ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

יש לפתח חלבוני היתוך biotinylatable יישומים פוטנציאליים רבים בתחומים שונים של מחקר. הנדסת חלבון רקומביננטי היא הליך ישר קדימה כי הוא חסכוני, המספק תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד.

הנדסת חלבונים רקומביננטיים ניצלה חיידקי Escherichia מערכות (E. coli) ביטוי לכמעט 4 עשורים, והיום ה coli הוא עדיין אורגניזם מארח בשימוש נרחב ביותר. הגמישות של המערכת מאפשרת התוספת של moieties כגון תג ביוטין (עבור אינטראקציות streptavidin) וחלבונים תפקודיים גדולים יותר כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק או חלבון אדום דובדבן. כמו כן, השילוב של חומצות אמינו לא טבעיות כמו chelators יון מתכת, קבוצות פונקציונליות ייחודי תגובתי, בדיקות ספקטרוסקופיות, ומולקולות הקניית לאחר translational שינויים אפשר מניפולציה טובה יותר של תכונות חלבון ופונקציונליות. כתוצאה מכך בטכניקה זו יוצרת חלבוני היתוך להתאמה אישית שמציעים כלי משמעותי לתחומי מחקר שונים. באופן ספציפי יותר, רצף חלבון biotinylatable כבר שולב לתוך חלבוני יעד רבים בגלל האינטראקציה זיקה הגבוהה בין ביוטין עם avidin וstreptavidin. תוספת זו סייעה בשיפור זיהוי וטיהור של חלבונים מתויגים, כמו גם לפתוח דרך ליישומים משניים כגון מיון תא. לכן, מולקולות שכותרתו ביוטין להראות השפעה גוברת ונרחבת בתחומים bioindustrial ויו. לצורך המחקר שלנו יש לנו מהונדס חלבוני היתוך biotinylated רקומביננטי המכילים גורם עצב צמיחה (NGF) וsemaphorin3A (Sema3A) אזורים פונקציונליים. יש לנו דיווח בעבר כיצד חלבוני היתוך biotinylated אלה, יחד עם רצפי חלבון פעילים אחרים, יכולים להיות קשורים לחומרים ביולוגיים להנדסת רקמות ומטרות רגנרטיבית. פרוטוקול זה מתאר את היסודות של חלבוני biotinylatable ההנדסה בקנה מידת מיליגרם, ניצול וקטור T7 Lac מושרה וא מארחים coli ביטוי, החלו משינוי בהיקף של למעלה וטיהור.

חלבונים לכסות טווח רחב של ביומולקולות כי הם אחראים לתפקודים ביולוגיים רבים, סופו של דבר מוביל להיווצרות רקמה תקינה וארגון. מולקולות אלה ליזום אלפי איתות מסלולים השולטים עד ויסות ו / או למטה רגולציה של גנים וחלבונים אחרים, שמירה על שיווי משקל בגוף האדם. שיבוש של חלבון יחיד משפיע על אינטרנט זה שלם של אותות, אשר יכול להוביל להתפרצות של הפרעות או מחלות הרסניות. הנדסת חלבונים בודדים במעבדה מציעה פתרון אחד למאבק בתופעות הלוואי הללו ומציע אלטרנטיבה לתרופות מולקולה קטנות. ב1977, גן מקודד רצף סומטוסטטין חומצת אמין 14 היה אחד מפוליפפטידים הראשונים המהונדסים שנוצרו באמצעות ה coli ^1. זמן קצר לאחר מכן בשנת 1979, אינסולין שובט בפלסמיד pBR322, שינה, בא לידי ביטוי, ומטוהר ^2. מאז, חלבונים רקומביננטיים הרחיבו את השפעתם לשדות מרובים של מילearch כגון חומרים ביולוגיים, אספקת סמים, הנדסת רקמות, Biopharmaceuticals, חקלאות, אנזימים תעשייתיים, דלק ביולוגי, וכו '(לביקורות לראות אזכור ^3-8). זה נובע במידה רבה צדדיות שהטכניקה מציעה באמצעות התוספת של moieties היישום הספציפי הכימי או רצפי חלבונים למטרות כוללים, אך לא מוגבלת, לזיהוי חלבון המטרה, ייצוב וטיהור.

באמצעות טכנולוגיית ה-DNA רקומביננטי, יכולים לבוא לידי ביטוי חלבונים רקומביננטיים במגוון רחב של מערכות מארח אוקריוטים פרוקריוטים ובכלל זה, צמח, חרק, שמרים, פטריות, חיידקים או יונקים. כל מארח מציע יתרונות שונים, ובדרך כלל את המערכת הטובה ביותר נקבעה בהתבסס על תפקוד חלבון, תשואה, יציבות, עלות כוללת, ויכולת רחבה. תאי חיידקים לעתים קרובות חסרים את מנגנוני השינוי לאחר translational שמארחי אוקריוטים לספק (כלומר glycosylation, גישור דיסולפיד, דואר TC.) ^5. כתוצאה מכך, מערכות של יונקים וחרקים בדרך כלל תוצאה של תאימות טובה יותר וביטוי של חלבוני אוקריוטים, אולם המארחים אלה הם בדרך כלל יקרים יותר ^ו9 זמן רב. לכן, א ' coli הוא המארח המועדף עבור מערכת הביטוי שלנו, כי תאים להתרחב במהירות בתנאי גידול זולים ומנגנוני ביטוי הגנטיים הם הבינו ^5,9 כן. בנוסף, מערכת זו היא קלה בקנה מידה, למטרות ייצור ותוצאות בחלבונים תפקודיים למרות העדר לאחר translational השינויים ^10. E. זן החיידק K12 נבחר בפרוטוקול זה לשיבוט כי זן זה מציע תשואות פלסמיד מצוינות המבוססות על יעילות שינוי גבוהה. בנוסף, א ' זן החיידק BL21 מנוצל לביטוי בגלל מתח מארח זה מכיל את גן RNA פולימראז T7 המספק ביטוי חלבון בשליטה ויציבות ^11.

ביטויי מבחן (תרבויות בקנה מידה קטנה) משמשים כדי לקבוע את הנוכחות ומסיסות של חלבון המטרה, שיכול לבוא לידי ביטוי בכל צורה מסיסה או לא מסיס לגבש נהלי טיהור. חלבון מסיס הביע בתוך תא החיידק יעבור קיפול ספונטני כדי לשמור על המבנה המקורי שלו ^19. בדרך כלל הילידיםהמבנה הוא חיובי thermodynamically. במקרים רבים את הפעילות המטבולית של המארח היא לא תורמת לחלבון המטרה, שימת דגש על מערכת שמובילה לייצור חלבון מסיס והיווצרותם של גופי הכללה מורכבים מאגרגטים חלבון לא מסיסים. כך חלבון מטרת denatures, טיוח אותם בדרך כלל פעיל מבחינה ביולוגית ^20. ביטויי הבדיקה שניהם טיפסו למעלה, ונהלי בידוד נקבעים על ידי המסיסות של חלבון המטרה. Renaturation נוסף או refolding צעד נדרש לחלבונים בלתי מסיסים. חלבונים רקומביננטיים וכתוצאה מכך יכולים להיות מטוהרים נוסף באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל.

בבית של ייצור חלבון רקומביננטי מציע יתרונות עלות על מוצרים מסחריים מאז מיליגרם חלבון המטרה של יכול להיות מבודד לליטר של התרבות העיקרית. רוב הציוד הנדרש זמין במעבדה ביולוגית או כימית טיפוסית. הנדסת חלבונים מאפשרת יצירהשל חלבוני היתוך מותאם אישית עם פונקציות הוסיפו שאינן תמיד זמינים באופן מסחרי. איור 1 מתאר את הנהלים העיקריים מעורבים בחלבונים רקומביננטיים הנדסה. עם מערכת ביטוי זה שיצרנו חלבונים רבים biotinylatable, כגון אינטרפרון גמא, נגזר גורם גדילה של טסיות דם, וחלבון עצם morphogenetic ^21-23, אך אנו נתמקד בשני חלבונים שמיועדים להדרכה האקסון, NGF (29 kDa ) וSema3A (91 KDA) ¹⁰ (לסקירה ראה התייחסות ^24). Biotinylation הוא טכניקה נפוצה לזיהוי, חוסר תנועה ובידוד של חלבונים שכותרתו ניצול האינטראקציה ביוטין-streptavidin הידוע ^25-27. בדיקות Biophysical ^28,29, biosensors ^30, ונקודות קוונטיות ^{ביום 31 בכמה} דוגמאות של מערכות המנצלות את הזיקה הגבוהה של נטיה ביוטין-streptavidin עם _ד K על סדר 10 ^-15 M ^27. E. יו coliהאנזים פח, בירה, מסייע בקובץ המצורף קוולנטיים של ביוטין לשרשרת צד ליזין נמצאת בתוך ביוטין מתויג רצף ^18,32. ביוטין קשירה לחומרים וביומולקולות ייצר אספקה ​​מתמשכת של גורמי גדילה של תאים עבור יישומי הנדסת רקמות מרובים ^21,33-35. לכן, הנדסת חלבוני biotinylatable המותאם במיוחד אלה היא כלי רב עוצמה שיכול להתעלות מעל אינטרסים מחקר מרובים.

1. עיצוב של חלבון המטרה

1. באמצעות המרכז הלאומי לאתר מידע ביוטכנולוגיה (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) להשיג רצף אמינו לחלבון המטרה לקחת בחשבון את המין של עניין וכל גרסאות אחוי. בחר את רצף החומצות האמיניות שמתאים לאיזור הפעיל בעניין של החלבון.
   הערה: לקבלת Sema3A, חומצות אמינו 21-747 נבחרו. חלבון היתוך נועד עם NGF בו הרצף של barstar, חומצת אמינו 1-90, התווסף לחומצות אמינו NGF 122-241.
2. לN-סופית להוסיף את הרצפים הבאים: תג 6X-לטיהור (hhhhhh), וירוס הטבק Etch (TEV) אתר פרוטאז לחתוך להסרת התג שלו (ENLYFQG), ביוטין מתויג רצף לbiotinylation של חלבון בK (GLNDIFEAQKIEWHE) וציר גמיש עם פערים שיאפשר מקום לrefolding חלבון התקין (EFPKPSTPPGSSGGAP).
   הערה: רצפים אלה יכולים להשתנות בהתאם לprot ההיתוך הרצויעין.
3. שלח רצף חומצות אמינו מלא לחברה לעיצוב / אופטימיזציה של גן למיני מארח רצוי וסינתזה. Subclone לתוך וקטור של בחירה באמצעות אתר BamHI-NotI באמצעות ערכה או על ידי שימוש בשירותים מסחריים.

2. מה שהופך את צלחות אגר

הערה: חשוב מאוד שכל המניות של אנטיביוטיקה, צלחות, מאגרים, ועוד מאוחסנות כראוי (טמפרטורה ומשך זמן) ולהישאר חופשי של פרוטאזות (עיקור).

1. לשקול את אגר ב1.5 WT% ומרק lysogeny (LB) ב20 גר '/ ליטר ומקום בבקבוק זכוכית תקשורת. בקבוק מיליליטר 500 עושה 15 על צלחות.
2. Volumetrically להוסיף מים ultrapure, ומערבב היטב, וחיטוי.
3. בוא מגניב בקבוק למגע ומוסיף את האנטיביוטיקה המתאימה. הימנע מיצוק המוקדם של אגר, אך אם בקבוק מתקרר יותר מדי ופתרון מתחיל להתקרש, לחמם במיקרוגל.
   הערה: פלסמיד שלנו מכיל התנגדות אמפיצילין genדואר. לכן, כל הצעדים חייבים לכלול אמפיצילין ב100 מיקרוגרם / מיליליטר. E. זן K12 שיבוט coli דורש טטרציקלין (12.5 מיקרוגרם / מיליליטר) לאנטיביוטיקה. תאי חיידקי BL21 לא דורשים שום אנטיביוטיקה נוספת.
4. יוצקים 25-30 מיליליטר של תמיסה לתוך 90 מ"מ צלחות פטרי ולאפשר זמן לייבוש.
5. מנה תווית עם אנטיביוטיקה מתאימה וחנות הפוכה ב 4 ° C, עם Parafilm או בשקית ניתנת לאטימה חוזרת.
   הערה: צלחות הן טובות במשך כחודש.

3. שיבוט של ביוטין תייג פלסמיד

הערה: תנאים נעשים סביבה נקיה מחיידקים.

1. ספין למטה וקטור פלסמיד ב6,000 XG במשך 3 דקות כדי גלולה, ולהוסיף 10 μl מים ultrapure מעוקרים.
2. הסר 50 μl של E. כימי המוסמך תאי יעילות שינוי גבוהה coli מ-80 מעלות צלזיוס ומייד מניחים על קרח ל5-10 דק '.
3. הוסף 1 μl של פתרון הווקטור ב0.5-1 ng/50תאי l לμl 50 א; 56 תאי coli ולמקם את פלסמיד שנותר ב-80 ° C.
4. מניחים את תאי חיידקים המכילים את הווקטור על קרח למשך 5 דקות.
5. הלם חום התא ותערובת וקטור ל30-45 שניות ב42 תאי אמבטיה ° C מים ומקום לחזור על קרח במשך 2 דקות.
6. הוסף 250 μl של מרק סופר אופטימלי עם דיכוי catabolite בינוני (SOC) (2% w / bacto-tryptone v, 0.5% w / תמצית v bacto-שמרים, 8.56 mM NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 20 מ"מ MgSO _4, 20 מ"מ גלוקוז , מים ultrapure; pH = 7.0) ולנער ב250 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
   שים לב: לא צריך להיות autoclaved SOC אבל להיות מסנן מעוקר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
7. צלחות יבשים 10-15 דקות לפני תאי ציפוי.
8. 25 פיפטה, 50, ושל פתרון תא 100 μl על גבי צלחות אגר נפרדות המכילות אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) וטטרציקלין (12.5 מיקרוגרם / מיליליטר) אנטיביוטיקה. השתמש בחרוזי זכוכית להפיץ פתרון באופן שווה על צלחות אגר.
9. דגירה צלחות הפוכה ב37 מעלות צלזיוס למשך 15-18 שעות.
10. בדקו אם מושבות חיידקים בודדים קטנות על צלחות ולאחסן הפוך על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף (איור 2 א).
    1. אם לא מושבות נמצאות:
       1. בדוק את הטריות וסטריליות של מאגרים ואספקה.
       2. להגדיל את כמות הפלסמיד הוסיפה לE. זן החיידק K12.
    2. אם מושבות גדולות נמצאות או שיש צמיחת יתר של מושבות (איור 2B ו 2 ג), restreak צלחת אגר חדשה באמצעות חיסון לולאת סטרילי או תאי צלחת בנפח נמוך יותר.
11. לחסן 5 מיליליטר LB המכיל אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ואנטיביוטיקה מסוג טטרציקלין (12.5 מיקרוגרם / מיליליטר) עם מושבה אחת של א 'הפכה תאי coli. תאים גדלים למעלה לילה ב C ° 37 ב250-300 סל"ד.
12. למחרת, השתמש בערכת בידוד פלסמיד כדי לבודד את וקטור היעד מ Gro הלילהw-up ופלסמיד חנות מטוהרת ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
    1. אופציונאלי: בדוק טוהר וריכוז של פלסמיד באמצעות קריאת הספיגה מתקבלת ב260 ו280 ננומטר.

4. טרנספורמציה של פלסמיד למארח ביטוי

הערה: תנאים נעשים סביבה נקיה מחיידקים.

1. חזור על שלבים 3.2-3.10 לE. תאי coli BL21 עם השינויים הבאים:
   הערה: תאי BL21 לא דורשים שום אנטיביוטיקה נוספת, ולכן רק אמפיצילין מתווסף לצלחות אגר לשינוי.
   1. להוסיף 2-5 μl של פלסמיד המבודד ב0.5-2 ng/50 תאי μl מצעד 3.12-50 μl E. תאי מארח ביטוי coli.
   2. תאי הלם חום ל60-90 שניות.
   3. Shake בינוני SOC תמיסה המכילה ב250 סל"ד 60 דקות במקום 30 דקות.
2. למרוט מושבה אחת של תאי חיידקים הפכו מצלחת פטרי עם sterמקל ile המוליך ומקום במבחנה המכילה 5 מיליליטר מרק LB עם הריכוז המתאים של אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מיליליטר).
3. הנח מבחנות שבייקרו לילה בשעה 37 ° C ב 250 סל"ד.
4. למחרת בבוקר, לקחת 200 μl של לגדול למעלה הלילה ולהוסיף אותו ל5 מיליליטר LB המכיל אמפיצילין ב100 מיקרוגרם / מיליליטר.
5. להקפיא את התאים שנותרו עם 250 μl גליצרול 50% (סטרילי) לתרבות μl 750 ולשמור ב-80 ° C.
   הערה: ביטוי מבחן חדש ונהלים בהיקף של עד ניתן לעשות זאת על ידי שימוש במוליך מקל סטרילי כדי להשיג גירוד של תאים קפואים וכך גם ייחס LB עם האנטיביוטיקה המתאימה.
6. מקם מבחנה שבייקרה ב250-300 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס עד לצפיפות אופטית (OD) נמדדת בין 0.7-0.8 בספיגה של 600 ננומטר.
7. לגרום לתאים עם IPTG בריכוז סופי של 1 מ"מ.
8. לנער במשך 4 שעות נוספות בבית C ° 37 ב300 סל"ד. לחלופין תאים גם יכוליםלהיות מזועזע לילה בשעה 18 ° C ב 250-300 סל"ד. זה יכול לייצר תשואה גבוהה יותר של פלסמיד בהתאם לחלבון המטרה.
9. נתרן Dodecyl סולפט polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ניתוח של ביטוי מבחן
   1. קח 500 μl של תרבות ומקום בצינור 1.5 מיליליטר. ספין למטה ב13-15 XG במשך 5 דקות. יוצקים את נוזל supernatant ותווית "מסיס". Resuspend גלולה עם vortexing ב200 μl של צבע טעינה (50 μl 2-mercaptoethanol, חיץ מדגם Laemmli 950 μl).
      שים לב: כדורי חיידקים מסיסים ישמשו כדי לקבוע אם חלבון רקומביננטי הוא באזורי cytoplasmic של תאי חיידקים. ניתן לאחסן את פלטות ב-80 מעלות צלזיוס מבלי לטעון לצבוע עד צורך. תרבות חיידקי שליטה שלא השתנו או מושרה ניתן להתייחס אליהם כמסיסה, כמו גם לשם השוואה.
   2. קח 1,000 μl של תרבות ומקום בצינור 1.5 מיליליטר. ספין למטה ב13-15 XG במשך 5 דקות.יוצקים את נוזל supernatant ותווית "בלתי מסיס".
      שים לב: כדורים מסיסים יעברו הליכי denaturation להלן על מנת לשחרר חלבונים הנמצאים בגופי הכללה של תאי חיידקים. ניתן לאחסן את פלטות ב-80 ° C עד צורך. תרבות חיידקי שליטה שלא השתנו או מושרה ניתן להתייחס אליהם כבלתי ניתן לפתרון, כמו גם לשם השוואה.
      1. Resuspend את הכדור מסיס ב200 μl Bugbuster ומשאירים בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
      2. ספין למטה מדגם שוב ב13-15 XG במשך 5 דקות ולקחת 50 μl של supernatant ולהוסיף אותו "בלתי מסיס" חדש 1.5 צינור מיליליטר.
      3. לאחר מכן להוסיף 50 μl של טעינת צבע למדגם חדש זה.
   3. מרתיחים שני דגימות מסיסים ובלתי מסיסים במשך 5 דקות כדי לפגל חלבונים לניתוח SDS-PAGE.
   4. לטעון כל דגימה לג'ל אלקטרופורזה עם סולם סטנדרטי.
   5. על מנת להמחיש את דגימות החלבון להשתמש staininמגיב גרם ופעלו הפרוטוקול של החברה.
   6. לקבוע האם החלבון מבטא בשברים המסיסים ו / או לא מסיסים על ידי השוואת שני נתיבים אלה, כמו גם השוואה בין הנתיבים לנתיבי שליטה המסיסים ובלתי מסיסים (ראה באור 4.9.1 ו4.9.2) על ג'ל SDS-PAGE (איור 2). להקה אפלה אמורה להופיע סביב המשקל המולקולרי של החלבון בנתיבים המסיסים או לא המסיסים. זה יקבע שהליך הבידוד להשתמש בפרוטוקול 6.
      הערה: אם יש להקה בשני אזורים אלה מאשר או בידוד בשימוש בפרוטוקול 6 להלן יכול להתבצע, או החלבון יכול להיות מבודד לשני הכיוונים על מנת לקבוע איזו שיטת בידוד מייצרת תשואה גבוהה יותר של חלבון רקומביננטי (איור 3) .
   7. אם אינדוקציה שעה ולינה 4 נערכה, לקבוע אילו אינדוקציה שיטה יש את ייצור החלבון הגבוה ביותר לתהליך הסולם למעלה (איור 2).

5. סולם למעלה נוהל ותרבות ראשי

1. הכן תקשורת צמיחה עם 85.7 גרם של מרק נהדר ו28.8 מיליליטר של גליצרול 50% ב1.8 ליטר מים ultrapure וחיטוי על מחזור נוזלי במשך שעה 1.
2. התחל תרבות לילה ממניות תא קפוא יצרו בשלב 4.5.
   הערה: תנאים נעשים סביבה נקיה מחיידקים.
   1. מערבבים 20 מיליליטר של LB ועם ריכוז סופי של אמפיצילין ב100 מיקרוגרם / מיליליטר במיליליטר בקבוק Erlenmeyer סטרילי 125.
   2. באמצעות המוליך מקל סטרילי לקחת מבטל של א 'הפכה תאי coli ומוליך טיפה לתוך הבקבוק. הסר המוליך מקל ובקבוק עם פקק התוספת קצף או כותנה ומכסה ברדיד אלומיניום כדי לשמור על סטריליות.
   3. Shake הלילה בשעה 250 סל"ד ב 37 ° C.
3. תרבות העיקרית
   הערה: תנאים נעשים סביבה נקיה מחיידקים.
   1. יוצקים תרבות הלילה לתוך 1.8 L של תקשורת צמיחה סטריליים ולהוסיף אמפיצילין ב100 מיקרוגרם / מיליליטר ו 6 עד 8 טיפות של antifoam סטרילי 204 באמצעות פיפטה פסטר.
   2. תרבויות מקום באמבט מים C ° 37 עם 0.2 מ"מ המסונן מבעבע אוויר דחוס לתרבויות דרך אבני אוורור.
   3. ברגע _ש600nm OD מגיע 0.7-0.8, לגרום לעם IPTG (1 מ"מ) ולאפשר אינדוקציה להתרחש גם עבור 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס או לילה ב 18 מעלות צלזיוס בהתאם לתוצאות מסיסים / לא מסיסות מ- SDS בשלב 4.9.
4. איסוף E. תאי coli
   1. ספין למטה תרבית התאים בבקבוקי 1 צנטריפוגות L (2 בקבוקים / תרבות) ל15 דקות ב 14,000 XG ב 4 ° C.
   2. יוצקים את supernatant ובעזרת מרית דקה, סקופ חיידקי גלולה לשני 50 צינורות מיליליטר. ניתן pelleted התאים שוב על ידי צנטריפוגה במשך כמה דקות.
      הערה: כל תרבות 1.8 L תביא שני כדורי חיידקים, אחד בכל צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר.
   3. כדורי חנות ב-80 C עד בידוד חלבון.

6. בידוד וטיהור של חלבון רקומביננטי

שים לב: אם החלבון ממוקם באזור מסיס המבוסס על ניתוח SDS-PAGE מצעד 4.9 אז "בידוד ילידים" ישמש, אבל לחלבונים מסיסים נהלים "בידוד nonnative" יבוצע.

1. תמוגה תא
   1. Nonnative
      1. הסר הפך E. coli גלולה ממקפיא -80 מעלות צלזיוס, ולהוסיף 20 מיליליטר תמוגה / הצפת לשטוף (טבלה 1) לכל צינור צנטריפוגות.
      2. ורטקס ולנער את הכדור הקפוא עד שהוא מפשיר וsolubilizes לפתרון החיץ ללא כל נתחים גדולים. לדגור על nutator לילה. למחרת בבוקר, את הכדור צריך להיות עכשיו slurry צמיג בשל denaturing של החלבון מהמאגר.
      3. צנטריפוגה slurry ב20,500 XG בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. מעביר את supernatant לצינור טרי לבידוד וזורקים את הכדור.
   2. Native
      1. E. השג הפך גלולה coli ממקפיא -80 מעלות צלזיוס.
      2. הוספת תמוגה חוצץ (טבלת 1) לצינור צנטריפוגות כדי להגיע לנפח סופי של 30 מיליליטר, ולסלק גלולה קפואה vortexing ורועד בקפדנות. הנח גלולה על קרח.
      3. שטוף sonicator בדיקה עם 70% אתנול במשרעת 100% ל1-2 דקות. לאחר מכן חזור עם מים ultrapure.
      4. חיידקי Sonicate גלולה ואילו על קרח למשך 5 דקות (זמן שחלף כולל של 10 דקות).
         1. הגדר sonicator במשרעת 30% עם דופק של 30 שניות on/30 שניות משם.
         2. צינור צנטריפוגות בוב למעלה ולמטה בפרק זמן sonication כדי לשבור לגמרי את התא גלולה. בסופו של הזמן שחלף בסך הכל לא צריכה להיות שום חיידקים גלויים גלולה עוזבים slurry סיבי, צמיג.
         3. נקה את חללית sonicator בין בידודי חלבון שונים, כמו גם לאחסון באמצעות 70% אתנול ומים ultrapure כמתואר בשלב 6.1.2.3.
      5. צנטריפוגה slurry ב20,500 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מעביר את supernatant לצינור טרי לבידוד וזורקים את הכדור.
2. Ni-נ.ת. ע זיקה כרומטוגרפיה
   1. Nonnative
      1. הוסף 1 מיליליטר Ni ^{2 +-נ.ת.} ע פתרון שרף לכל צינור צנטריפוגות (2 סך הכל שרף מיליליטר לתרבות 1.8 L) ולדגור על RT במשך שעה לפחות 1 על nutator.
      2. יוצקים תרחיף לעמודת זיקה ולאפשר פתרון לטפטף דרך שסתום ברזלים לחלוטין לתוך כוס פסולת.
      3. בצע 10 שוטף עם 10 מיליליטר של תמוגה / הצפת לשטוף לכל שטיפה.
         1. לשתי שטיפות הראשונות, להוסיף 10 מיליליטר לצינור צנטריפוגות כדי להסיר שרף נוסף ולאחר מכן שופך לתוך עמודה. ניתן להוסיף שוטף נוסף ישירות לעמודה.
         2. לאחר כל שטיפה, מערבב את השרף עם מוט בחישת זכוכית. ברגע השטיפה מטפטפת לתוך הכוס פסולת, ניתן להוסיף ליד 10 מיליליטר.
      4. לאחר לשטוף לגמרי drIPS דרך, שסתום ברזלים קרובים, להסיר כוס פסולת ולהחליף עם 50 מיליליטר צינור צנטריפוגות לאיסוף חלבון.
      5. הוסף 15 מיליליטר של הצפת elution (טבלת 1) ומערבבים-up שרף, המאפשר פתרון לשבת במשך 5 דקות. שסתום פתוח ברזלים וelution גוביינא. חזור על פעולה שוב עם 15 מיליליטר נוסף.
   2. ילידים
      1. עקוב nonnative הזיקה כרומטוגרפיה לעיל (שלבי 6.2.1.1-6.2.1.4) אלא להתאים את הפרמטרים הבאים:
         1. דגירה Ni ^{2 +} פתרון שרף-נ.ת. ע על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 על nutator.
         2. השתמש בהצפה לשטוף המתאימה (טבלת 1).
      2. הוסף 5 מיליליטר של הצפת elution (טבלת 1) ו דגירה עם שרף במשך 5 דקות.
         1. שסתום ברזלים פתוח ולאסוף elution עד שרוב הפתרון שטפטף דרכו.
         2. הוספת 90 μl / טוב של מגיב ברדפורד כדי לנקות את צלחת 96 היטב. לאחר כל elution לאפשר 10 μl של כל כךlution לטפטף מעמודה לתוך היטב המכיל 90 מגיב ברדפורד μl.
         3. להמשיך ולהוסיף 5 מיליליטר הצפת elution בכל פעם עד assay ברדפורד כבר לא מזהה חלבון (צבע עובר מכחול כהה לכחול בהיר כדי לנקות). זה בדרך כלל לוקח כרכים elution 4-5.
3. דיאליזה / renaturation
   1. הפוך nonnative (renaturation) ומאגרים האם של דיאליזה (טבלה 1) ולאחסן ב 4 ° C.
      הערה: ה-pH של מאגרי הדיאליזה נקבעות על ידי הנקודה איזואלקטרית של חלבון המטרה (PI). ככלל חלבוני אגודל צריך להיות שנאגרו נקודה מלאה אחת לפחות מעל או מתחת לערכי PI שלהם.
   2. העבר elutions ילידי nonnative וצינורות דיאליזה עם חתך מתאים מולקולרי משקל (25,000 MWCO לNGF ו50,000 MWCO לSema3A). מניחים כל מדגם חלבון במאגר דיאליזה בהתאמה 1 עבור 4 שעות ב 4 ° C ולאחר מכן להחליף עם חיץ בהתאמה 2 מעלהלילה ב 4 ° C.
      הערה: חלבון צריך להיות dialyzed במאגר זה לפחות 4 שעות לrefolding ראוי וחיץ חילופי להתקיים.
   3. להתרכז elutions חלבון dialyzed פחות מ 5 מיליליטר באמצעות ריכוז ספין צנטריפוגות.
      הערה: עוד יכולים להיות מטוהרים חלבונים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) והתרכזו שוב.
4. קביעת ריכוז חלבון (מ"ג / מיליליטר) על ידי הקפאת ייבוש מדגם 10-50 מיליליטר בצינור microcentrifuge preweighed.
   1. אופציונאלי: לקבוע מקדם הכחדה, ε, ולכן ריכוז של חלבון ניתן לקבוע בבידודים בעתיד על ידי מדידת הספיגה של מדגם ב280 ננומטר באמצעות החוק של באר למברט: C = _280nm / εl, כאשר L הוא אורך הדרך.

7. Biotinylation של חלבון מטוהר

1. Dialyze חלבונים ב10,000 AG קלטות הדיאליזה MWCOainst 10 מ"מ טריס (pH = 8.0), לשנות את החיץ בכל שעה 4 עם סך של 6 שינויים.
2. מעביר את החלבונים רקומביננטיים (כיום ב10 חיץ מ"מ טריס) ל 2 צינורות מיליליטר מיקרו צנטריפוגות במשך biotinylation.
3. חלבוני Biotinylate באמצעות ערכת האנזים חלבון ביוטין.
4. Dialyze חלבונים נגד PBS (pH = 7.4) באמצעות 10,000 קלטות דיאליזה MWCO עם 3 חיץ משנה ביום למשך 2 ימים.
5. לקבוע את biotinylation אחוזים מחלבונים באמצעות ערכת quantitation.
6. קבע את הריכוז שוב כפי שמתואר ב6.4 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס או aliquot ולאחסן ב -20 ° C לאחסון ארוך טווח.

שיבוט וביטוי מבחן

כאשר ציפוי מבוצע כראוי, מושבות מבודדות אחת צריכה טופס כדי להגדיל את הסיכוי של מריטת תאי חיידקים הפכו משובט (איור 2 א). עם זאת, אם יותר מדי תאים הם מצופים, הצלחות מודגרת יותר מדי זמן ב-C ° 37 או שינוי הוא בספק, מושבות עשויות לכסות את הצלחת אגר או ליצור אגרגטים גדולים יותר של תאים (2B דמויות ו2C). במהלך ביטוי בדיקה, NGF וSema3A היו מושרה ראשון במשך 4 שעות ב 37 ° C ו SDS-PAGE הניתוח נקבע שני החלבונים היו ממוקמים בחלק מסיס (איור 2 ד). ביטוי חלבון נראה הוגן ולכן ביטוי מבחן נוסף עם אינדוקציה הלילה בשעה 18 ° C נבדק. NGF הביא לביטוי טוב יותר בחלק הקטן המסיסים, ואילו לא היה הבדל מורגש עם Sema3A (2E איור).

NGF וSema3A שניהם היו מבודדים באמצעות טכניקות בידוד יליד כמפורט בפרוטוקול לעיל ולהפעיל דרך עמודת FPLC לטיהור. בנוסף חלבונים רקומביננטיים אלה בודדו וטהרו nonnatively. למרות NGF היה בשבריר מסיס בביטוי בדיקה, נהלי בידוד ילידים מיוצרים תשואה נמוכה של NGF לאחר שני 37 ° C (4.57 מ"ג / התרבות העיקרית של 2 ליטר) ו18 ° C (6.11 מ"ג / התרבות העיקרית של 2 L; איור 3 א, קווים מוצקים זירוזים). עם זאת, תשואה גבוהה יותר של NGF הושגה באמצעות בידוד nonnative עם renaturation (10.72 ± 1.8 מ"ג / תרבות העיקרית של 2 L; איור 3A קו, מקווקו) לאחר 18 ° C, אינדוקציה הלילה. מצד השני, בידוד nonnative לא גרם לייצור Sema3A (איור 3B, קו מקווקו) עם 8.61 ± 3.1 מ"ג / תרבות העיקרית של 2 ליטר לבידוד מקורי (איור 3 ב ', קו מוצק). כתוצאה מכך, NGF היה מבודד בתנאי nonnative לאחר אינדוקציה הלילה בשעה 18 מעלות צלזיוס, ואילו, Sema3A עבר בידוד האם לאחר 4 שעות של אינדוקציה ב 37 ° C. פסגות FPLC נאספו, ודגימות NGF וSema3A נותחו עם SDS-PAGE (איור 3). פסגות חלבון נוספות מצאו בפלט FPLC לSema3A (איור 3 ב) נאספו ונותחו עם SDS-PAGE ולא ממוקמות באזור המשקל המולקולרי Sema3A. שברים אלה הם מוצרים פגומים סבירים להניח כי הם לא מתנהגים מבחינה תפקודית במבחני תא המבוסס כפי שעשה שיא Sema3A מצויינים באיור 3. חלבוני biotinylated באמצעות אנזים בירה וdialyzed כדי להסיר כל מיני unreacted. Biotinylation אושר עם ערכת כימות ביוטין וקורא microplate ניאון.

"Src =" ftp_upload/51295/51295fig1highres.jpg / files/ftp_upload/51295/51295fig1.jpg "/>
איור 1. הנדסת חלבוני ניצול E. מערכת ביטוי coli. התהליך הבסיסי של הנדסת חלבונים רקומביננטיים כרוך בעיצוב של פלסמיד לשכפול ולביטוי בE. coli. מושבות הפכו נבחרות עם השימוש באנטיביוטיקה. ביטויי מבחן קטנים המשמשים כדי לייעל ולזהות את הייצור ומסיסות של חלבון המטרה. הליך זה מוקטן עד cultivations הגדול אצווה (בסולם ליטר). שיטות כרומטוגרפיה משמשות לבודד ולטהר רצוי חלבון המהונדס. שינויים כגון biotinylation יכולים להתרחש במהלך cultivations אצווה או לאחר טיהור.

איור 2. O ptimizing ביטוי מבחן NGF וSema3A. () ציפוי 25 μl של ע 'השתנה תאי coli K12 הביאו במושבות קטנות ומבודדות. מושבה אדם צריכה להיבחר לביטוי מבחן. לתאים BL21 הפך הפצת מושבה דומה צריכה להתרחש. (BC) ציפוי 50 μl ושל תאי K12 100 μl, בהתאמה, הביאו להתפוצצות אוכלוסין של מושבות חיידקים. מריטה מצלחות אלה עלולות לגרום בסבירות נמוכה יותר של בחירת מושבה נגזרה מתא הופך אחד. ביטויי בדיקה (D) של תאים שינו היו מושרה למשך 4 שעות ב C ° 37 עם IPTG, ו- SDS מראה כי חלבון היתוך NGF (29 KDA) וחלבון Sema3A היתוך (91 KDA) באים לידי ביטוי בחלק הקטן מסיס. אינדוקציה הלילה (ה ') ב18 ° C מראה ביטוי NGF עדיין בחלק הקטן המסיסים, עם זאת, הביטוי לSema3A לא משופר.

= "תמיד"> בעמודים
איור 3. טיהור של NGF וSema3A באמצעות FPLC. בידוד nonnative () לאחר 18 ° אינדוקציה לילה C (קו מקווקו) הביא לתשואות טובות יותר NGF בהשוואה לבידוד מקורי בשתי שעות 4, 37 מעלות צלזיוס ובלילה, זירוזים 18 C ° (קווים מוצקים). (ב) לSema3A, אינדוקציה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ומצב בידוד האם של תשואות טובות יותר בהשוואה לבידוד nonnative באותו הפרמטרים טיפוח. SDS-PAGE מציג אוספי שיא FPLC (חיצים) עבור שניהם () NGF וSema3A (ב '). סטנדרטי חלבון סינון ג'ל נדרס כדי לאשר את חלוקת המשקל המולקולרית של הפסגות ומצוינות ברקע של חלקות FPLC בkDa.

טבלת 1. חוצצי בידוד חלבון רקומביננטי.

הנדסת חלבון רקומביננטי היא טכניקה חזקה מאוד שמשתרעת על פני תחומים רבים. זה חסכוני, מתכונן והליך פשוט יחסית, המאפשר הייצור של תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד. חשוב לציין כי עיצוב ולבטא חלבוני מטרה הוא לא תמיד פשוט. ביטוי בסיסי ויציבות חלבון רקומביננטי תלויה בבחירות ספציפיות של וקטור, E. זני coli תא, שנוספו תג פפטיד ופרמטרי טיפוח. קריטריון העיצוב הספציפי שלנו מנצל א מבוסס היטב coli זנים להנדסת חלבונים. בנוסף, וקטור פלסמיד מכיל אמרגן לאק T7 וגן התנגדות אמפיצילין לביטוי חלבונים רקומביננטיים יציב.

לאחר קבלת הפלסמיד subcloned נקי במיוחד, ההליך העיקרי הראשון הוא להפוך בהצלחה את חלבון המטרה לתא המארח ולקבוע את המסיסות שלהחלבון. ביטויי מבחן הם הזמן הטוב ביותר כדי לייעל את הסינתזה של חלבון המטרה. חשוב למרוט מושבות קטנות ומבודדות (איור 2 א), כדי להבטיח בחירה טובה יותר של תאי חיידקים המכילים את הפלסמיד. אסטרטגיות לפתרון בעיות כגון restreaking להפיץ מושבות או דוגרים צלחות אגר לתקופות זמן קצרות יותר יכולים לסייע בתצורות מושבה טובות יותר. אין זה מפתיע שייצור חלבון רקומביננטי גורם ללחץ על מתח המארח ^36. בשלב זה, אם הביטוי הוא עני, יכולים להיות מותאמים גורמים כגון אנטיביוטיקה וריכוז IPTG כמו גם זמן אינדוקציה וטמפרטורה על מנת להשיג את יעד החלבון האופטימלי (לביקורות לראות ^37-38). זו נראתה לNGF בי הביטוי הטוב ביותר נובע מאינדוקצית הלילה בשעה 18 ˚ C (איור 2E).

Sema3A הביא לייצור חלבון לתנאים מקומיים, אלא nonnativבידוד דואר לא הראה ייצור חלבון (איור 3 ב). תרבויות עיקריות של NGF היו מושרה למשך 4 שעות ב 37 ˚ C, כמו גם לינה ב18 ˚ C ומבודד בתנאים מקומיים. טיהור FPLC הפיקה תשואה נמוכה יותר של NGF בהשוואה לתרבויות עיקריות שבודדו nonnatively לאחר אינדוקציה הלילה בשעה 18 ˚ C (איור 3 א). היווצרותם של חלבונים בגופי הכללה היא חשבה בדרך כלל להיות לא רצוי מאז renaturation קשה לפעמים ולא תמיד מצליח. זה הוביל לפיתוח של טכניקות כדי לשפר את מסיסות חלבון כולל התוספת של רצפי חלבון מסיסים ^39-41. עם זאת, חלבונים הוכחו להחזיק צורות של מדינות קונפורמציה תוך מבודדים בגופי הכללה, ופרמטרים כגון טמפרטורות אינדוקציה נמוכות לעזור לשמור על מבנים הפעילים אלה ^42-46. כאשר חלבון יכול לבוא לידי ביטוי רק בצורה בלתי מסיס זה בדרך כלל ניתן מחדשטבע החלבון לאחר הבידוד תוך שימוש בטכניקות פשוטות עם אובדן תשואה מעט מאוד כפי שדיווחנו בעבר ^21.

הראנו כיצד להנדס בהצלחה ולייצר חלבוני biotinylatable באמצעות E. מערכת ביטוי כמארח מניב כ 8-10 מ"ג / התרבות העיקרית של 2 ל 'זה שיבוט וcoli חשוב לציין כי הרצף הכולל של אירועים נשאר זהה כאשר ייצור חלבונים רקומביננטיים חדשים (איור 1), ואולם, מותאם אישית לכל חלבון שנעשה צריך להיות מטופלים על מקרה להגוף כדי לקבוע כיצד לייצר את התשואה הגבוהה ביותר של מוצר מטוהר באופן ספציפי. הראנו כיצד NGF וSema3A מתנהגים באופן שונה באותה מערכת הטיפוח ואיך לייעל את הייצור שלהם. בנוסף, אנו משתמשים כרגע עוד E. זן מארח coli B שיכול biotinylate in vivo ⁴⁷ לחלבוני יעד אחרים, הממחיש את החשיבות של ישארגרם היטב הודיע ​​על ההתקדמות המתמשכת ושינויים בנוגע להנדסת חלבונים רקומביננטיים.

יש המחברים אין לחשוף.

המחברים רוצים להכיר אוניברסיטת אקרון למימון שתמך בעבודה זו.