Выражение, изоляция, и очистка растворимых и нерастворимых Биотинилированные белков для нервной ткани Регенерация

Разработка biotinylatable слитые белки имеет много потенциальных применений в различных областях исследований. Рекомбинантный инженерно белок является прямым процедура, которая является экономически эффективным, обеспечивая высокие урожаи специально разработанных белков.

Рекомбинантный инженерно белок используется кишечной палочки (E.coli) системы экспрессии на протяжении почти 4 десятилетия, а сегодня Е. палочка по-прежнему наиболее широко используется организмом-хозяином. Гибкость системы позволяет добавлением фрагментов, таких как биотин тега (для стрептавидином взаимодействий) и больших функциональных белков, как зеленый флуоресцентного белка или вишнево-красного белка. Кроме того, интеграция неестественных аминокислот, таких как ионов металлов хелаторов, однозначно активных функциональных групп, спектроскопических зондов, и молекул, придающих пост-трансляционные модификации позволило лучше манипулирование свойствами белковых и функциональных возможностей. В результате этот метод создает настраиваемые слитые белки, которые предлагают значительные утилиту для различных областях исследований. Более конкретно, biotinylatable последовательность белка были включены в многих белков-мишеней вследствие высокой аффинности взаимодействия между биотина с авидином и стрептавидином. Это дополнение помог в повышении обнаружения и очистки меченых белков, а также открывая путь для вторичных приложений, таких как сортировки клеток. Таким образом, биотин-меченых молекул показать все большую и широкую влияние в Биоиндастриэл и биомедицинских областях. Для целей нашего исследования мы разработали рекомбинантных белков биотинилированное слияния, содержащие фактор роста нервов (ФРН) и semaphorin3A (Sema3A) функциональные области. Мы сообщали ранее, как эти белки слияния биотинилированный, вместе с другими активными белковых последовательностей, могут быть привязаны к биоматериалов для тканевой инженерии и регенеративной целей. Этот протокол описывает основы инженерной biotinylatable белков в масштабе миллиграмм, используя Т7 лаковые индуцибельную вектор и E. палочки хозяева выражения, начиная с преобразования масштабирования и очистки.

Белки охватывают широкий диапазон биомолекул, которые отвечают за многих биологических функций, в конечном счете, приводит к правильного формирования тканей и организации. Эти молекулы инициировать тысячи путей, которые контролируют до регулирования и / или понижающей регуляции генов и других белков сигнализации, поддержания равновесия в человеческом теле. Срыв одного белка влияет весь этот веб сигналов, что может привести к возникновению разрушительных расстройств или заболеваний. Инженерно отдельные белки в лаборатории предлагает одно решение для борьбы с этими отрицательных последствий и предлагает альтернативу низкомолекулярных препаратов. В 1977 году, ген, кодирующий последовательность соматостатина 14 аминокислот был одним из первых инженерных полипептидов, созданных с помощью E. палочка ^1. Вскоре после того как в 1979 году, инсулин был клонирован в плазмиду pBR322, трансформируется, выразил, и очищенный ^2. С тех пор, рекомбинантные белки расширили свое влияние на несколько областей реснить поиск таких как биоматериалов, доставки лекарств, тканевой инженерии, биофармацевтических препаратов, сельского хозяйства, промышленных ферментов, биотоплива и т.д. (по отзывам см. ссылки ^3-8). Это в значительной степени из-за гибкости, что метод предлагает через добавлением специализированных химических фрагментов или белковых последовательностей для целей, включая, но не ограничиваясь этим, идентификации целевой белок, стабилизации и очистки.

Через технологии рекомбинантной ДНК, рекомбинантные белки могут быть экспрессированы в различных эукариотов и прокариотов хост-системы, включая млекопитающих, растений, насекомых, дрожжей, грибков или бактерий. Каждый хост предлагает различные преимущества и, как правило, лучшие системы определяется на основе функции белка, выход, стабильность, общей стоимости и масштабируемость. Бактерии клетки часто не хватает посттрансляционные механизмы модификации, что эукариотические хозяева предоставляют (т.е. гликозилирования дисульфид мостов, E TC.) ^5. В результате млекопитающих и насекомых системы обычно приводит к лучшей совместимости и экспрессии эукариотических белков, однако эти узлы, как правило, дороже и отнимает много времени ^9. Таким образом, Е. палочка является благоприятствования хост для нашей системы экспрессии, поскольку клетки быстро расширяться в недорогих условий роста и генетические механизмы экспрессии хорошо понимал ^5,9. Кроме того, эта система легко масштабируется вверх для производственных целей и результатов в функциональных белков, несмотря на отсутствие пост-трансляционных модификаций ^10. Е. Штамм E.coli К12 выбирается в этом протоколе для клонирования, поскольку этот штамм предлагает прекрасные урожаи плазмиды на основе высокой эффективностью преобразования. Кроме того, Е. штамм BL21 используется для выражения, потому что эту гостиницу штамм содержит РНК ген полимеразы Т7, которая обеспечивает контролируемое экспрессию белка и стабильности ^11.

Тестовые выражения (мелкомасштабные культур) используются для определения присутствия и растворимость белка-мишени, что может быть выражено либо в растворимой или нерастворимой форме, чтобы сформулировать процедуры очистки. Растворимый белок выразил в бактерий клетки будут испытывать спонтанное сворачивание сохранить свою нативную структуру ^19. Обычно роднойструктура термодинамически выгодным. Во многих случаях метаболическая активность хозяина не способствует белка-мишени, оказывает давление на систему, что приводит к нерастворимого продукции белка и образованием телец включения, состоящие из нерастворимых белковых агрегатов. Таким образом, целевой белок денатурирует, что делает их, как правило биологически неактивными ^20. Оба теста выражения в увеличенном масштабе, и процедуры выделения определяются растворимости белка-мишени. Дополнительным ренатурация или шаг повторной укладки требуется для нерастворимых белков. Полученные рекомбинантные белки могут быть дополнительно очищен с помощью эксклюзионной хроматографии.

В доме рекомбинантного белка предлагает экономически преимуществ по сравнению с коммерческими продуктами, так как миллиграммов белка-мишени, могут быть выделены на литр основной культуры. Большая часть необходимого оборудования имеется в типичной биологической или химической лаборатории. Белковая инженерия позволяет создаватьпользовательских слитых белков с добавлением функций, которые не всегда имеются в продаже. Рисунок 1 показаны основные процедуры, связанные с инженерно рекомбинантных белков. С помощью этой системы экспрессии мы создали множество biotinylatable белки, такие как интерферон-гамма, тромбоцитарный фактор роста и костного морфогенетического ^{белка-21-23,} но мы будем сосредоточить внимание на двух белков, которые мы предназначенных для аксонов, NGF (29 кДа ) и Sema3A (91 кДа) ¹⁰ (для обзора см. ссылку ^24). Биотинилирование является общим методом для идентификации, иммобилизации и изоляции меченых белков с использованием известного биотин-стрептавидин взаимодействие ^25-27. Биофизические зонды ^28,29, биосенсоры ^30, и квантовые точки ³¹ приведены некоторые примеры систем, которые используют высокое сродство биотин-стрептавидин сопряжения с _Уб на порядка 10 ^-15 М ^27. Е. палочка биоолово лигазы, Бира, помогает в ковалентного биотина в боковой цепи лизина, находящегося в этом биотина последовательность ^18,32 помечены. Модем биотин к материалам и биомолекул выпустила задержанную доставку факторов роста в ячейку для нескольких тканевой инженерии ^21,33-35. Поэтому, машиностроение эти специально разработанных biotinylatable белки является мощным инструментом, который может превзойти несколько научных интересов.

1. Проектирование белок-мишень

1. Использование Национальный центр биотехнологической информации веб-сайта (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) получить аминокислотную последовательность для белка-мишени с учетом видов интереса и любых вариантах сплайсинга. Выбор аминокислотную последовательность, которая соответствует активной области, представляющей интерес белка.
   Примечание: Для Sema3A, аминокислоты 21-747 были выбраны. Слитый белок был разработан с NGF где последовательность барстара, аминокислоты 1-90, был добавлен к NGF аминокислот 122-241.
2. Для N-конец добавить последующие последовательности: 6X-Его тегов для очистки (HHHHHH), Табак Etch Virus (ТРВ) протеазы вырезать сайт для удаления Его тега (ENLYFQG), биотин последовательность помечены для биотинилирования белка в К (GLNDIFEAQKIEWHE) и гибкий шарнир с пробелами, что позволит комнату для надлежащего белка рефолдинга (EFPKPSTPPGSSGGAP).
   Примечание: Эти последовательности могут варьироваться в зависимости от желаемого слитого протЭйн.
3. Отправить полную последовательность аминокислот в компанию для генной конструкции / оптимизации для желаемых видов хозяев и синтеза. Подклон в вектор выбора с помощью сайт BamHI-NotI с использованием набора или с использованием коммерческих услуг.

2. Создание агаром

Примечание: Очень важно, что все запасы антибиотиков, пластин, буферы и т.д. хранятся надлежащим образом (температура и продолжительность) и остаются свободными протеаз (стерилизовать).

1. Взвесить агар 1,5% масс и лизогении бульона (LB) при 20 г / л и месте в стеклянной СМИ бутылки. 500 мл бутылка составляет около 15 пластин.
2. Объемно добавить сверхчистой воды, хорошо перемешать, и автоклав.
3. Пусть бутылку прохладной на ощупь и добавить соответствующие антибиотики. Избегайте преждевременного затвердевания агара, но если бутылка охлаждается слишком много, и решение начинает застывать, разогреть в микроволновой печи.
   Примечание: Наша плазмиды содержит ампициллиноустойчивости поколенияэ. Таким образом, все шаги должны содержать ампициллин в концентрации 100 мкг / мл. Е. палочка клонирование K12 штамм требуется тетрациклин (12,5 мкг / мл) к антибиотикам. BL21 бактерии клетки не требует никакого дополнительного антибиотик.
4. Налейте 25-30 мл раствора на 90 мм чашки Петри и дать время, чтобы высохнуть.
5. Этикетка блюдо с соответствующими антибиотиками и хранить в обратном порядке в 4 ° С, с парафильмом или в закрывающемся мешке.
   Примечание: Плиты хороши течение приблизительно одного месяца.

3. Клонирование Биотин Tagged плазмиды

Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.

1. Спином вниз плазмиды вектор на 6000 мкг в течение 3 мин для того, чтобы Пелле, и добавить 10 мкл стерилизованной воды высшей степени очистки.
2. Удалить 50 мкл химически компетентную E. палочки клетки высокой эффективности преобразования от -80 ° С и сразу же разместить на льду в течение 5-10 мин.
3. Добавить 1 мкл вектора решения в 0,5-1 ng/5056; л клеток к 50 мкл Е. палочки клетки и поместить оставшиеся плазмиды в -80 ° С
4. Поместите бактерий клеток, содержащих вектор на льду в течение 5 мин.
5. Тепловой удар клетка и вектор смесь в течение 30-45 сек в 42 ° С водяной бане и место клеток обратно на льду в течение 2 мин.
6. Добавить 250 мкл супер оптимального бульоне с катаболитной репрессии (SOC) Среднее (2% вес / об бактотриптона, 0,5% вес / объем Бакто-дрожжевой экстракт, 8,56 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 20 мМ MgSO _4, 20 мМ глюкозы , ультрачистой воды, рН = 7,0) и встряхивают при 250 оборотах в минуту при 37 ° С в течение 30 мин.
   Примечание: SOC не необходимо обрабатывать в автоклаве, но быть стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,22 мкм.
7. Сухие пластины 10-15 мин до посева клеток.
8. Пипетка 25, 50, и 100 мкл раствора клеточной на разных объектах агаровых чашках, содержащих ампициллин (100 мкг / мл) и тетрациклин (12,5 мкг / мл) антибиотиков. Используйте стеклянные бусы распространять решение равномерно пластин агара.
<литий> Выдержите пластины вверх-вниз при 37 ° С в течение 15-18 часов.
9. Проверьте для небольших индивидуальных колоний бактерий на пластинах и хранить в перевернутом положении при 4 ° С до дальнейшего использования (рис. 2А).
   1. Если нет колоний не присутствуют:
      1. Проверьте свежесть и стерильность буферов и расходных материалов.
      2. Увеличьте количество плазмиды добавлен в Е. палочка K12 штамм.
   2. Если крупные колонии имеются или есть разрастание колоний (рис. 2В и 2С), restreak новый агар пластины с помощью стерильной петли прививки или пластины клетки при низком уровне громкости.
10. Инокулировать 5 мл LB, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и тетрациклин (12,5 мкг / мл) антибиотиков с одной колонии трансформированной E. палочки клетки. Grow-вверх клетки в течение ночи при 37 ° С при 250-300 оборотов в минуту.
11. На следующий день, используйте набор для выделения плазмиды для того, чтобы изолировать целевой вектор от ночного ГруW-и хранения очищенной плазмидной при -80 ° С до дальнейшего использования.
    1. Дополнительно: Проверьте чистоту и концентрацию плазмиды с помощью абсорбции чтение, полученной при 260 и 280 нм.

4. Трансформация плазмиды в Expression хост

Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.

1. Повторите шаги 3.2-3.10 для Е. палочка BL21 клетки со следующими изменениями:
   Примечание: BL21 клетки не требует никаких дополнительных антибиотики, поэтому только ампициллин добавляют к чашках с агаром для трансформации.
   1. Добавить 2-5 мкл изолированной плазмиды в 0,5-2 ng/50 мкл клеток от шага 3,12 до 50 мкл Е. палочки принимающие выражение клетки.
   2. Теплового шока клетки для 60-90 сек.
   3. Встряхнуть раствор, содержащий SOC среды при 250 оборотах в минуту в течение 60 мин вместо 30 мин.
2. Срывать одну колонию трансформированных клеток бактерий из чашки Петри с стерIle стержень аппликатора и место в пробирке, содержащей 5 мл LB бульоне с соответствующей концентрации ампициллина (100 мкг / мл).
3. Поместите пробирки в шейкере в течение ночи при 37 ° С при 250 оборотах в минуту.
4. На следующее утро, принять 200 мкл ночной расти вверх и добавить его в 5 мл LB, содержащей ампициллин при 100 мкг / мл.
5. Замораживание вниз оставшиеся клетки с 250 мкл 50% глицерина (стерильной) до 750 мкл культуры и держать в -80 ° C.
   Примечание: Новый тестовое выражение и МАСШТАБА процедуры можно сделать, используя стерильный аппликатор для получения скрип замороженных клеток и прививки LB с соответствующими антибиотиками.
6. Поместите пробирку в шейкере при 250-300 оборотов в минуту при 37 ° С, пока оптическая плотность (OD) не измеряется между 0,7-0,8 при оптической плотности 600 нм.
7. Вызвать клетки с помощью IPTG до конечной концентрации 1 мМ.
8. Взболтать в течение дополнительных 4 ч при 37 ° С при 300 оборотах в минуту. В качестве альтернативы клетки могут такжебыть встряхивали в течение ночи при 18 ° С при 250-300 оборотов в минуту. Это может привести к более высокий выход плазмиды в зависимости от целевого белка.
9. Додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) Анализ экспрессии испытаний
   1. Возьмите 500 мкл культуры и поместить в 1,5 мл трубки. Спин вниз на 13-15 мкг в течение 5 мин. Слейте надосадочную жидкость и этикетка "растворимый". Ресуспендируют осадок с вортексе в 200 мкл загрузочного красителя (50 мкл 2-меркаптоэтанола, 950 мкл буфера Лэммли образец).
      Примечание: Растворимые бактерии гранулы будут использоваться для определения того, рекомбинантный белок в цитоплазматических регионах бактериальных клеток. Гранулы могут быть сохранены в -80 ° C без загрузки краситель до необходимости. Культура управления бактерии, которые не были трансформированы или индуцированный можно рассматривать как растворимые, а также для сравнения.
   2. Возьмите 1000 мкл культуры и поместить в 1,5 мл трубки. Спин вниз на 13-15 мкг в течение 5 мин.Слейте надосадочную жидкость и этикетка "Не растворим."
      Примечание: Нерастворимые гранулы будут проходить процедуры денатурации ниже, для того, чтобы освободить белков, обнаруженных в телах включения клеток бактерий. Гранулы могут быть сохранены в -80 ° С до использования. Культура управления бактерии, которые не были трансформированы или индуцированный можно рассматривать как нерастворимый а также для сравнения.
      1. Ресуспендируют осадок нерастворимого в 200 мкл Bugbuster и оставить при комнатной температуре в течение 30 мин.
      2. Спином вниз образец снова в 13-15 мкг в течение 5 мин и принимать по 50 мкл супернатанта и добавить его в новой «неразрешимых» 1,5 мл трубки.
      3. Затем добавляют 50 мкл загрузочного красителя в этом новом образце.
   3. Варить как растворимые, так и нерастворимые образцы в течение 5 мин для денатурации белков для анализа SDS-PAGE.
   4. Загрузите каждую пробу в геле со стандартной лестницы.
   5. Для того чтобы визуализировать образцы белка использовать staininг реагента и следовать протоколу компании.
   6. Определите, выражает ли белок в растворимой и / или нерастворимых фракций, сравнивая эти две полосы, а также сравнивая полосы в растворимых и нерастворимых полос контроля (см. Примечание 4.9.1 и 4.9.2) на SDS-PAGE гель (рис. 2). Темно группа должна появляются вокруг молекулярной массы белка в растворимыми или нерастворимыми полос. Это будет определять, какие изоляция процедура для использования в Протоколе 6.
      Примечание: Если есть группа в обоих этих регионах, чем любой изоляция используется в Протоколе 6 ниже, могут быть выполнены или белок может быть выделен в обоих направлениях, чтобы определить, какой метод изоляции производит более высокий выход рекомбинантного белка (рис. 3) .
   7. Если час и на ночь индукции 4 был проведен, определить, какой метод индукции имеет самый высокий производство белка для наращивания масштабов процесса (рис. 2).

5. Шкала деятельности Порядок и Главная Культура

1. Подготовка питательной среды с 85,7 г Потрясающе бульоне и 28,8 мл 50% глицерина в 1,8 л воды высшей степени очистки и автоклав на жидком цикла в течение 1 часа.
2. Начните ночной культуры из замороженных клеток складе созданный на шаге 4.5.
   Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.
   1. Смешайте 20 мл LB и с конечной концентрации ампициллина, при 100 мкг / мл в стерильном 125 мл колбу Эрленмейера.
   2. Используя стерильный аппликатор взять слом трансформированной E. палочки клетки и падение аппликатор в колбу. Удалить аппликатор и плагин колбу с пеной пробкой или хлопка и накрыть алюминиевой фольгой, чтобы сохранить стерильность.
   3. Встряхнуть в течение ночи при 250 оборотах в минуту при 37 ° С
3. Главная Культура
   Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.
   1. Налейте ночной культуры в 1,8 л стерильных питательной среды и добавить ампициллин в 100 мкг / мл и от 6 до 8 капель стерильной пеногасителя 204 с использованием пипетки Пастера.
   2. Место культуры в 37 ° C бане воды с 0,2 мм фильтрованный сжатый воздух пузырьков в культурах через аэрации камней.
   3. После того, как OD _{600 нм} достигает 0,7-0,8, индуцируют с помощью IPTG (1 мм) и позволяют индукции происходить либо 4 ч при 37 ° С или в течение ночи при 18 ° С в зависимости от растворимых / нерастворимых результатов SDS-PAGE на шаге 4.9.
4. Сбор E. кишечной клетки
   1. Спином вниз клеточной культуры в 1 л центрифуг бутылок (2 бутылки / культура) в течение 15 мин при 14 000 мкг при 4 ° С.
   2. Слейте супернатант и с помощью тонкой лопаточкой, совок бактерии осаждения на две 50 мл пробирок. Клетки могут быть снова осаждают центрифугированием в течение нескольких минут.
      Примечание: Каждый 1,8 л культуры приведет к двум бактерий гранул, по одному в каждом 50 мл центрифужную пробирку.
   3. Храните гранулы в -80 С до изоляции белка.

6. Выделение и очистка рекомбинантного белка

Примечание: Если белок находится в растворимой регионе на основе анализа SDS-PAGE со стадии 4.9, то "Родной Изоляция" будет использоваться, но для нерастворимые белки "Nonnative изоляции» процедур будет выполнена.

1. Лизиса клеток
   1. Nonnative
      1. Удалить трансформированной E. палочка осадок от -80 ° C морозильник, и добавить 20 мл лизирующего / промывочного буфера (табл. 1) каждому трубки центрифуги.
      2. Vortex и встряхните замороженный шарик, пока он не тает и растворяет в буферный раствор без каких-либо больших кусков. Выдержите на nutator ночь. На следующее утро осадок должны теперь быть собой вязкую суспензию из-за денатурации белка из буфера.
      3. Центрифуга суспензии при 20500 х г при комнатной температуре в течение 30 мин. Передача супернатант в новую пробирку для изоляции и отбросить гранул.
   Родной
   1. Получить превращается Е. палочка осадок от -80 ° C морозильник.
   2. Добавить лизирующего буфера (табл. 1) в центрифужную пробирку, чтобы достичь конечного объема 30 мл и сместить замороженный осадок на вортексе и встряхивания строго. Поместите шарик на льду.
   3. Промыть ультразвукового зонда 70% этанолом при амплитуде 100% в течение 1-2 мин. Затем повторите с особо чистой воды.
   4. Разрушать ультразвуком бактерий осаждения в то время как на льду в течение 5 мин (всего истечении 10 мин).
      1. Установите ультразвукового при амплитуде 30% с импульсом 30 сек on/30 сек выкл.
      2. Боб центрифуги трубки вверх и вниз во интервала обработки ультразвуком для того, чтобы полностью разбить осадок клеток. В конце общего затраченного времени должно быть никаких видимых бактерии не оставляя осаждения волокнистую вязкую суспензию.
      3. Чистку ультразвукового зонда между различными белковыми выделений, а также для хранения с помощью 70% этанола и ультрачистой воды, как описано в шаге 6.1.2.3.
   5. Центрифуга суспензии при 20500 х г при 4 ° С в течение 30 мин. Передача супернатант в новую пробирку для изоляции и отбросить гранул.
2. Ni-NTA аффинной хроматографии
   1. Nonnative
      1. Добавить 1 мл Ni ^{2 +-NTA} смолы решение каждой трубки центрифуги (2 общей смолы мл для 1,8 л культуры) и инкубировать при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 час на nutator.
      2. Налейте суспензии в аффинной колонке и позволяют решение капать через кран клапан полностью в сточные стакан.
      3. Выполните 10 моет с 10 мл Lysis / промывочного буфера для каждой стирки.
         1. В течение первых двух промываний, добавьте 10 мл в центрифужную пробирку, чтобы удалить дополнительную смолу и затем вылить в колонке. Дополнительные моющие средства могут быть добавлены непосредственно в колонну.
         2. После каждой стирки, перемешать смолу с стеклянной мешалки. После того, как мыть капает в стакан с отходами, могут быть добавлены следующие 10 мл.
      4. После мыть полностью дризображений в секунду через, недалеко кран кран, снять отходов стакан и заменить 50 мл трубки центрифуги для сбора белка.
      5. Добавить 15 мл буфера для элюции (табл. 1) и перемешать-до смолы, что позволяет решение сидеть в течение 5 мин. Открыть кран клапан и собирать элюирования. Повторите еще раз с дополнительными 15 мл.
   2. Родной
      1. Следуйте неродном аффинной хроматографии выше (шаги 6.2.1.1-6.2.1.4), за исключением настроить следующие параметры:
         1. Выдержите Ni ^{2 +-NTA} смолы раствор при 4 ° С в течение не менее 1 часа на nutator.
         2. С помощью соответствующего промывочного буфера (табл. 1).
      2. Добавить 5 мл буфера для элюции (табл. 1) и инкубируют со смолой в течение 5 мин.
         1. Открыть кран клапан и не собирать вымывание пока большая часть раствора капала через.
         2. Добавить 90 мкл / лунку Брэдфорд реагент для очистки 96 лунками. После каждого элюирования позволяют 10 мкл такLution капать из колонны в скважину, содержащий 90 мкл Брэдфорд реагента.
         3. Продолжайте добавлением 5 мл буфера для элюции в то время, пока Брэдфорд анализ больше не обнаруживает белок (цвет идет от темно-синего до светло-голубого, чтобы очистить). Это обычно занимает 4-5 объемы элюирования.
3. Диализа / Ренатурация
   1. Сделать неродном (ренатурацию) и родные диализа буферов (табл. 1) и магазин в 4 ° С.
      Примечание: рН диализного буфера определяются изоэлектрической точки белка-мишени в (PI). Как правило белков должны быть помещены в буфер по крайней мере один полный пункт выше или ниже их значений Pi.
   2. Трансфер родные и неродные ELUTIONS в диализной трубке с соответствующим молекулярная масса отсечки (25000 MWCO для ФРН и 50000 MWCO для Sema3A). Место каждого образца белка в соответствующем буфере для диализа 1 в течение 4 часов при 4 ° С, а затем заменить с соответствующим буфером 2 надночь при 4 ° C.
      Примечание: Белок должен быть диализовали в каждом буфере в течение по крайней мере 4 часа для правильного повторной укладки и замены буфера иметь место.
   3. Концентрат диализовали в белковых ELUTIONS до менее чем 5 мл с использованием центрифуги концентраторов.
      Примечание: Белки могут быть дополнительно очищен с помощью быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) и концентрируют снова.
4. Определить концентрацию белка (мг / мл) сушкой вымораживанием образец в 10-50 мл в предварительно взвешенную микроцентрифужную пробирку.
   1. Дополнительно: определить коэффициент поглощения, ε, так что концентрация белка может быть определена в будущих выделений, измеряя поглощение образца при 280 нм с использованием закона Beer-Ламберта: C = A _{280 нм} / εl, где л является длина пути.

7. Биотинилирование очищенного белка

1. Диализировать белков в 10000 MWCO диализа кассеты AGainst 10 мМ Трис (рН = 8,0), заменой буфера каждые 4 ч в общей сложности 6 изменений.
2. Перенесите рекомбинантных белков (в настоящее время в 10 мМ Трис-буфера) в 2 мл микро-трубки центрифуги для биотинилирования.
3. Biotinylate белки, используя лигазную комплект биотин белка.
4. Диализировать белки против PBS (рН = 7,4), используя 10 000 MWCO диализа кассеты с 3 буфера изменяет день в течение 2 дней.
5. Определить процент биотинилирования белков с использованием набора для количественного определения.
6. Определить концентрацию снова, как описано в п. 6.4 и хранить при температуре 4 ° С или аликвоты и хранить при температуре -20 ° С в течение длительного хранения.

Клонирование и испытаний Выражение

Когда покрытие выполняется должным образом, одной изолированной колонии должны сформировать увеличить шансы выщипывание клональная трансформированные клетки бактерий (рис. 2а). Однако, если слишком много клетки высевают, планшеты инкубировали слишком долго при 37 ° С или трансформации сомнительна, колонии может покрывать агаром или образуют более крупные агрегаты клеток (фиг. 2В и 2С). Во время тестового выражения, NGF и Sema3A были впервые индуцировали в течение 4 ч при 37 ° С и анализ SDS-PAGE определяется как белки были расположены в растворимой фракции (рис. 2D). Выражение белка казалась справедливой и поэтому еще одно испытание выражение с индукцией в течение ночи при 18 ° С был рассмотрен. NGF привело к улучшению экспрессии в растворимой фракции, тогда как не было заметной разницы с Sema3A (рис. 2Е).

Оба NGF и Sema3A были изолированы с помощью собственных методов изоляции, как описано в приведенном выше протоколе, и пропускали через колонку FPLC для очистки. Кроме того, эти рекомбинантные белки были выделены и очищены nonnatively. Даже при том, что NGF был в растворимой фракции во время тестового выражения, родные процедуры выделения производится низкий выход NGF после того как и 37 ° C (4,57 мг / основной культуры 2 л) и 18 ° C (6,11 мг / основной культуральной из 2 л; Рисунок 3A, сплошные линии) индукции. Тем не менее, высокий выход NGF был получен через неродного изоляции с ренатурации (10,72 ± 1,8 мг / основной культуры 2 л; фиг.3А, пунктирная линия) после 18 ° C в течение ночи индукции. С другой стороны, неродной изоляция не привело к производству Sema3A (фиг.3В, пунктирная линия) с 8,61 ± 3,1 мг / основной культуры 2 л для нативного изоляции (рис. 3 B, сплошная линия). В результате, NGF был выделен под неродном условиях после ночного индукции при 18 ° С, в то время, Sema3A прошли родной изоляцию 4 ч после индукции при 37 ° С FPLC пики собирали и образцы NGF и Sema3A были проанализированы с ДСН-ПААГ (рис. 3). Дополнительные пики белок, содержащийся в выходе FPLC для Sema3A (рис. 3б) были собраны и проанализированы с ДСН-ПААГ и не были расположены в области молекулярной массы Sema3A. Эти фракции, скорее всего, продукты распада, потому что они не ведут себя функционально в клеточных основе анализов как и пик Sema3A показано на рис 3B. Белки биотинилировали помощью фермента Бира и диализу для удаления любых непрореагировавших видов. Биотинилирование было подтверждено с помощью набора биотин количественной оценки и флуоресцентного микропланшетного.

ftp_upload/51295/51295fig1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51295/51295fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Белковая инженерия использования в E. палочка система экспрессии. Основной процесс рекомбинантного инженерии белка включает проектирование плазмиды для клонирования и экспрессии в E. палочка. Трансформированные колонии отбирали с применением антибиотиков. Небольшой тест выражения используются для оптимизации и идентификации продукции и растворимость белка-мишени. Эта процедура масштабируется, чтобы больших пакетных культивации (литр шкала). Методы хроматографии используются для выделения и очистки желаемого инженерии белка. Модификации, такие как биотинилирования может произойти во время пакетных культивации или после очистки.

Рисунок 2. Оptimizing тест выражение ФРН и Sema3A. (А) Покрытие 25 мкл трансформированных E. палочка K12 клетки привело в небольших изолированных колоний. Человек колонии должны быть выбраны для испытаний выражения. Для BL21 трансформированных клеток Аналогичное распределение колонии должно происходить. (BC) Покрытие 50 мкл и 100 мкл K12 клеток, соответственно, в результате перенаселенности бактериальных колоний. Plucking из этих пластин может привести к более низкой вероятности выбора колонию получены из одной трансформированной клетки. (D) Тестовые выражения трансформированных клеток были индуцированы в течение 4 часов при 37 ° С с помощью IPTG и SDS-PAGE показывает, что NGF слитый белок (29 кДа) и Sema3A слитый белок (91 кДа) выражены в растворимой фракции. (E) Быстро индукции при 18 ° С показана экспрессия NGF еще в растворимой фракции, однако выражение для Sema3A не увеличивается.

Рисунок 3. Очистка ФРН и Sema3A использованием FPLC. (А) Nonnative изоляции после 18 ° С в течение ночи индукции (пунктирная линия) в результате повышения урожайности NGF по сравнению с родной изоляции на обоих 4 ч, 37 ° С и в течение ночи 18 ° C индукции (сплошные линии). (B) Для Sema3A, индукции при 37 ° С в течение 4 часов и родной состоянии изоляции производится лучшие выходы по сравнению с неродного изоляции при тех же параметрах культивирования. SDS-PAGE показывает FPLC пиковые коллекции (стрелки) для обоих (А) ФРН и (B) Sema3A. Стандартного белка гель-фильтрации проводили для подтверждения молекулярно-массовое распределение пиков и указывается в фоне FPLC участков в кДа.

Таблица 1. Рекомбинантный белок изоляции буферов.

Рекомбинантный инженерно белок является очень мощная техника, которая охватывает множество дисциплин. Он является экономически эффективным, перестраиваемый и относительно простая процедура, что позволяет производство высокими выходами специально разработанных белков. Важно отметить, что проектирование и выражая белки-мишени не всегда просто. Базальной выражение и рекомбинантный стабильность белков зависит от конкретных вариантов вектора, E. штаммы кишечной клеток, дополнения тегов пептидные и параметры культивирования. Наша своеобразным критерием дизайн использует хорошо организованной E. палочка штаммы для белковой инженерии. Кроме того, плазмидный вектор содержит Т7 промотор и лаковые ген устойчивости к ампициллину для стабильной экспрессии рекомбинантного белка.

После получения высокоочищенного субклонировали плазмиды, первый крупный процедура успешно трансформировать целевого белка в клетке-хозяине и определить растворимостьбелок. Тестовые выражения лучшее время, чтобы оптимизировать синтез белка-мишени. Важно, чтобы сорвать небольших изолированных колоний (рис. 2а), чтобы обеспечить лучший выбор бактериальных клеток, содержащих плазмиду. Устранение неполадок стратегии, такие как повторного посева штрихом перераспределить колонии или инкубации агаром на более короткие периоды времени может помочь в лучших колонии образований. Не удивительно, что рекомбинантного белка вызывает напряжение на штамма-хозяина ^36. На этом этапе, если выражение является бедным, такие факторы, как антибиотик и концентрации IPTG, а также времени индукции и температуры можно регулировать для достижения оптимального целевого белка (см. обзоры ^37-38). Это было расценено для ФРН, где лучшее выражение в результате индукции в течение ночи при 18 ˚ С (рис. 2Е).

Sema3A привело к продукции белка для нативных условиях, но nonnativэ изоляция не показали производство белка (рис. 3б). Основные культуры NGF индуцировали в течение 4 часов при 37 ˚ С, а также в течение ночи при 18 ˚ С и выделяют при нативных условиях. Очистка FPLC производства более низкий выход NGF по сравнению с основными культурами, которые были выделены nonnatively после индукции в течение ночи при 18 ˚ С (фиг.3А). Образование белков в телец включения, как правило, считается нежелательным, поскольку ренатурация иногда трудно и не всегда успешно. Это привело к разработке методик для повышения растворимости белка в том числе добавлением растворимых белковых последовательностей ^39-41. Однако белки, как было показано, обладают формы конформационных состояний в то время как выделен в телец включения, и такие параметры, как более низких температурах индукционных помогают поддерживать эти активные структуры ^42-46. Когда белок может быть экспрессирован только в нерастворимую форму обычно можно повторноприрода белка после выделения с помощью простых методов с очень небольшим потери урожая, как мы уже сообщали ранее ^21.

Мы показали, как успешно инженер и производить biotinylatable белки с помощью E. палочка клонирование и система экспрессии, как хозяин уступая около 8-10 мг / основной культуры 2 Л. Важно отметить, что в целом последовательность событий остается тем же при производстве новых рекомбинантных белков (рис. 1), однако, каждый заказ сделал белка должны рассматриваться на индивидуальной основе, чтобы определить, как конкретно производить наибольший выход очищенного продукта. Мы показали, как ФРН и Sema3A ведут себя иначе, в той же системе выращивания и как оптимизировать свое производство. Кроме того, мы в настоящее время с помощью другого E. палочка B штамм-хозяин, который может biotinylate в естественных условиях ⁴⁷ для других белков-мишеней, демонстрируя важность сидячая забастовкаг хорошо информированы о текущих достижений и изменений, касающихся рекомбинантного инженерии белка.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Авторы хотели бы выразить признательность в Университете Акрона за финансирование, которое поддерживает эту работу.