Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen.

Rekombinantes Protein Engineering hat Escherichia coli verwendet (E. coli) Expressionssystemen fast 4 Dekaden, und heute E. coli ist immer noch das am häufigsten verwendete Wirtsorganismus. Die Flexibilität des Systems erlaubt die Zugabe von Einheiten, wie eine Biotin-Tag (für Streptavidin Wechselwirkungen) und größere funktionelle Proteine ​​wie das grün fluoreszierende Protein oder kirschrot Protein. Auch hat die Integration von unnatürlichen Aminosäuren wie Metallionenchelatoren, eindeutig reaktiven funktionellen Gruppen, spektroskopische Sonden und Moleküle verleihen posttranslationale Modifikationen bessere Manipulation von Proteineigenschaften und Funktionen aktivieren. Als Ergebnis dieser Technik schafft anpassbare Fusionsproteine, die erheblichen Nutzen für verschiedene Forschungsfelder zu bieten. Genauer gesagt, hat die biotinylatable Proteinsequenz in viele Zielproteine ​​wegen der hohen Affinität zwischen Biotin Wechselwirkung mit Avidin und Streptavidin übernommen. Dieser Zusatz hat die Verbesserung Detektion und Reinigung des markierten Proteine ​​als auch der Weg für sekundäre Anwendungen wie Zellsortierung unterstützt. So Biotin-markierte Moleküle zeigen einen zunehmenden und großen Einfluss in bioindustriellen und Biomedizin. Für die Zwecke unserer Forschung haben wir rekombinante biotinylierte Fusionsproteine, Nervenwachstumsfaktor (NGF) und semaphorin3A (Sema3A) Funktionsbereiche entwickelt. Wir haben früher, wie diese biotinylierte Fusionsproteine ​​zusammen mit anderen aktiven Proteinsequenzen können Biomaterialien für das Tissue Engineering und regenerative Zwecke gebunden werden berichtet. Dieses Protokoll beschreibt die Grundlagen der Ingenieur biotinylatable Proteine ​​an der Milligramm-Maßstab unter Verwendung einer T7-lac-induzierbaren Vektor-und E. coli-Expressionswirte, ab Transformation zum Scale-up und Reinigung.

Proteine ​​umfassen eine breite Palette von Biomolekülen, die für viele biologische Funktionen verantwortlich sind, letztlich um die richtige Gewebebildung und Organisation führt. Diese Moleküle zu initiieren Tausende von Signalwegen, die Hochregulierung und / oder Herunterregulierung von Genen und anderen Proteinen zu steuern, die Aufrechterhaltung Gleichgewicht innerhalb des menschlichen Körpers. Störung eines einzelnen Proteins beeinflusst diese gesamte Bahn von Signalen, die zu Beginn der verheerenden Störungen oder Krankheiten führen kann. Engineering einzelnen Proteine ​​im Labor bietet eine Lösung zur Bekämpfung dieser Nebenwirkungen und bietet eine Alternative zu niedermolekularen Wirkstoffen. 1977, ein Gen, das 14 Aminosäuren Somatostatin-Sequenz, einer der ersten Werk Polypeptide unter Verwendung von E. geschaffen coli ^ein. Bald nach 1979 wurde Insulin in pBR322 kloniert, transformiert, ausgedrückt und gereinigt ^2. Seitdem haben rekombinanten Proteinen, ihren Einfluss, um mehrere Felder der Rechts erweitertSuche wie Biomaterialien, Wirkstofftransport, Gewebetechnik, Bio-Pharmazie, Landwirtschaft, industrielle Enzyme, Biokraftstoffe, etc. (siehe Referenzen für Bewertungen ^3-8). Dies ist weitgehend auf die Vielseitigkeit, die das Verfahren bietet über die Zugabe von anwendungsspezifischen chemischen Einheiten oder Proteinsequenzen zu Zwecken einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zielproteinidentifizierung, Stabilisierung und Reinigung begrenzt.

Über rekombinante DNA-Technologie können rekombinante Proteine ​​in einer Vielzahl von eukaryotischen und prokaryotischen Wirtssystemen, einschließlich Säuger-, Pflanzen-, Insekten-, Hefe-, Pilz oder Bakterien exprimiert werden. Jeder Host bietet verschiedene Vorteile und in der Regel das beste System wird auf der Grundlage der Proteinfunktion, Ertrag, Stabilität, Gesamtkosten und Skalierbarkeit bestimmt. Bakterien-Zellen fehlen oft die post-translationale Modifikation Mechanismen, die eukaryotischen Wirten (dh Glykosylierung, Disulfidbrücken, E tc.) ^5. Als Ergebnis Säuger-und Insekten-Systemen in der Regel eine bessere Kompatibilität und die Expression von eukaryontischen Proteinen führen, aber diese Rechner sind in der Regel teuer und zeitaufwendig ^9. Daher E. coli ist der bevorzugte Wirt für unsere Expressionssystem, da die Zellen rasch expandieren in preiswerten Wachstumsbedingungen und die genetische Expression Mechanismen sind gut verstanden ^5,9. Zusätzlich ist dieses System leicht trotz des Fehlens von posttranslationalen Modifikationen ¹⁰ Scale-up für Produktionszwecke und die Ergebnisse in funktionelle Proteine. Die E. coli K12 Stamm wird in diesem Protokoll für das Klonen gewählt, weil dieser Stamm bietet ausgezeichnete Plasmid-Ausbeuten bezogen auf hohe Transformationseffizienz. Darüber hinaus wird ein E. coli-Stamm BL21 zur Expression verwendet werden, da diese Wirtsstamm enthält die T7-RNA-Polymerase-Gen, gesteuert Protein Expression und Stabilität ¹¹ liefert.

Test Ausdrücke (kleine Kulturen) werden verwendet, um das Vorhandensein und die Löslichkeit des Zielproteins, das entweder in einer löslichen oder unlöslichen Form zu formulieren Reinigungsverfahren ausgedrückt werden kann zu bestimmen. Ein lösliches Protein innerhalb der Bakterienzelle exprimiert wird spontane Faltung unterziehen, um seine native Struktur ¹⁹ zu halten. Typischerweise ist die MutterStruktur ist thermodynamisch günstig. In vielen Fällen ist die Stoffwechselaktivität der Rechner ist nicht förderlich für das Zielprotein, indem Druck auf das System, um die unlöslichen Proteinproduktion und die Bildung von Einschlusskörpern von unlöslichen Proteinaggregaten zusammen führt. Damit das Zielprotein denaturiert, wodurch sie im allgemeinen biologisch inaktiven ^20. Beide Test Ausdrücke vergrösserte und Isolationsverfahren sind durch die Löslichkeit des Zielproteins bestimmt wird. Eine weitere Renaturierung oder Rückfaltungsschritt für unlösliche Proteine ​​erforderlich. Die resultierenden rekombinanten Proteine ​​können weiter unter Verwendung von Grßenausschluß-Chromatographie gereinigt werden.

Im Haus bietet rekombinanten Proteinproduktion Kostenvorteile gegenüber kommerziellen Produkten seit Milligramm Zielprotein pro Liter Hauptkultur isoliert werden. Die meisten der benötigten Ausrüstung ist in einer typischen biologischen oder chemischen Labor erhältlich. Protein-Engineering ermöglicht die Erzeugungvon kundenspezifischen Fusionsproteine ​​mit zusätzlichen Funktionen, die nicht im Handel erhältlich sind immer. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Verfahren in der Technik rekombinanten Proteinen beteiligt. Mit diesem Expressionssystem haben wir viele biotinylatable Proteine, wie Interferon-gamma, Plättchenwachstumsfaktor, Knochen-morphogenetisches Protein ^21-23 angelegt, aber wir werden auf zwei Proteine, die wir für Axon Führung, NGF (29 kDa ausgebildet konzentrieren ) und Sema3A (91 kDa) ¹⁰ (für eine Übersicht siehe Referenz ^24). Biotinylierung ist eine übliche Technik zur Identifizierung, Isolierung und Immobilisierung der markierten Proteine ​​unter Verwendung der bekannten Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung ^25-27. Biophysikalischen Sonden ^28,29, Biosensoren ³⁰ und Quantenpunkte ³¹ sind Beispiele von Systemen, die hohe Affinität von Biotin-Streptavidin Konjugation mit einem K _d in der Größenordnung von 10 ^-15 M ²⁷ nutzen. Die E. coli bioZinn-Ligase BirA, unterstützt die kovalente Bindung von Biotin an die Lysin-Seitenkette in der Biotin-markierten Sequenz gefunden ^18,32. Tethering Biotin an Werkstoffen und Biomolekülen hat anhaltende Abgabe von Wachstumsfaktoren produziert, um für mehrere Tissue Engineering Anwendungen ^21,33-35 Zelle. Daher Engineering diese maßgeschneiderten biotinylatable Proteinen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das mehrere Forschungsinteressen überwinden kann.

1. Die Projektierung des Zielproteins

1. Mit dem National Center for Biotechnology Information Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhalten eine Aminosäure-Sequenz für das Zielprotein unter Berücksichtigung der Art der Zinsen und Splice-Varianten. Wählen Sie die Aminosäuresequenz, die zu der aktiven Region von Interesse des Proteins entspricht.
   Hinweis: Sema3A wurden Aminosäuren 21-747 entschieden. Fusionsprotein wurde mit NGF, wo die Sequenz von Barstar, Aminosäure 1-90 wurde auf NGF Aminosäuren 122-241 hinzugefügt gestalten.
2. Um die N-Terminus fügen Sie die folgenden Sequenzen: 6x-His-Tag für die Reinigung (HHHHHH), Tabak Etch Virus (TEV) Protease geschnitten Website zur Entfernung von His-Tag (ENLYFQG), Biotin-Tag-Sequenz für die Biotinylierung von Protein bei K (GLNDIFEAQKIEWHE) und flexiblen Gelenk mit Lücken, die Raum für die richtige Proteinrückfaltung (EFPKPSTPPGSSGGAP) ermöglichen.
   Anmerkung: Diese Sequenzen können je nach der gewünschten Fusions prot variierenEin.
3. Senden vollständige Aminosäuresequenz an ein Unternehmen für die Gen-Design / Optimierung für gewünschte Wirtsarten und Synthese. Subklonieren in einen Vektor der Wahl mit der BamHI-NotI-Stelle mit einem Kit oder durch Verwendung von kommerziellen Dienstleistungen.

2. Machen Agar-Platten

Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass alle Aktien von Antibiotika, Platten, Puffer, etc. ordnungsgemäß gelagert (Temperatur und Dauer) und bleiben frei von Proteasen (sterilisiert).

1. Abwiegen Agar bei 1,5 Gew.% und Lysogenie Brühe (LB) bei 20 g / L und in eine Glasflasche Medien. Ein 500-ml-Flasche macht etwa 15 Platten.
2. Volumetrisch hinzufügen Reinstwasser, gut mischen und Autoklaven.
3. Lassen Flasche kühl an und fügen Sie die entsprechenden Antibiotika. Vermeiden vorzeitigen Erstarrung der Agar, aber wenn Flasche kühlt zu viel und Lösung beginnt zu erstarren, Aufwärmen in der Mikrowelle.
   Hinweis: Unsere Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-GenE. Daher müssen alle Schritte Ampicillin bei 100 ug / ml enthalten. Die E. coli K12-Stamm erfordert Klonierung Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotikum. BL21-Bakterien-Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotikum.
4. Gießen 25-30 ml Lösung in 90 mm Petrischalen und genügend Zeit, um zu trocknen.
5. Label-Gericht mit geeigneten Antibiotika und speichern upside-down in 4 ° C, mit Parafilm oder in einem wiederverschließbaren Beutel.
   Hinweis: Die Platten sind gut für etwa einen Monat.

3. Klonierung des Biotin Tagged Plasmid

Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht.

1. Spin down Plasmid-Vektor bei 6.000 xg für 3 min, um zu pelletieren, und fügen Sie 10 ul sterilisiert Reinstwasser.
2. Entfernen Sie 50 ul chemisch kompetente E. coli-Zellen hohe Transformationseffizienz von -80 ° C und sofort auf Eis für 5-10 min.
3. 1 ul der Vektor-Lösung bei 0,5-1 ng/5056, L-Zellen an die 50 &mgr; l E. coli-Zellen, und legen Sie die restlichen Plasmid in -80 ° C
4. Platzieren der Bakterien-Zellen, die den Vektor auf Eis für 5 min.
5. Hitzeschock die Zelle und Vektor Mischung für 30-45 sec in 42 ° C Wasserbad und Ortszellen wieder auf Eis für 2 min.
6. Add 250 ul Superbrühe mit optimalen Repression (SOC)-Medium (2% w / v-Bacto-Trypton, 0,5% w / v Bacto-Hefeextrakt, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO _4, 20 mM Glucose , hochreinem Wasser, pH = 7,0) hinzugefügt und bei 250 Upm bei 37 ° C für 30 min.
   Hinweis: SOC nicht autoklavierbar, sondern Filter durch ein 0,22 um-Filter sterilisiert werden.
7. Trockenplatten 10-15 min vor dem Beschichten Zellen.
8. Pipette 25, 50 und 100 &mgr; l der Zelllösung auf separate Agarplatten, die Ampicillin (100 &mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika. Verwenden Sie Glasperlen Lösung gleichmäßig auf Agar-Platten zu verteilen.
9. Platten bei 37 ° C inkubieren upside-down für 15-18 Std.
10. Check für kleine Einzelbakterienkolonien auf den Platten bei 4 ° C lagern Oberseite nach unten bis zur weiteren Verwendung (Fig. 2A).
    1. Wenn keine Kolonien vorhanden sind:
       1. Überprüfen Sie die Frische und Sterilität von Puffern und Zubehör.
       2. Erhöhen Sie die Menge von Plasmid E. hinzugefügt coli K12-Stamm.
    2. Wenn große Kolonien vorhanden sind oder ein übermäßiges Wachstum der Kolonien (Abbildung 2B und 2C), restreak ein neues Agar-Platte mit einer sterilen Impföse oder Platten Zellen bei niedriger Lautstärke.
11. Beimpfen von 5 ml LB, enthaltend Ampicillin (100 &mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika mit einer einzelnen Kolonie transformierter E. coli-Zellen. Aufwachsen Zellen über Nacht bei 37 ° C bei 250-300 UpM.
12. Der folgende Tag, verwenden Sie ein Plasmid Isolation Kit, um die Zielvektor aus der Nacht gro isolierenw-und Speicher gereinigt Plasmid bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
    1. Optional: Überprüfen Sie die Reinheit und Konzentration der Plasmid mit Absorptionswert bei 260 und 280 nm erhalten.

4. Transformation von Plasmid in Expression-Host

Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht.

1. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,10 für E. coli BL21-Zellen mit den folgenden Änderungen:
   Hinweis: BL21 Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotika Ampicillin daher nur auf den Agarplatten zur Transformation aufgenommen.
   1. In 2-5 ul isolierte Plasmid bei 0,5-2 ng/50 ul Zellen aus Schritt 3,12-50 ul E. coli-Expressionswirtszellen.
   2. Hitzeschock-Zellen, die für 60 bis 90 Sekunden.
   3. Schütteln Lösung mit SOC-Medium bei 250 rpm für 60 min statt 30 min.
2. Zupfen Sie eine Einzelkolonie von transformierten Bakterienzellen aus der Petrischale mit einem sterile Applikatorstäbchen und in ein Reagenzglas mit 5 ml LB-Medium mit der entsprechenden Konzentration an Ampicillin (100 ug / ml).
3. Platzieren Reagenzgläser in Schüttler über Nacht bei 37 ° C bei 250 UpM.
4. Am folgenden Morgen, nehmen Sie 200 ul der Nacht wachsen-up und auf 5 ml LB mit Ampicillin bei 100 ug / ml hinzuzufügen.
5. Frieren Sie unten die restlichen Zellen mit 250 ul 50% Glycerin (steril) auf 750 ul Kultur und halten in -80 ° C
   Hinweis: Neue Testausdruck und Scale-up-Verfahren kann mit einem sterilen Applikator-Stick, ein Kratzen der gefrorenen Zellen zu erhalten und Impfen LB mit den entsprechenden Antibiotika durchgeführt werden.
6. Platzieren Reagenzglas in Schüttler bei 250-300 Upm bei 37 ° C, bis die optische Dichte (OD) zwischen 0,7-0,8 bei einer Absorption von 600 nm gemessen.
7. Induzieren Zellen mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM.
8. Schütteln für weitere 4 h bei 37 ° C bei 300 UpM. Alternativ können auch Zellenüber Nacht bei 18 ° C bei 250-300 rpm geschüttelt werden. Dies kann eine höhere Ausbeute an Plasmid zu erzeugen in Abhängigkeit von dem Zielprotein.
9. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse der Testausdruck
   1. Nehmen Sie 500 ul der Kultur und der Platz in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min. Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften "löslich". Pellet unter Vortexen in 200 &mgr; l Beladungsfarbstoff (50 ul 2-Mercaptoethanol, 950 &mgr; l Laemmli-Probenpuffer).
      Hinweis: Löslich Bakterienpellets wird verwendet, um zu bestimmen, ob das rekombinante Protein in den cytoplasmatischen Regionen der Bakterienzellen. Pellets können in -80 ° C ohne Belastung Farbstoff, bis sie benötigt gespeichert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als lösliche als auch zum Vergleich behandelt werden.
   2. Nehmen Sie 1000 ul der Kultur und in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min.Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften "unlöslich".
      Hinweis: unlöslich Pellets Denaturierung Verfahren unten, um Proteine ​​in Einschlusskörpern von Bakterien Zellen gefunden loslassen zu unterziehen. Pellets können in -80 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als unlösliche als auch zum Vergleich behandelt werden.
      1. Resuspendieren Sie das unlösliche Pellet in 200 ul BugBuster und bei Raumtemperatur für 30 min.
      2. Spin down Probe erneut bei 13-15 g für 5 min und nehmen 50 ul Überstand und es um neue "unlöslich" 1,5-ml-Röhrchen hinzufügen.
      3. Dann fügen Sie 50 ul Ladefarbstoff auf diese neue Probe.
   3. Sieden löslichen und unlöslichen Proben für 5 min, um Proteine ​​für die SDS-PAGE-Analyse zu denaturieren.
   4. Legen Sie jede Probe in Elektrophorese-Gel mit Standard-Leiter.
   5. Um zu visualisieren, die Proteinproben mit einem staining Reagenz und folgen Sie der Firma Protokoll.
   6. Bestimmen, ob das Protein exprimiert, in den löslichen und / oder unlöslichen Fraktionen durch Vergleich dieser zwei Bahnen sowie den Vergleich der Spuren mit den löslichen und unlöslichen Kontrollspuren (siehe Anmerkung 4.9.1 und 4.9.2) auf den SDS-PAGE-Gel (Abb. 2). Ein dunkles Band sollte um das Molekulargewicht des Proteins in der löslichen oder unlöslichen Fahrspuren angezeigt. Damit wird festgelegt, welche Isolierungsverfahren in Protokoll Nr. 6 zu verwenden.
      Anmerkung: Wenn ein Band in diesen beiden Regionen entweder als Isolation in 6 verwendeten Protokoll unten durchgeführt werden, oder das Protein kann in beide Richtungen getrennt werden, um zu bestimmen, welche Isolierungsverfahren erzeugt eine höhere Ausbeute an rekombinantem Protein (Fig. 3) .
   7. Wenn ein 4 h und Induktion über Nacht durchgeführt wurde, festzustellen, welche Induktionsmethode die höchste Proteinproduktion für das Scale-up-Prozess (Abbildung 2).

5. Scale-up Verfahren und Hauptkultur

1. Bereiten Wachstumsmedien mit 85,7 g Terrific Broth und 28,8 ml 50% Glycerin in 1,8 l Reinstwasser und Autoklaven auf Flüssigkeitskreislauf für 1 Stunde.
2. Starten Sie eine Übernachtkultur von gefrorenen Zell Lager in Schritt 4.5 erstellt.
   Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht.
   1. Mischungs 20 ml LB mit einer Endkonzentration von Ampicillin bei 100 ug / ml in einer sterilen 125 ml Erlenmeyerkolben.
   2. Mit einem sterilen Applikator-Stick einen Verschrottung von transformierten E. coli-Zellen und Drop-Applikator in den Kolben. Entfernen Applikator-Stick und Stecker Kolben mit Schaumstoffstopper oder Baumwolle und mit Alufolie abdecken, um die Sterilität zu erhalten.
   3. Schütteln über Nacht bei 250 UpM bei 37 ° C.
3. Hauptkultur
   Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht.
   1. Gießen-Nacht-Kultur in 1,8 L von sterilen Nährmedien und fügen Ampicillin bei 100 &mgr; g / ml und 6 bis 8 Tropfen sterilen Antischaum 204 unter Verwendung einer Pasteurpipette.
   2. Platz Kulturen in einem 37 ° C Wasserbad mit 0,2 mm durch Belüftung Steine ​​gefilterte Druckluft Blasenbildung in Kulturen.
   3. Sobald der OD _{600 nm} von 0,7-0,8 erreicht, induziert mit IPTG (1 mM) und damit zur Induktion entweder 4 h bei 37 ° C oder über Nacht in Abhängigkeit von löslichen / unlöslichen Ergebnisse von SDS-PAGE in Schritt 4.9 auftreten, auf 18 ° C.
4. Sammeln E. coli-Zellen
   1. Spin-Down der Zellkultur in 1 l-Zentrifugenflaschen (2 Flaschen / Kultur) für 15 min bei 14.000 × g bei 4 ° C.
   2. Überstand abgießen und mit einem dünnen Spachtel, schöpfen die Bakterien zu pelletieren in zwei 50-ml-Röhrchen. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation für einige Minuten pelletiert werden.
      Hinweis: Jeder 1,8-l-Kultur in zwei Bakterienpellets, eine in jeder 50-ml-Zentrifugenrohr führen.
   3. Shop-Pellets in -80 C bis Proteinisolierung.

6. Isolierung und Reinigung von rekombinantem Protein

Hinweis: Wenn das Protein in der löslichen Region auf Basis von SDS-PAGE-Analyse von Schritt 4,9, dann wird "native Isolation" verwendet werden, aber für die unlöslichen Proteinen "Nonnative Isolation"-Verfahren durchgeführt.

1. Zelllyse
   1. Nonnative
      1. Transformierten E. entfernen coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank und 20 ml Lyse / Waschpuffer (Tabelle 1) zu jedem Zentrifugenröhrchen.
      2. Vortex und schütteln Sie die gefrorenen Pellets, bis es taut und löst in der Pufferlösung ohne großen Brocken. Inkubation über Nacht auf Nutator. Am folgenden Morgen sollte das Pellet jetzt eine viskose Aufschlämmung aufgrund der Denaturierung des Proteins aus dem Puffer sein.
      3. Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei Raumtemperatur für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets.
   2. Native
      1. Erhalten transformierten E. coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank.
      2. Hinzufügen Lysis Buffer (Tabelle 1) Zentrifugenröhrchen auf ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen und zu entfernen gefrorene Pellet durch Verwirbeln und rigoros Schütteln. Zeigen Pellet auf Eis.
      3. Waschen Sonicator Sonde mit 70% Ethanol bei 100% Amplitude für 1-2 min. Wiederholen Sie dann mit hochreinem Wasser.
      4. Ultraschallbad Bakterien zu pelletieren, während auf Eis für 5 min (Gesamtzeit von 10 min).
         1. Stellen Ultraschallgerät bei 30% Amplitude mit Puls von 30 Sekunden an/30 s aus.
         2. Bob Zentrifugenröhrchen nach oben und unten während der Beschallung Intervall, um vollständig brechen die Zellpellet. Am Ende der Gesamtzeit sollte es keine sichtbaren Bakterien zu pelletieren Verlassen einer sehnig, zähflüssige Brei.
         3. Reinigen Sie das Ultraschallgerät Sonde zwischen verschiedenen Proteinisolierungen sowie für die Lagerung mit 70% Ethanol und Reinstwasser, wie in Schritt 6.1.2.3 beschrieben.
      5. Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei 4 ° C für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets.
2. Ni-NTA-Affinitäts-Chromatographie
   1. Nonnative
      1. 1-ml-Ni ^{2 +-NTA-Harz-Lösung} zu jedem Zentrifugenröhrchen (2 ml Harz für insgesamt 1,8 l-Kultur) und Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 1 h auf Nutator.
      2. Gießen Schlamm in Affinitätssäule und lassen Lösung durch Hahn Ventil vollständig in die Abfallbecherglas tropfen.
      3. Zuführen 10 Wäschen mit 10 ml Lyse / Waschpuffer für jeden Waschgang.
         1. Für die ersten zwei Wäschen, fügen Sie die 10 ml-Zentrifugenröhrchen auf die zusätzliche Harz zu entfernen und gießen Sie dann in die Spalte. Die zusätzlichen Waschungen können direkt Spalte hinzugefügt werden.
         2. Nach jedem Wasch, rühren Sie den Harz mit einem Glasstab. Sobald der Wasch tropft in den Abfall Becher können die nächsten 10 ml zugegeben werden.
      4. Nach dem vollständigen dr waschendurch ips, in der Nähe Absperrventil, entfernen und ersetzen Abfallbecherglas mit 50 ml-Zentrifugenröhrchen für die Protein-Sammlung.
      5. 15 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und rühren-up Harz, so dass Lösung für 5 min zu sitzen. Absperrhahn öffnen Ventil und sammeln Elution. Wiederholen Sie den Vorgang mit weiteren 15 ml.
   2. Ureinwohner
      1. Folgen Sie der Nonnative Affinity Chromatography oben (Schritte 6.2.1.1-6.2.1.4) mit Ausnahme stellen Sie die folgenden Parameter:
         1. Inkubieren Ni ^{2 +-NTA-Harz-Lösung} bei 4 ° C für mindestens 1 h auf Nutator.
         2. Verwenden Sie die geeignete Waschpuffer (Tabelle 1).
      2. 5 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und Inkubation mit Harz 5 min.
         1. Offene Absperrventil und sammeln Elution, bis die meisten der Lösung durchtropft.
         2. In 90 ul / Bradford Reagenz auf 96-Well-Platte zu löschen. Nach jeder Elution ermöglichen 10 ul soLösung, um aus der Spalte in den wohl mit 90 ul Bradford-Reagenz tropfen.
         3. Weiter Zugabe von 5 ml Elution Buffer an, bis Bradford-Test erkennt nicht mehr Protein (Farbe reicht von dunkelblau bis hellblau zu löschen). Dies dauert in der Regel 4-5 Elutionsvolumina.
3. Dialyse / Renaturierung
   1. Machen nonnative (Renaturierung) und native Dialyse-Puffer (Tabelle 1) und Speicher in 4 ° C
      Anmerkung: Der pH-Wert der Dialyse-Puffer werden durch isoelektrische Punkt des Zielproteins (pI) bestimmt. Als eine Faustregel, Proteine ​​sollten mindestens einen vollen Punkt über oder unter ihrem pI-Werte gepuffert werden.
   2. Übertragen nativen und nicht-nativen Elutionen einen Dialyseschlauch mit entsprechenden Molekulargewichtsgrenze (25.000 MWCO für NGF und 50.000 MWCO für Sema3A). Je eine Proteinprobe in jeweiligen Dialysepuffer 1 für 4 h bei 4 ° C und dann mit dem entsprechenden Puffer 2 über ersetzenNacht bei 4 ° C
      Hinweis: Protein muss in jedem Puffer für mindestens 4 Stunden für die ordnungsgemäße Rückfaltung und Pufferaustausch stattfinden dialysiert werden.
   3. Konzentrieren Sie die dialysiert Protein Elutionen auf weniger als 5 ml Zentrifugen mit Spin-Konzentratoren.
      Hinweis: Die Proteine ​​können durch Verwendung schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt und erneut eingeengt werden.
4. Bestimmen Proteinkonzentration (mg / ml) durch Gefriertrocknen einer 10-50 ml Probe in einem vorgewogenen Zentrifugenröhrchen.
   1. Optional: Bestimmung des Extinktionskoeffizienten ε, so daß die Konzentration des Proteins in Zukunft Isolierungen durch Messung der Absorption einer Probe bei 280 nm unter Verwendung des Lambert-Beer-Gesetzes bestimmt werden: C = A _280nm / ε L, wobei L die Weglänge ist.

7. Biotinylierung von gereinigtem Protein

1. Dialysiere Proteine ​​in 10.000 MWCO Dialysekassetten against 10 mM Tris (pH = 8,0), die Änderung der Puffer alle 4 Stunden mit insgesamt sechs Veränderungen.
2. Transfer der rekombinanten Proteine ​​(jetzt in 10 mM Tris-Puffer), um 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Biotinylierung.
3. Biotinylieren Proteine ​​unter Verwendung einer Biotin-Protein-Ligase-Kit.
4. Proteine ​​dialysiert gegen PBS (pH = 7,4) mit 10.000 MWCO Dialysekassetten mit 3 Puffer ändert einen Tag für 2 Tage.
5. Bestimmen Sie die Prozent Biotinylierung von Proteinen mit Hilfe eines quantitativen Kit.
6. Bestimmen Sie die Konzentration wieder wie in 6.4 und bei 4 ° C oder aliquotieren und bei -20 ° C zur Langzeitlagerung beschrieben.

Klonierung und Expression-Test

Wenn Beschichtung richtig durchgeführt wird, sollten einzelne isolierte Kolonien zu bilden, um die Chancen Zupfen klonalen transformierten Bakterien-Zellen (2A) zu erhöhen. Wenn jedoch zu viele Zellen plattiert, Platten zu lange bei 37 ° C inkubiert oder Transformation ist fraglich, Kolonien können die Agar-Platte abdecken oder bilden größere Aggregate von Zellen (Fig. 2B und 2C). Während Testausdruck, NGF und Sema3A wurden zunächst 4 Stunden bei 37 º C induziert und SDS-PAGE-Analyse wurden beide Proteine ​​in der löslichen Fraktion (Fig. 2D) befindet. Die Protein-Expression schien fair und daher ein weiterer Testausdruck mit Induktion über Nacht bei 18 ° C untersucht. NGF führte zu einer besseren Ausdruck in der löslichen Fraktion, während es keinen spürbaren Unterschied mit Sema3A (2E).

Sowohl NGF und Sema3A wurden mit nativen Isolierungstechniken wie in dem oben beschriebenen Protokoll und durch die FPLC-Säule zur Reinigung laufen isoliert. Zusätzlich können diese rekombinanten Proteine ​​wurden isoliert und nonnatively gereinigt. Auch wenn NGF war in der löslichen Fraktion während der Testausdruck produziert nativen Isolationsverfahren eine geringe Ausbeute von NGF nach beiden 37 ° C (4,57 mg / Hauptkultur von 2 L) und 18 ° C (6,11 mg / Hauptkultur von 2 L; 3A, durchgezogene Linien) Induktion. Allerdings wurde eine höhere Ausbeute von NGF durch nicht-native Trennung mit Renaturierung erhalten (10,72 ± 1,8 mg / Hauptkultur von 2 L; 3A, gestrichelte Linie) nach 18 ° C, über Nacht Induktion. Auf der anderen Seite führte nonnative Isolation in keiner Sema3A Produktion (3B, gestrichelte Linie) mit 8,61 ± 3,1 mg / Hauptkultur von 2 L für native Isolierung (Abbildung 3 B, durchgezogene Linie). Als Ergebnis wurde NGF unter nicht-nativen Bedingungen nach Induktion über Nacht bei 18 ° C isoliert, während Sema3A unterzog nativen Isolierung nach 4 h Induktion bei 37 ° C FPLC-Peaks wurden gesammelt und NGF und Sema3A Proben wurden mit SDS-PAGE (Fig. 3) untersucht. Zusätzliche Proteinpeaks in der FPLC-Ausgang für Sema3A (3B) gefunden wurden gesammelt und mit SDS-PAGE analysiert und waren nicht in der Sema3A Molekulargewichtsbereich liegt. Diese Fraktionen sind wahrscheinlich Abbauprodukte, weil sie nicht funktionell in zellbasierten Assays verhalten sich ebenso wie die Spitzen Sema3A in 3B angezeigt. Die Proteine ​​wurden mit einem Enzym BirA biotinyliert und dialysiert, um alle nicht umgesetzten Spezies zu entfernen. Biotinylierung wurde mit einer Biotin-Kit Quantifizierung und fluoreszierende Mikroplatten-Reader bestätigt.

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Fig. 1 ist. Protein-Engineering unter Verwendung eines E. coli Expressionssystem. Das grundlegende Verfahren der rekombinanten Protein-Engineering umfasst Konzeption eines Plasmids für die Klonierung und Expression in E. coli. Transformierte Kolonien werden mit der Verwendung von Antibiotika ausgewählt ist. Kleine Test Ausdrücke werden verwendet, um zu optimieren und die Produktion und die Löslichkeit des Zielproteins. Dieses Verfahren ist für große Batch-Kultivierungen (Literskala) skaliert-up. Chromatographie-Verfahren werden zur Isolierung und Reinigung des gewünschten synthetischen Proteins. Modifikationen wie Biotinylierung kann während der Batch-Kultivierungen oder nach der Reinigung auftreten.

2. Optimizing Testausdruck von NGF und Sema3A. (A) Überzug 25 ul von transformierten E. coli K12-Zellen führte zu kleinen, isolierten Kolonien. Eine einzelne Kolonie sollte für Testausdruck ausgewählt werden. Für BL21 Zellen sollte ähnlich Kolonie Verteilung auftreten. (BC) Auflage 50 ul und 100 ul K12-Zellen, jeweils in Folge der Überbevölkerung der Bakterienkolonien. Zupfen von diesen Platten konnte in einer geringeren Wahrscheinlichkeit der Auswahl einer Kolonie von einer einzigen transformierten Zelle abgeleitet führen. (D) Test Ausdrücken von transformierten Zellen wurden für 4 Stunden bei 37 ° C mit IPTG induziert, und SDS-PAGE zeigt, dass die NGF-Fusionsprotein (29 kDa) und Sema3A Fusionsprotein (91 kDa) in der löslichen Fraktion ausgedrückt. (E) Induktion über Nacht bei 18 ° C zeigt NGF-Expression noch in der löslichen Fraktion, jedoch wird für die Expression Sema3A nicht verbessert.

Abbildung 3. Reinigung von NGF und Sema3A mittels FPLC. (A) Nonnative Trennung nach 18 ° C über Nacht Induktion (gestrichelte Linie) führte zu einer besseren NGF Renditen im Vergleich zu nativem Isolierung sowohl auf 4 Stunden, 37 ° C und über Nacht, 18 ° C Induktionen (durchgezogene Linien). (B) Für Sema3A, Induktion bei 37 ° C für 4 h und nativen Zustand Isolation erzeugt bessere Erträge im Vergleich zu nicht-native Isolierung an den gleichen Kultivierungsparameter. SDS-PAGE zeigt FPLC Spitzen Sammlungen (Pfeile) sowohl für (A) und NGF (B) Sema3A. Ein Gel Filtration Proteinstandard wurde ausgeführt, um die Molekulargewichtsverteilung der Spitzen zu bestätigen und wird im Hintergrund der FPLC Grundstücke in kDa angegeben.

Tabelle 1. Rekombinante Proteinisolierung Puffer.

Rekombinante Proteintechnik ist eine sehr mächtige Technik, die viele Disziplinen überspannt. Es ist kostengünstig, abstimmbaren und ein relativ einfaches Verfahren, das die Herstellung von hohen Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gestaltung und die Zielproteine ​​exprimieren, ist nicht immer einfach. Basale Expression und rekombinante Proteinstabilität ist von den spezifischen Möglichkeiten der Vektor, E. coli-Zellstämme, Peptid-Tag Ergänzungen und Kultivierungsparameter. Unser spezifisches Designkriterium nutzt etablierte E. coli-Stämme für Protein-Engineering. Zusätzlich wird die Plasmid-Vektor enthält einen T7-lac-Promotor und das Ampicillin-Resistenzgen für die stabile Expression des rekombinanten Proteins.

Nach Erhalt hochgereinigter Plasmid subklonierten, ist die erste Hauptverfahren, um das Zielprotein erfolgreich Transformation in die Wirtszelle und Bestimmung der Löslichkeitdas Protein. Testausdrücke sind die beste Zeit, um die Synthese des Zielproteins zu optimieren. Es ist wichtig, kleine, isolierte Kolonien (2A) zu zupfen bessere Auswahl der Bakterienzellen, die das Plasmid gewährleisten. Fehlerbehebung Strategien wie erneutes Ausstreichen, um die Kolonien zu verteilen oder Inkubation Agar-Platten für kürzere Zeiträume, die zu besserer Kolonie Formationen unterstützen. Es ist keine Überraschung, dass rekombinante Proteinproduktion induziert Stress auf den Wirtsstamm ^36. Während dieser Phase, wenn Ausdruck ist schlecht, Faktoren wie Antibiotika und IPTG-Konzentration sowie Induktionszeit und Temperatur können eingestellt werden, um die optimale Zielprotein (für Übersichten siehe ^37-38) zu erreichen. Dies wurde für NGF gesehen, wo der beste Ausdruck resultierte aus Induktion über Nacht bei 18 ˚ C (Abbildung 2E).

Sema3A führte zu Proteinproduktion für nativen Bedingungen aber nonnative Isolierung zeigte keine Proteinproduktion (3B). Hauptkulturen von NGF wurden für 4 Stunden bei 37 ˚ C und über Nacht bei 18 ˚ C induziert und unter nativen Bedingungen isoliert. FPLC-Reinigung produzierte eine geringere Ausbeute von NGF im Vergleich zu Hauptkulturen, die nonnatively nach Induktion über Nacht bei 18 ˚ C (3A) isoliert wurden. Die Bildung von Proteinen in Einschlusskörpern wird im allgemeinen als unerwünscht sein, da Renaturierung ist manchmal schwierig und nicht immer erfolgreich. Dies hat zu der Entwicklung von Techniken geführt, um die Proteinlöslichkeit einschließlich der Zugabe von löslichen Proteinsequenzen ^39-41 zu erhöhen. Allerdings Proteine ​​haben gezeigt, dass Formen der Konformationen besitzen, während isoliert in Einschlusskörpern, und Parameter wie geringere Induktion Temperaturen helfen, diese Strukturen zu erhalten aktive ^42-46. Wenn ein Protein nur in der unlöslichen Form exprimiert werden, ist es normalerweise möglich, wiederNatur, die das Protein nach der Isolierung mit einfachen Techniken mit sehr wenig Ertragsverlust, wie wir zuvor ²¹ berichtet.

Wir haben gezeigt, wie man erfolgreich konstruieren und produzieren biotinylatable Proteinen unter Verwendung eines E. coli-Klonierungs-und Expressionssystem wie der Host wobei etwa 8-10 mg / Hauptkultur von 2 L. Es ist zu beachten, dass die allgemeine Sequenz von Ereignissen gleich bleibt, wenn die Herstellung neuer rekombinanter Proteine ​​(Abbildung 1), jedoch jeweils individuell gemacht Protein sollte von Fall zu Fall behandelt werden, um festzustellen, wie speziell produzieren die höchste Ausbeute an gereinigtem Produkt werden. Wir haben gezeigt, wie NGF und Sema3A anders in der gleichen Anbausystem und wie sie ihre Produktion zu optimieren verhalten. Außerdem sind wir derzeit mit einem anderen E. B coli Wirtsstamm, der ^in-vivo-47 für andere Zielproteine ​​biotinylieren können, was die Bedeutung des staying über die laufenden Entwicklungen und Änderungen in Bezug auf rekombinanten Protein-Engineering gut informiert.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Autoren danken der University of Akron für die Finanzierung, die diese Arbeit unterstützt bestätigen.