Method Article
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
栄養素や毒物の取り込みと分布が強く、植物の成長に影響を与える。したがって、基本的な輸送プロセスの研究は、特に栄養の最適化と環境ストレス( 例えば 、塩ストレス、アンモニウム毒性)の文脈で、植物生物学や農学1,2の研究の主要な領域を構成している。植物中のフラックスを測定するための方法の中で最高経営責任者は、1950年代に大幅に開発された放射性同位体トレーサーを使用することである( 例えば 、3を参照)、今日広く使用され続けています。そのような根培地および/または組織への蓄積から栄養枯渇の測定などMIFE(微小電極イオン磁束推定)とSIET(イオン選択性電極法をスキャン)のようなイオン選択性振動マイクロ電極の使用、の使用などの他の方法は、イオン選択性蛍光色素は、広く適用されるが、正味のインフルエンザを検出する能力が制限されているXES( すなわち 、流入と流出の差)。放射性同位体の使用は、一方で、研究者は動力学的パラメーターを解決するために使用することができる一方向性フラックスを分離し、定量化するユニークな能力を可能にする( 例えば 、K MおよびV max)は 、容量への洞察を提供し、エネルギー論、交通システムのメカニズム、および規制、。放射性トレーサーで作られた単方向フラックス測定は反対方向に磁束が高く、細胞内プールの代謝回転が急速4である条件の下で特に有用である。トレースされた同位体は、同じ要素の別の同位体を背景に観察されているため、また、放射性トレーサーの方法は、(以下に、「ディスカッション」を参照)の測定は、多くの他の技術とは異なり、かなり高い基質濃度下で行うことを可能にする。
ここでは、単方向であり、nの放射性同位体を測定するための詳細な手順を提供完全な植物ミネラル栄養素や毒物のらフラックス。重点が存在する場合、高濃度( 例えば 、1〜において、カリウム(K +)のフラックス測定に有毒植物主要栄養素5、アンモニア/アンモニア(NH 3 / NH 4 +)、しかし、別の主要栄養素を説明する10ミリモル)2。私たちは、モデル系の大麦( オオムギ L の無傷の苗に、それぞれ、NH 4 +(T 1/2 = 9.98分)の放射性同位元素42 K +(T 1/2 = 12.36時間)と13 NH 3月 13日を使用します。)、2主要プロトコルの説明において:トレーサー流出(CATE)による直接流入(DI)とコンパートメント解析。私たちは、この記事は、単純に各プロトコルを実行するために必要な手順を説明し、最初から注意してください。計算と理論の適切な、簡潔な説明が提供される場合、各技術の詳細な博覧会の背景と理論は対象4,6-9上のいくつかの重要な論文に記載されています。重要なことは、これらのプロトコルは他の栄養素/毒物の分析をフラックスに広く譲渡する( 例えば 、24のNa +、22 Na +の、86のRb +、13 NO 3 - )および他の植物種に、いくつかの注意事項ではあるが(下記参照) 。また、放射性物質を扱うすべての研究者が機関の電離放射線安全·レギュレータを介して配置されたライセンスの下で働かなければならない重要性を強調。
1工場の文化と準備
実験的ソリューション/材料の作製
コンテンツ ">注:以下は、一般的に実験前に1日に実行されます。3放射性トレーサーを準備
注意:以下の安全のステップが放射能で作業する前に注意する必要があります。
4。直接流入(DI)の測定
トレーサー流出(CATE)測定による5。コンパートメント解析
図1は 、高で成長した無傷の大麦の苗の根に、NH 3の流入のために(13をN)DI技術を使用して見つかった等温線を示している(10 mM)を、NH 4 +、およびいずれか(0.02 mM)の低または高(5 mMの)K +。 (;溶液のpH 13の変化によって調整する[NH 3] EXT)NH 3のフラックスは、外部のNH 3濃度の関数としてプロットされた場合の等温線は、ミカエリス·メンテン速度論を表示します。 NH 3フラックスは高K +よりも低K +で有意に高かった。ミカエリス·メンテン動力学的パラメータを分析すると、V maxは強く高K +(205対で減少している間、K Mは 、K +レベル(それぞれ低及び高K +、150対90μM)との間で比較的安定していたことを示した80マイクロモルのG -1時間-1)。したがって、データは、K +レベル regulatエス窒素輸送(V maxは効果 )ではなく、トランスポーターの結合部位についてのK +とNH 3との間に直接的な競争(K M効果 )による。むしろ、K +は、アクアポリンの活性の調節を介してのような他の手段(詳細については、13を参照)によってNH 3フラックスを調節し得る。
DIはまた、栄養に移行する、または薬理学的薬剤の適用に流入における比較的速い変化を捕捉するのに便利です。たとえば、 図2は中程度(0.1 mM)を-K +と高い(10 mM)を-NH 4 +条件で成長させ、完全な大麦の苗の根にある+ -uptake系Kの急速な可塑性を強調しています。ここでは、外部溶液からNH 4 +離脱の 5分以内のK +流入における〜350%の増加を観察した。この「アンモニウム離脱効果」(「AWE」)はK +に感受性であることが見出された -channelブロッカーテトラエチル(TEA +)を、バリウム(Ba 2 +)、およびセシウム(Cs +)。いくつかのシロイヌナズナ遺伝子型におけるDIと電気生理学的測定を用いて、、AtAKT1決定的シロイヌナズナ K +チャネルの活性の変化にAWEの大半を帰することができましたし、高親和性K +トランスポーター、AtHAK5 14。
図3のプロットが低い(0.1 mM)のK +と(1 mM)の中程度で成長した予め標識大麦の苗の根から時間をかけて42のK +の定常状態流出、NO 3 - 。これらのトレースはCATE法は、さまざまな栄養/薬理学的物質を加えると流出の急速かつ大幅な変更を明らかにすることができる方法を示しています。 K +流出の実質的、即時の阻害は、10mMのCs +、K + -チャネルブロッカー、または急激な増加のアプリケーションのいずれかの際に観察された(0.1から10mmまで)のK +引当金の。これらの結果は、外向き整流性K +チャネル15の固有のゲーティング特性を記述する分子の研究と一致しているのに対し 、迅速かつ強力に10mMのNH 4 +のアプリケーションはK +流出を刺激した。この効果は、NH 4 + 17の導入の際に起こることが知られているルートセル16の原形質膜を横切る電位勾配の脱分極を介して外向き整流性K +チャネルの活性化によって説明することができる。したがって、この方法を用いて、私たちは、K +チャネルは大麦10の根のK +流出を媒介すること、 植物体中で 、示すことができた。
最後に、 表1は、42 K +流出([K +] EXT = 0.1 mM)をオオムギ種子における定常状態の測定から抽出されたCATEパラメータを示していまたは10mM NH 4 +、後者は有毒なシナリオを表す- lingsのいずれか1 mMのNO 3を用いて成長させた。高いNH 4 +の状態は、すべてのK +フラックスの抑制、および細胞質K +濃度の大幅な減少をもたらす([K +] CYT)観察されたように、通常は恒常的に(健康な成長条件の下で18〜100 mMのに維持され、 例えば 、 表1において、NO 3の下-電源)。
図1。13 NH 3流入等温線は、K +電源が窒素輸送を調節する方法を明らかにした。NH 3の流入をNHの外部濃度を変化させる機能として、 3([NH 3] EXT)高い(10 mM)のNH 3 / NH 4 +と(赤0.02ミリモル)、ローまたはハイのどちらか(5ミリモル、青)のK +で成長した大麦の苗の無傷の根。ミカエリス·メンテンの等温線の解析高K +の規定は、NH 3 -uptakeトランスポーターの基質親和性( すなわち 、K M)は比較的ほとんど影響を持っていますが、大幅に輸送能力( すなわち 、V maxを減少させることを明らかにし、「代表的な結果を参照してください')。ヘンダーソン·ハッセルバルヒ方程式に従って、NH 4 +比:注、[NH 3]拡張の変化は、このように、NH 3、NaOHで外部溶液のpHをシフトすることによって設立され、された。エラーバーは4-7のSEMが複製を示している。 (Coskun らから再生された。急速なアンモニアガス輸送アカウントを植物の根中のNH 3 / NH 4 +の毒性の下で無駄な膜貫通サイクリング。 工場Physiol。163、1859年から1867年(2013年)。)
図2:NH 4 +撤退が大幅に低い(0.1 mM)のK +および高で成長させ、完全な大麦の苗の根に、定常状態でのチャネル媒介K +流入、K +流入を刺激し、NH 4 +の撤退時に(10 mM)のNH 4 +。刺激されたK +流入に対するK + -チャネル遮断薬(10mMのTEA +の、5mMののBa 2 +、および10mMのCs +)の効果が顕著である。一方向ANOVAダネットの多重比較ポストホック付き;アスタリスクは-NH 4 +と治療のペア(* P <0.01 <0.05、*** P <0.001間の有意性の異なるレベルを表す試験)。括弧内のアスタリスクは、コントロールと-NH 4 +ペア(スチューデントのt -test)との間の有意水準を示す。エラーバーは、> 4の複製のSEMを示している。 (大麦及びシロイヌナズナ。 植物Physiol。162、496から511(2013)の根のCoskun ら容量およびカリウムチャネルと高親和性トランスポーターの可塑性から再生。)
。図3のK +流出は、低K +条件下での低い(0.1 mM)のK +と適度な(1 mM)のNO 3で成長した無傷の大麦の苗の根の定常状態42 K +流出チャネル媒介 - であり 、 (tで= 15.5分;矢印参照)即効性の10mMのCsCl、5mMのK 2 SO4、5mMの(NH 4)2 SO 4上で流出。各プロットは3-13回の反復(SEM <平均値の15%)の平均を表す。 (。Coskun ら規制と大麦の根からのカリウム放出のメカニズムから再生: インプランタ 42のK +分析の新しいフィトール 188、1028年から1038年(2010)。)
[K +] 内線 | N源 | 流入 | 流出 | 正味フラックス | E:私レシオ | プールサイズ | 半減期 |
(MM) | (MM) | (マイクロモルgの-1時間-1) | (MM) | (分) | |||
0.1 | 1 NO 3 - | 7.22±0.23 | 1.86±0.18 | 5.36±0.18 | 0.25±0.02 | 98.84±14.08 | 28.18±3.40 |
10 NH 4 + | 1.89±0.13 | 0.57±0.05 | 1.32±0.10 | 0.30±0.01 | 28.39±3.40 | 32.50±4.69 |
表1に定常状態K +フラックスおよびcさまざまなN個の規定に基づくompartmentation定常状態のフラックスと0.1 mMのK +で成長させた大麦苗のコンパートメント解析、およびいずれかの適度なNO 3 - (1 mMの、のCa 2 +塩として)または高NH 4 +(10mMの、などのSO 4 2-塩)。エラーが> 8回の反復の平均±SEMを示している。 (Coskun らから再生規制と大麦根からのカリウム放出のメカニズム:。カリウムチャンネルのインプランタ 42のK +分析の新しいフィトール 188、1028年から1038年(2010)とCoskun ら能力と可塑性と高大麦とシロイヌナズナの根における親和性トランスポーター。 植物Physiol。162、496から511(2013)。)
上記の例で示したように、放射性トレーサー法が植物体に栄養素や毒性物質の単方向のフラックスを測定する強力な手段である。 図1は 、NH 3流入は225マイクロモルgの-1時間-1、おそらくあるの過剰に達することができることを示していますこれまでプラントシステム13に報告された最高善意の膜貫通フラックスが、唯一のネットフラックスを測定した場合は、この磁束の大きさは見えない。 NH 3の大流出ラベリング時間13とともに増加流入の顕著な過小評価をもたらすことができる無駄なサイクリングのシナリオでは、流入と同時に発生するためである。電気生理学的解析をトレーサー法を補完することで、 図1の条件で、13 Nの両方の流入と流出は、主に中性ガス、NH 3のではなく、そのconjugであることを実証することができた酸NH 4 +が (詳細については、13を参照)食べた。これは根が急速にNH 3ガスフラックスのインプランタデモンストレーションの最初に 、そのようなものとして、高等植物2,13中のNH 3 / NH 4 +の毒性のコアとなるトランスポート·メカニズムの解明に向けて、重要な予備的な証拠を提供しています。異種発現系における分子作業はNH 3が最近の薬理学的証拠と一緒に、植物19、及び図1からのデータにアクアポリンを介して流れることができることを実証した、無傷の生物13のレベルでこのような知見を確証し始めている。
図2および図3はまた、放射性トレーサーで一方向の磁束を測定する有用性の優れた例を提供する。 42 K +とDIを用いて、そのイオンチャネルは、定常状態のK +については責任を負いません実証することができたモデル系シロイヌナズナ 14とは対照的に、低K +と高いNH 4 +で成長した大麦の苗の根における取り込み。 NH 4 +が撤回された場合にのみ、私たちはK +チャネルの関与の証拠( 図2)を参照してくださいました。 (増加した組織のK +含量14によって示されるように)K +の正味のフラックスはまた、NH 4 +の撤退によって刺激されていますが、単方向の流入を測定することによってのみ、私たちができるこの現象の大きさと迅速な開始を明らかにした。さらに、変異体および薬理学的薬剤とDI測定を行うことによって、私たちはタンパク質が関与している輸送同定することができた。同様に、トレーサーの流出を監視しながら( 図3)栄養および薬理学的薬剤を適用することによって、私たちは特徴付け、オオムギ根細胞10からのK +流出のメカニズムを同定することができた。そのようなDIとしてこのように、技術とCATEは、重要な主要栄養素のための輸送特性の理解に尽力することができます。
プロトコルで述べたように、多くの場合、ガンマカウンターで検出器に対する試料の位置が測定された放射線の量に影響を与えることができる。 1-mlのサンプルは、H 2 Oを19ミリリットルに「補充」されている場合このように、20mlの試料において(cpm)を測定した数が同じ量を持つにもかかわらず、1ミリリットルのサンプルに比べて有意に低くすることができる放射性トレーサーの。したがって、D fは、放射能のこの明らかな「希釈」を補正するために適用することができる。この問題は、多くの場合、明示的に検出器具の製造業者によって記載されておらず、個人の研究者によって働いている必要があります。同様に、(カウンターの中、近くのサンプルからすなわち 、)周囲の放射線に対する検出器内のシールドの有効性は、製造業者によって誇張することができ、このような問題は働いたことがなければならない個別の測定システムのためのアウト。
トレーサー技術の主な利点は、定常状態の条件下で、フラックス、細胞内プールのサイズ、及び為替レートを測定する手段を提供し、その非侵襲性である。たとえば、CATEで、私たちは非侵襲的にK +( 表1)の細胞質ゾルの濃度を定量化することができます。これは、細胞への物理的および化学的な可能性外乱を付与するイオン選択的微小電極18、を有する細胞の突き刺しなどの代替の方法に好ましいことがある。また、トレーサー技術は、全体の臓器や完全な植物用フラックスと区画化を包括的に提供するという点でユニークです。一つは全体の植物栄養素動態、毒性、およびフィールドで、最終的には、パフォーマンスを理解する上で興味を持っている場合に重要です。最後に、放射性トレーサーの方法は、かなり高い基質濃度下で実施することが非常に敏感な測定が可能になります。 Traditional枯渇実験と微小電極技術は、バックグラウンド干渉の問題が発生することができ、したがって、目的の基質の外部濃度が十分に成長の間に提供されるものよりも低下していることが必要な場合があります。一つは(;上記参照、例えばNH 3 / NH 4 +毒性または「高K +」の条件のように)高い基質濃度の「定常状態」の条件を研究することに関心がある場合、これは問題になる可能性があります。
これは、すべての技術のように、放射性トレーサーでフラックスを測定することには限界がないわけではないことに留意すべきである。例えば、放射性トレーサーの利用可能性は、特に、サイクロトロンなどの生産施設のすぐ近くを必要とする13 Nのような非常に短命の同位体のために、問題となる可能性がある。もう一つの主要な制限は、時にはそれが膜を横切って発生している磁束とそれらの天然extracelを区別することは困難であることであるlularly。このような区別は厳密な相試験の7,10,20を求める。 K +流出の場合には、慎重に検討が定常状態42 K +の根からの放出は、高[K +] 内線 (> 1 mM)を10で細胞膜を横切っていないに発生するが、細胞外からされたことを確認することが私たちができた後にのみスペース(参照、 図3)。それらが細胞膜を横切って進行したような問題は、薬理学的物質の広い範囲の効果を調べることによって解決することができ、または示されている熱力学的分析を介して、例えば、生理条件下で報告された非常に高いのNa +フラックスは、エネルギー的に不可能であろう21,22。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
Forceps | VWR | 470005-496 | |
Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
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