Method Article
Разработка biotinylatable слитые белки имеет много потенциальных применений в различных областях исследований. Рекомбинантный инженерно белок является прямым процедура, которая является экономически эффективным, обеспечивая высокие урожаи специально разработанных белков.
Рекомбинантный инженерно белок используется кишечной палочки (E.coli) системы экспрессии на протяжении почти 4 десятилетия, а сегодня Е. палочка по-прежнему наиболее широко используется организмом-хозяином. Гибкость системы позволяет добавлением фрагментов, таких как биотин тега (для стрептавидином взаимодействий) и больших функциональных белков, как зеленый флуоресцентного белка или вишнево-красного белка. Кроме того, интеграция неестественных аминокислот, таких как ионов металлов хелаторов, однозначно активных функциональных групп, спектроскопических зондов, и молекул, придающих пост-трансляционные модификации позволило лучше манипулирование свойствами белковых и функциональных возможностей. В результате этот метод создает настраиваемые слитые белки, которые предлагают значительные утилиту для различных областях исследований. Более конкретно, biotinylatable последовательность белка были включены в многих белков-мишеней вследствие высокой аффинности взаимодействия между биотина с авидином и стрептавидином. Это дополнение помог в повышении обнаружения и очистки меченых белков, а также открывая путь для вторичных приложений, таких как сортировки клеток. Таким образом, биотин-меченых молекул показать все большую и широкую влияние в Биоиндастриэл и биомедицинских областях. Для целей нашего исследования мы разработали рекомбинантных белков биотинилированное слияния, содержащие фактор роста нервов (ФРН) и semaphorin3A (Sema3A) функциональные области. Мы сообщали ранее, как эти белки слияния биотинилированный, вместе с другими активными белковых последовательностей, могут быть привязаны к биоматериалов для тканевой инженерии и регенеративной целей. Этот протокол описывает основы инженерной biotinylatable белков в масштабе миллиграмм, используя Т7 лаковые индуцибельную вектор и E. палочки хозяева выражения, начиная с преобразования масштабирования и очистки.
Белки охватывают широкий диапазон биомолекул, которые отвечают за многих биологических функций, в конечном счете, приводит к правильного формирования тканей и организации. Эти молекулы инициировать тысячи путей, которые контролируют до регулирования и / или понижающей регуляции генов и других белков сигнализации, поддержания равновесия в человеческом теле. Срыв одного белка влияет весь этот веб сигналов, что может привести к возникновению разрушительных расстройств или заболеваний. Инженерно отдельные белки в лаборатории предлагает одно решение для борьбы с этими отрицательных последствий и предлагает альтернативу низкомолекулярных препаратов. В 1977 году, ген, кодирующий последовательность соматостатина 14 аминокислот был одним из первых инженерных полипептидов, созданных с помощью E. палочка 1. Вскоре после того как в 1979 году, инсулин был клонирован в плазмиду pBR322, трансформируется, выразил, и очищенный 2. С тех пор, рекомбинантные белки расширили свое влияние на несколько областей реснить поиск таких как биоматериалов, доставки лекарств, тканевой инженерии, биофармацевтических препаратов, сельского хозяйства, промышленных ферментов, биотоплива и т.д. (по отзывам см. ссылки 3-8). Это в значительной степени из-за гибкости, что метод предлагает через добавлением специализированных химических фрагментов или белковых последовательностей для целей, включая, но не ограничиваясь этим, идентификации целевой белок, стабилизации и очистки.
Через технологии рекомбинантной ДНК, рекомбинантные белки могут быть экспрессированы в различных эукариотов и прокариотов хост-системы, включая млекопитающих, растений, насекомых, дрожжей, грибков или бактерий. Каждый хост предлагает различные преимущества и, как правило, лучшие системы определяется на основе функции белка, выход, стабильность, общей стоимости и масштабируемость. Бактерии клетки часто не хватает посттрансляционные механизмы модификации, что эукариотические хозяева предоставляют (т.е. гликозилирования дисульфид мостов, E TC.) 5. В результате млекопитающих и насекомых системы обычно приводит к лучшей совместимости и экспрессии эукариотических белков, однако эти узлы, как правило, дороже и отнимает много времени 9. Таким образом, Е. палочка является благоприятствования хост для нашей системы экспрессии, поскольку клетки быстро расширяться в недорогих условий роста и генетические механизмы экспрессии хорошо понимал 5,9. Кроме того, эта система легко масштабируется вверх для производственных целей и результатов в функциональных белков, несмотря на отсутствие пост-трансляционных модификаций 10. Е. Штамм E.coli К12 выбирается в этом протоколе для клонирования, поскольку этот штамм предлагает прекрасные урожаи плазмиды на основе высокой эффективностью преобразования. Кроме того, Е. штамм BL21 используется для выражения, потому что эту гостиницу штамм содержит РНК ген полимеразы Т7, которая обеспечивает контролируемое экспрессию белка и стабильности 11.
палатка "> После выбора узла, далее следует соблюдать осторожность при выборе идеального вектора экспрессии, чтобы облегчить выбирают и регулируют экспрессию белка. Синтез рекомбинантных белков начинается с целевой последовательностью ДНК, которая клонирована в соответствии с направлением транскрипции бактериофага Т7 и сигналов перевода, и экспрессия индуцируется в клетках-хозяевах, содержащих хромосомные копии гена РНК-полимеразы Т7 12. Эти векторы, полученные из плазмидного вектора pBR322 (для обзора см. ссылку 13), которые под жестким контролем промотора T7 первоначально разработанного Studier и его коллеги 14 и обеспечивают дополнительное контроль путем включения оператора ЛАК и лаковые репрессор (lac1) 15,16. Для рекомбинантного белка техники, эта система выражение дает возможность адаптировать конкретную аминокислотную последовательность желаемого белка путем вставки различные последовательности ДНК-мишени или создать слитые белки состоит из комбинированного областис с одного белков. Кроме того, некоторые векторные серии включают пептидные изменения тегов, которые будут размещены на N или С-конца. Для наших целей дизайна, гистидин (His) был добавлен к последовательности-мишени ДНК для очистки и biotinylatable последовательность 15 аминокислоты были включены для биотинилирования 17,18. В этом протоколе плазмиду, содержащую ген устойчивости к ампициллину, была выбрана, чтобы нести наши белковые последовательности biotinylatable синтеза. Выражение управляется в этом векторе через Лак промотора Т7 и легко индуцировали изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG).Тестовые выражения (мелкомасштабные культур) используются для определения присутствия и растворимость белка-мишени, что может быть выражено либо в растворимой или нерастворимой форме, чтобы сформулировать процедуры очистки. Растворимый белок выразил в бактерий клетки будут испытывать спонтанное сворачивание сохранить свою нативную структуру 19. Обычно роднойструктура термодинамически выгодным. Во многих случаях метаболическая активность хозяина не способствует белка-мишени, оказывает давление на систему, что приводит к нерастворимого продукции белка и образованием телец включения, состоящие из нерастворимых белковых агрегатов. Таким образом, целевой белок денатурирует, что делает их, как правило биологически неактивными 20. Оба теста выражения в увеличенном масштабе, и процедуры выделения определяются растворимости белка-мишени. Дополнительным ренатурация или шаг повторной укладки требуется для нерастворимых белков. Полученные рекомбинантные белки могут быть дополнительно очищен с помощью эксклюзионной хроматографии.
В доме рекомбинантного белка предлагает экономически преимуществ по сравнению с коммерческими продуктами, так как миллиграммов белка-мишени, могут быть выделены на литр основной культуры. Большая часть необходимого оборудования имеется в типичной биологической или химической лаборатории. Белковая инженерия позволяет создаватьпользовательских слитых белков с добавлением функций, которые не всегда имеются в продаже. Рисунок 1 показаны основные процедуры, связанные с инженерно рекомбинантных белков. С помощью этой системы экспрессии мы создали множество biotinylatable белки, такие как интерферон-гамма, тромбоцитарный фактор роста и костного морфогенетического белка-21-23, но мы будем сосредоточить внимание на двух белков, которые мы предназначенных для аксонов, NGF (29 кДа ) и Sema3A (91 кДа) 10 (для обзора см. ссылку 24). Биотинилирование является общим методом для идентификации, иммобилизации и изоляции меченых белков с использованием известного биотин-стрептавидин взаимодействие 25-27. Биофизические зонды 28,29, биосенсоры 30, и квантовые точки 31 приведены некоторые примеры систем, которые используют высокое сродство биотин-стрептавидин сопряжения с Уб на порядка 10 -15 М 27. Е. палочка биоолово лигазы, Бира, помогает в ковалентного биотина в боковой цепи лизина, находящегося в этом биотина последовательность 18,32 помечены. Модем биотин к материалам и биомолекул выпустила задержанную доставку факторов роста в ячейку для нескольких тканевой инженерии 21,33-35. Поэтому, машиностроение эти специально разработанных biotinylatable белки является мощным инструментом, который может превзойти несколько научных интересов.
1. Проектирование белок-мишень
2. Создание агаром
Примечание: Очень важно, что все запасы антибиотиков, пластин, буферы и т.д. хранятся надлежащим образом (температура и продолжительность) и остаются свободными протеаз (стерилизовать).
3. Клонирование Биотин Tagged плазмиды
Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.
4. Трансформация плазмиды в Expression хост
Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.
5. Шкала деятельности Порядок и Главная Культура
6. Выделение и очистка рекомбинантного белка
Примечание: Если белок находится в растворимой регионе на основе анализа SDS-PAGE со стадии 4.9, то "Родной Изоляция" будет использоваться, но для нерастворимые белки "Nonnative изоляции» процедур будет выполнена.
7. Биотинилирование очищенного белка
Клонирование и испытаний Выражение
Когда покрытие выполняется должным образом, одной изолированной колонии должны сформировать увеличить шансы выщипывание клональная трансформированные клетки бактерий (рис. 2а). Однако, если слишком много клетки высевают, планшеты инкубировали слишком долго при 37 ° С или трансформации сомнительна, колонии может покрывать агаром или образуют более крупные агрегаты клеток (фиг. 2В и 2С). Во время тестового выражения, NGF и Sema3A были впервые индуцировали в течение 4 ч при 37 ° С и анализ SDS-PAGE определяется как белки были расположены в растворимой фракции (рис. 2D). Выражение белка казалась справедливой и поэтому еще одно испытание выражение с индукцией в течение ночи при 18 ° С был рассмотрен. NGF привело к улучшению экспрессии в растворимой фракции, тогда как не было заметной разницы с Sema3A (рис. 2Е).
"> Выделение, очистка и БиотинилированиеОба NGF и Sema3A были изолированы с помощью собственных методов изоляции, как описано в приведенном выше протоколе, и пропускали через колонку FPLC для очистки. Кроме того, эти рекомбинантные белки были выделены и очищены nonnatively. Даже при том, что NGF был в растворимой фракции во время тестового выражения, родные процедуры выделения производится низкий выход NGF после того как и 37 ° C (4,57 мг / основной культуры 2 л) и 18 ° C (6,11 мг / основной культуральной из 2 л; Рисунок 3A, сплошные линии) индукции. Тем не менее, высокий выход NGF был получен через неродного изоляции с ренатурации (10,72 ± 1,8 мг / основной культуры 2 л; фиг.3А, пунктирная линия) после 18 ° C в течение ночи индукции. С другой стороны, неродной изоляция не привело к производству Sema3A (фиг.3В, пунктирная линия) с 8,61 ± 3,1 мг / основной культуры 2 л для нативного изоляции (рис. 3 B, сплошная линия). В результате, NGF был выделен под неродном условиях после ночного индукции при 18 ° С, в то время, Sema3A прошли родной изоляцию 4 ч после индукции при 37 ° С FPLC пики собирали и образцы NGF и Sema3A были проанализированы с ДСН-ПААГ (рис. 3). Дополнительные пики белок, содержащийся в выходе FPLC для Sema3A (рис. 3б) были собраны и проанализированы с ДСН-ПААГ и не были расположены в области молекулярной массы Sema3A. Эти фракции, скорее всего, продукты распада, потому что они не ведут себя функционально в клеточных основе анализов как и пик Sema3A показано на рис 3B. Белки биотинилировали помощью фермента Бира и диализу для удаления любых непрореагировавших видов. Биотинилирование было подтверждено с помощью набора биотин количественной оценки и флуоресцентного микропланшетного.
ftp_upload/51295/51295fig1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51295/51295fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Белковая инженерия использования в E. палочка система экспрессии. Основной процесс рекомбинантного инженерии белка включает проектирование плазмиды для клонирования и экспрессии в E. палочка. Трансформированные колонии отбирали с применением антибиотиков. Небольшой тест выражения используются для оптимизации и идентификации продукции и растворимость белка-мишени. Эта процедура масштабируется, чтобы больших пакетных культивации (литр шкала). Методы хроматографии используются для выделения и очистки желаемого инженерии белка. Модификации, такие как биотинилирования может произойти во время пакетных культивации или после очистки.
Рисунок 2. Оptimizing тест выражение ФРН и Sema3A. (А) Покрытие 25 мкл трансформированных E. палочка K12 клетки привело в небольших изолированных колоний. Человек колонии должны быть выбраны для испытаний выражения. Для BL21 трансформированных клеток Аналогичное распределение колонии должно происходить. (BC) Покрытие 50 мкл и 100 мкл K12 клеток, соответственно, в результате перенаселенности бактериальных колоний. Plucking из этих пластин может привести к более низкой вероятности выбора колонию получены из одной трансформированной клетки. (D) Тестовые выражения трансформированных клеток были индуцированы в течение 4 часов при 37 ° С с помощью IPTG и SDS-PAGE показывает, что NGF слитый белок (29 кДа) и Sema3A слитый белок (91 кДа) выражены в растворимой фракции. (E) Быстро индукции при 18 ° С показана экспрессия NGF еще в растворимой фракции, однако выражение для Sema3A не увеличивается.
Рисунок 3. Очистка ФРН и Sema3A использованием FPLC. (А) Nonnative изоляции после 18 ° С в течение ночи индукции (пунктирная линия) в результате повышения урожайности NGF по сравнению с родной изоляции на обоих 4 ч, 37 ° С и в течение ночи 18 ° C индукции (сплошные линии). (B) Для Sema3A, индукции при 37 ° С в течение 4 часов и родной состоянии изоляции производится лучшие выходы по сравнению с неродного изоляции при тех же параметрах культивирования. SDS-PAGE показывает FPLC пиковые коллекции (стрелки) для обоих (А) ФРН и (B) Sema3A. Стандартного белка гель-фильтрации проводили для подтверждения молекулярно-массовое распределение пиков и указывается в фоне FPLC участков в кДа.
Изоляция | Буфер | Компоненты |
Nonnative | Лизис / Wash | 6 М GuHCl, 100 мМ H 2 NaPO 4, 10 мМ Трис-основание, 10 мМ имидазол, рН = 8,0 |
Элюирование | 6 М GuHCl, 200 мМ ледяной уксусной кислоте (17,4 M) | |
Диализ (Ренатурация) | Фосфатный буфер солевой раствор (PBS): 21,7 мМ NaH 2 PO 4, 15,3 мМ Na 2 HPO 4, 149 мМ NaCl | |
Буфер 1: PBS, 0,2 М GuHCl, 1,99 мМ дитиотреитола (DTT) в 4 л ультрачистой воды, рН = 7,4 | ||
Буфер 2: PBS в 4 л воды высшей степени очистки, рН = 7,4 | ||
Родной | Лизис | 50 ммоль NaH 2 PO 4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН = 8,0 |
Мыть | 50 мМNaH 2 PO 4, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, рН = 8,0 | |
Элюирование | 50 ммоль NaH 2 PO 4, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, рН = 8,0 | |
Диализ | Фосфатный буфер солевой раствор (PBS): 21,7 мМ NaH 2 PO 4, 15,3 мМ Na 2 HPO 4, 149 мМ NaCl | |
Буфер 1: PBS, 1,99 мМ ДТТ в 4 л ультрачистой воды, рН = 7,4 | ||
Буфер 2: PBS в 4 л воды высшей степени очистки, рН = 7,4 |
Таблица 1. Рекомбинантный белок изоляции буферов.
Рекомбинантный инженерно белок является очень мощная техника, которая охватывает множество дисциплин. Он является экономически эффективным, перестраиваемый и относительно простая процедура, что позволяет производство высокими выходами специально разработанных белков. Важно отметить, что проектирование и выражая белки-мишени не всегда просто. Базальной выражение и рекомбинантный стабильность белков зависит от конкретных вариантов вектора, E. штаммы кишечной клеток, дополнения тегов пептидные и параметры культивирования. Наша своеобразным критерием дизайн использует хорошо организованной E. палочка штаммы для белковой инженерии. Кроме того, плазмидный вектор содержит Т7 промотор и лаковые ген устойчивости к ампициллину для стабильной экспрессии рекомбинантного белка.
После получения высокоочищенного субклонировали плазмиды, первый крупный процедура успешно трансформировать целевого белка в клетке-хозяине и определить растворимостьбелок. Тестовые выражения лучшее время, чтобы оптимизировать синтез белка-мишени. Важно, чтобы сорвать небольших изолированных колоний (рис. 2а), чтобы обеспечить лучший выбор бактериальных клеток, содержащих плазмиду. Устранение неполадок стратегии, такие как повторного посева штрихом перераспределить колонии или инкубации агаром на более короткие периоды времени может помочь в лучших колонии образований. Не удивительно, что рекомбинантного белка вызывает напряжение на штамма-хозяина 36. На этом этапе, если выражение является бедным, такие факторы, как антибиотик и концентрации IPTG, а также времени индукции и температуры можно регулировать для достижения оптимального целевого белка (см. обзоры 37-38). Это было расценено для ФРН, где лучшее выражение в результате индукции в течение ночи при 18 ˚ С (рис. 2Е).
Sema3A привело к продукции белка для нативных условиях, но nonnativэ изоляция не показали производство белка (рис. 3б). Основные культуры NGF индуцировали в течение 4 часов при 37 ˚ С, а также в течение ночи при 18 ˚ С и выделяют при нативных условиях. Очистка FPLC производства более низкий выход NGF по сравнению с основными культурами, которые были выделены nonnatively после индукции в течение ночи при 18 ˚ С (фиг.3А). Образование белков в телец включения, как правило, считается нежелательным, поскольку ренатурация иногда трудно и не всегда успешно. Это привело к разработке методик для повышения растворимости белка в том числе добавлением растворимых белковых последовательностей 39-41. Однако белки, как было показано, обладают формы конформационных состояний в то время как выделен в телец включения, и такие параметры, как более низких температурах индукционных помогают поддерживать эти активные структуры 42-46. Когда белок может быть экспрессирован только в нерастворимую форму обычно можно повторноприрода белка после выделения с помощью простых методов с очень небольшим потери урожая, как мы уже сообщали ранее 21.
Мы показали, как успешно инженер и производить biotinylatable белки с помощью E. палочка клонирование и система экспрессии, как хозяин уступая около 8-10 мг / основной культуры 2 Л. Важно отметить, что в целом последовательность событий остается тем же при производстве новых рекомбинантных белков (рис. 1), однако, каждый заказ сделал белка должны рассматриваться на индивидуальной основе, чтобы определить, как конкретно производить наибольший выход очищенного продукта. Мы показали, как ФРН и Sema3A ведут себя иначе, в той же системе выращивания и как оптимизировать свое производство. Кроме того, мы в настоящее время с помощью другого E. палочка B штамм-хозяин, который может biotinylate в естественных условиях 47 для других белков-мишеней, демонстрируя важность сидячая забастовкаг хорошо информированы о текущих достижений и изменений, касающихся рекомбинантного инженерии белка.
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Авторы хотели бы выразить признательность в Университете Акрона за финансирование, которое поддерживает эту работу.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
Acetic acid, glacial | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
Agar | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
Antifoam 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | 1 ml; Expression Host |
Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
Gel filtration standard | Bio-Rad | 151-1901 | 6 vials |
Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
His-Pur Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
Hydrochloric acid | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
Imidazole | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
NovaBlue Competent Cells | Novagen | 69825 | 1 ml; Cloning Host |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
Potassium Chloride | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
Sodium phosphate diabasic | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
Terrific Broth | Bioshop | TER409.5 | 5 kg |
Tetracycline hydrochloride | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
Tryptone, pancreatic | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
Yeast extract, granulated | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
ÄKTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | Includes kits and accessories |
Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
BirA500 | Avidity | BirA500 | Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution |
Dialysis Casette | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Extra Strength) |
Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: 25,000 and 50,000 |
Flow Diversion Valve FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit | Invitrogen | 1094598 | |
Frac-950 Tube Racks, Rack C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
Fraction Collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | Includes kits and accessories |
Heated/Refrigerated Circulator | VWR | 13271-102 | Model 1156D |
Heating Oven FD Series | Binder | Model FD 115 | |
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
J-26 XPI Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | 393126 | |
JA 25.50 Rotor | Beckman Coulter | 363055 | |
JLA 8.1 Rotor | Beckman Coulter | 969329 | Includes 1 L polyporpylene bottles |
JS 5.3 Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
Laminar Flow Hood | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench |
Microplate Reader | TECAN | infinite M200 | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical electrophoresis system |
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels | Bio-Rad | 456-9036 | Any kDa, 15-well comb |
Ni-NTA Column | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml volume ECONO-Column |
Plasmid Miniprep Kit | Omega Bio-Tek | D6943-01 | |
PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes | VWR | 3119-0050 | 50 ml tubes for JA 25.50 rotor |
Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da |
Subcloning Service | GenScript USA Inc. | Protein Services | |
Ultrasonic Processor | Cole-Parmer | 18910445A | Model CV18 |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены