عينة 1 مل مع 19 مل من H ₂ O، يمكن أن التهم قياس (CPM) في العينة 20 مل يكون أقل بكثير مما كانت عليه في عينة 1 مل، على الرغم من وجود نفس الكمية من المشع. ولذلك، _و D يمكن تطبيقها لتصحيح هذا "التخفيف" من الواضح النشاط الإشعاعي. وغالبا ما لا ذكر هذه المسألة صراحة من قبل الشركات المصنعة للكشف عن الأجهزة ويجب أن يعمل بها الباحث الفردي. وبالمثل، فإن فعالية التدريع ضد الإشعاع داخل كاشفات المحيط (أي من عينات القريبة داخل العداد) يمكن أن يكون مبالغا فيه من قبل الشركات المصنعة، ويجب أن تعمل هذه القضاياخروج لأنظمة القياس الفردية.

والميزة الرئيسية لتقنية التتبع هي غير الغازية والخمسين، والذي يوفر وسيلة لقياس التدفقات، والأحجام تجمع الخلايا، وأسعار الصرف، في ظل ظروف الحالة المستقرة. على سبيل المثال، مع CATE، يمكن لنا قياس غير جراحية تركيزات عصاري خلوي من K ⁺ (الجدول 1). هذا يمكن أن يكون أفضل من الطرق البديلة مثل التطويق من الخلايا مع ايون انتقائية الميكروية ^18، الذي يضفي الاضطرابات الجسدية وربما الكيميائية إلى الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، تقنية التتبع هي فريدة من نوعها من حيث أنه يوفر نظرة شاملة عن تدفقات والتقسيم للأجهزة كاملة والنباتات سليمة. وهذا أمر مهم إذا كان أحد يهتم في فهم ديناميات المغذيات كامل النبات، سمية، وفي نهاية المطاف، والأداء في هذا المجال. وأخيرا، تتيح أساليب المشع لقياس حساسة للغاية التي ستجرى تحت تركيزات الركيزة عالية إلى حد ما. التقليديينtional التجارب نضوب وتقنيات مسرى مكروي يمكن أن تواجه مشكلات التدخل الخلفية، وبالتالي، قد تتطلب تركيز خارجي من الركيزة التي تهم يخفض أقل بكثير من التي قدمت أثناء النمو. هذا يمكن أن يكون مشكلة إذا كان أحد المهتمين بدراسة الظروف "حالة مستقرة" تركيزات الركيزة عالية (مثل مع NH ₃ / NH ₄ ⁺ سمية أو شروط "عالية K ^+"، انظر أعلاه).

وتجدر الإشارة إلى أنه، مثل كل التقنيات، وقياس التدفقات مع بالدلائل المشعة لا يخلو من حدوده. على سبيل المثال، توفر بالدلائل المشعة يمكن أن يكون مشكلة، خاصة بالنسبة النظائر قصيرة العمر جدا مثل ¹³ N التي تتطلب مقربة من منشأة لانتاج مثل سيكلوترون. الحد رئيسي آخر هو أن في بعض الأحيان، قد يكون من الصعب التمييز بين التدفقات التي تحدث عبر الأغشية وتلك التي تحدث extracellularly. مثل هذه الفروق تستدعي مرحلة الاختبار القاسي ^7،10،20. في حالة K ⁺ هروب رأس المال، إلا بعد دراسة متأنية كنا قادرين على التأكد من أن الحالة المستقرة ⁴² K ⁺ الإفراج عن الجذور كان يحدث ليس عبر أغشية الخلايا في أعلى [K ^+] _تحويلة (> 1 ملم) ^10، ولكن من خارج الخلية المساحات (راجع الشكل 3). يمكن حل مثل هذه القضايا من خلال دراسة تأثير مجموعة واسعة من وكلاء الدوائية، أو من خلال التحاليل الحرارية، التي أظهرت، على سبيل المثال، أن تدفقات عالية جدا نا ⁺ المبلغ عنها تحت الظروف الملحية سيكون غير مجد بقوة كانوا والمضي قدما عبر أغشية الخلايا ^21،22.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).