신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

biotinylatable 융합 단백질을 개발하는 연구의 다양한 분야에서 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 재조합 단백질 공학은 맞춤 설계된 단백질의 높은 수율을 제공하는 비용 효율적인 정직 절차입니다.

재조합 단백질 공학은 대장균에게 (대장균) 식으로 거의 4 수십 년 동안 시스템, 오늘을 활용했다 E. 대장균은 여전히 가장 널리 사용되는 숙주이다. 시스템의 유연성은 (스트렙 트 아비딘 상호 작용을위한) 비오틴 태그와 같은 잔기 및 녹색 형광 단백질 또는 체리 적색 단백질과 같은보다 큰 단백질의 기능성 또한 허용한다. 또한, 번역 후 변형을 부여하는 금속 이온의 킬레이트 고유 반응성 작용기, 분광 프로브, 분자와 같은 부 자연스러운 아미노산의 통합은 단백질의 특성과 기능을 더 잘 조작을 가능하게했다. 따라서이 기술은 연구의 다양한 분야에 대한 중요한 유틸리티를 제공하는 사용자 정의 융합 단백질을 생성합니다. 보다 구체적으로, biotinylatable 단백질 서열 때문에 아비딘 및 스트렙 타비 딘과 비오틴 사이의 높은 친 화성 상호 작용의 다양한 표적 단백질에 통합 된. 이 추가 태그 단백질의 검출 및 정제를 강화뿐만 아니라 세포의 정렬과 같은 보조 응용 프로그램을위한 길을 열어 주었있다. 따라서, 비오틴 표지 분자는 바이오 산업 및 생명 의학 분야에서 증가하고 광범위한 영향을 보여줍니다. 우리의 연구의 목적을 위해 우리는 신경 성장 인자 (NGF) 및 semaphorin3A (Sema3A) 기능 영역을 포함하는 비 오티 닐화 재조합 융합 단백질을 설계했다. 우리는 이러한 비오틴 융합 단백질은 다른 활성 단백질 서열과 함께, 조직 공학 및 재생을 위해 생체 적합 물질에 닿는 할 수있는 방법을 이전에보고했다. 이 프로토콜은 T7의 락의 유도 성 벡터와 E를 활용하여, 밀리그램 규모 엔지니어링 biotinylatable 단백질의 기본 사항을 설명합니다 변환하는 스케일 업 (scale-up) 및 정화부터 대장균 발현 호스트.

단백질은 궁극적으로 적절한 조직 형성과 조직에 이르는 많은 생물학적 기능에 대한 책임은 생체 분자의 넓은 범위를 커버. 이 분자는 인체 내에서 평형을 유지, 규제 업 및 / 또는 아래로 조절 유전자와 다른 단백질의 제어 신호 전달 경로의 수천을 시작합니다. 하나의 단백질의 중단은 치명적인 장애 또는 질병의 발병으로 이어질 수있는 신호의이 웹 전체에 영향을 미칩니다. 실험실에서 각각의 단백질을 설계하는 것은 이러한 부작용을 퇴치하기위한 하나의 솔루션을 제공하고 작은 분자 약물에 대한 대안을 제공합니다. 1977 년 14 아미노산 소마토스타틴 서열을 코딩하는 유전자가 E.을 사용하여 만든 제 설계 폴리펩티드 중 하나였다 대장균 ^1. 곧 1979 년, 인슐린, 플라스미드 나 pBR322에 복제 변형, 표현, ² 정제 하였다. 그 이후로, 재조합 단백질은 입술의 여러 필드에 자신의 영향력을 확대earch 등 생체 적합 물질, 약물 전달, 조직 공학, 바이오 의약품, 농업, 산업 효소, 바이오 연료 등 (리뷰를 참조에게 ^3-8 참조). 이 기술을 포함한 목적 주문형 화학 잔기 또는 단백질 서열의 첨가를 통해 제공하고 있지만, 표적 단백질 식별, 안정화 및 정제에 한정하지 않는 것이 범용성 크게 때문이다.

재조합 DNA 기술을 통해, 재조합 단백질은 포유 동물, 식물, 곤충, 효모, 균류 또는 박테리아 등의 진핵 및 원핵 숙주 다양한 시스템에서 발현 될 수있다. 각 호스트는 서로 다른 장점을 제공하며, 일반적으로 가장 좋은 시스템은 단백질 기능, 수율, 안정성, 전반적인 비용 및 확장 성을 기준으로 결정됩니다. 박테리아 세포는 종종 진핵 호스트 (즉, 당화, 디설파이드 브리지, E에게 제공하는 번역 후 변형 메커니즘을 결여 TC.) ^5. 그러나 이러한 호스트는 일반적으로 더 많은 비용과 시간이 많이 ^구를 수 있으며 결과적으로, 포유 동물 및 곤충 시스템은 보통 진핵 단백질의 더 나은 호환성 및 식 초래한다. 따라서, E. 세포가 저렴 성장 조건에서 급속하게 확장하고 유전자 발현 메커니즘이 잘 ^{5,9 이해하고} 있기 때문에 대장균은 우리의 발현 시스템에 대한 선호 호스트입니다. 또한,이 시스템은 번역 후 변형 ^(10)의 부족에도 불구하고 생산의 목적과 기능 단백질의 결과에 대한 최대 크기를 조절하기 쉽다. E. 이 변형이 높은 변환 효율에 따라 우수한 플라스미드 수율을 제공하기 때문에 대장균 K12 균주 복제에 대해이 프로토콜에서 선택된다. 또한, E. 이 호스트의 변형을 제어 단백질 발현과 안정성 ^11를 제공하는 T7의 RNA 중합 효소 유전자를 포함하고 있기 때문에 대장균 BL21 균주 발현에 이용된다.

시험 식 (소량 배양) 정제 과정을 공식화하거나 수용성 또는 불용성 인 형태로 표현 될 수있는 표적 단백질의 존재 및 용해도를 결정하기 위해 사용된다. 박테리아 세포 내에서 발현 수용성 단백질의 기본 구조 ^(19)를 유지하기 위해 자연 폴딩을 받게 될 것이다. 일반적으로 기본구조는 열역학적으로 바람직하다. 많은 경우에 숙주의 대사 활동은 불용성 단백질 생산 및 불용성 단백질 응집체 이루어지는 봉입체의 형성에 이르게 시스템에 응력을 배치, 표적 단백질에 공헌하지 않다. 따라서 표적 단백질은 일반적으로 ²⁰ 생물학적 비활성들을 렌더링 변성. 두 시험 식은 업 스케일링하고, 분리 과정은 표적 단백질의 용해도에 의해 결정된다. 추가 탈 변성 또는 단계 폴딩은 불용성 단백질이 필요합니다. 얻어진 재조합 단백질을 더욱 크기 배제 크로마토 그래피를 이용하여 정제 할 수있다.

집에서 재조합 단백질 생산을 목적 단백질의 밀리그램의 주요 문화 리터당 고립 될 수 있기 때문에 상용 제품을 통해 비용 이점을 제공합니다. 필요한 장비의 대부분은 일반적인 생물 또는 화학 실험실에서 사용할 수 있습니다. 단백질 공학은 생성 가능항상 상업적으로 사용할 수없는 추가 기능과 사용자 지정 융합 단백질. 1 공학 재조합 단백질과 관련된 주요 절차를 묘사 그림. 이 식 시스템을 통해 우리는 인터페론 - 감마, 혈소판 유래 성장 인자 및 뼈 형태 형성 단백질 ^{21 ~ 23} 많은 biotinylatable 단백질을 생성했다, 그러나 우리는 우리가 축삭지도, NGF (29 kDa의를 위해 디자인이 단백질에 초점을 맞출 것이다 ) 및 Sema3A (91 kDa의) ¹⁰ (검토) ^24을 참조를 참조하십시오. 바이오 티 닐화 식별, 고정 및 잘 알려진 비오틴 - 스트렙 타비 딘의 상호 ^작용을 이용하여 ^{25 ~ 27라는} 단백질의 분리에 대한 일반적인 기술입니다. 생물 물리학 프로브 ^{(28, 29)은 30} 바이오 센서, 양자 도트 ^(31)는 10 ^-15 M ^(27)의 순서에 K _d의 비오틴 - 스트렙 타비 딘 활용의 높은 선호도를 활용 시스템의 몇 가지 예입니다. E. 대장균 바이오주석 리가, 피라는, 비오틴에서 발견 라이신 사이드 체인에 비오틴의 공유 결합에 에이즈 순서 ^{18,32 태그.} 재료 및 생체 분자에 테 더링 비오틴은 여러 조직 공학 응용 프로그램 ^21,33-35에 대한 세포에 성장 인자의 지속적인 전달을 생산하고있다. 따라서 이러한 맞춤 설계 biotinylatable 단백질을 설계하는 것은 여러 연구 분야를 초월 할 수있는 강력한 도구입니다.

1. 대상 단백질의 설계

1. 생명 공학 정보를 웹 사이트에 대한 국립 센터를 사용하면 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 계정으로 관심 및 스플 라이스 변종의 종류를 복용 표적 단백질에 대한 아미노산 서열을 얻을 수 있습니다. 또한 단백질의 활성 영역에 해당하는 아미노산 서열을 선택한다.
   참고 : Sema3A를 들어, 아미노산 21-747가 선택되었다. 융합 단백질 barstar, 아미노산 1-90의 서열, NGF 아미노산 122-241에 첨가 NGF로 설계 하였다.
2. N-말단은 다음 시퀀스에 추가하려면 : 정화 6X - 그의 태그 (HHHHHH), 담배 식각 바이러스 그의 태그의 제거 (TEV) 단백 분해 효소 절단 사이트 (ENLYFQG을), 비오틴은 K (GLNDIFEAQKIEWHE)에서 단백질의 바이오 티 닐화에 대한 일련의 태그 적절한 단백질 접힘 (EFPKPSTPPGSSGGAP)를위한 공간을 허용 할 틈 유연한 힌지.
   참고 :이 시퀀스는 원하는 융합 제자에 따라 달라질 수 있습니다EIN.
3. 원하는 호스트 종과 합성 유전자 설계 / 최적화를 위해 회사 전체 아미노산 서열을 보냅니다. 키트를 사용하여 효소 BamHI-NotI을 사이트를 선택하여 벡터에 또는 상용 서비스를 이용하여 서브 클론.

2. 한천 플레이트를 만들기

참고 : 등 항생제, 접시, 버퍼의 모든 주식은 (온도 및 시간)가 제대로 저장되는 것이 매우 중요하다 (살균) 단백질 분해 효소의 무료 남아있다.

1. 유리 미디어 병에 20g / L 및 장소에서 1.5 중량 % 및 lysogeny 국물 (LB)에서 한천을 달다. 500 ㎖ 병은 약 15 판을 만든다.
2. 용적 측정, 초순수 물을 잘 혼합하고, 오토 클레이브.
3. 터치에 병이 식도록하고 적절한 항생제를 추가합니다. 병이 너무 냉각 및 솔루션이 응고하기 시작하면 그러나, 전자 레인지에 데워, 한천의 조기 응고를 피하십시오.
   주 : 우리의 플라스미드는 암피실린 저항 세대를 포함전자. 따라서 모든 단계는 100 ㎍ / ml로 암피실린을 포함해야합니다. E. 대장균 복제 K12 균주는 테트라 사이클린 (12.5 ㎍ / ml)에 항생제가 필요합니다. BL21 박테리아 세포는 추가 항생 물질을 필요로하지 않는다.
4. 90mm 배양 접시에 용액을 25 ~ 30 ㎖를 붓고 건조 시간이 필요합니다.
5. 적절한 항생제와 파라 필름 4 ° C, 또는 다시 봉합 할 수있는 봉투에 보관 거꾸로와 라벨 요리.
   주 : 플레이트는 약 1 개월에 좋다.

3. 비오틴 태그가 플라스미드의 클로닝

참고 : 조건이 무균 적으로 수행됩니다.

1. 펠렛하기 위해 3 분 6,000 XG에서 플라스미드 벡터를 스핀 다운, 살균 초순수의 10 μl를 추가합니다.
2. 화학적으로 유능한 E.의 50 μl를 제거 -80 ° C에서 즉시 대장균 높은 변환 효율 세포는 5 ~ 10 분 동안 얼음에 배치합니다.
3. 0.5 ng/50에서 벡터 솔루션 1 μl를 추가56, 50 μL E.에 L 세포 콜라이 세포와 C. -80 °에서 잔존 플라스미드를 배치
4. 5 분 동안 얼음에 벡터를 포함하는 박테리아 세포를 놓습니다.
5. 열 충격 다시 2 분 동안 얼음에 42 ° C의 물을 욕조 및 장소 세포의 30 ~ 45 초 동안 세포와 벡터 혼합물.
6. 이화 탄압 (SOC) 배지 (2 % V의 효모 추출물 / W, 0.5 % W / V 박토 효모 추출물, 8.56 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 20 mM의 _망초, 20 mM의 포도당 슈퍼 최적의 국물 250 μl를 추가합니다 , 초순수, 산도 = 7.0) 및 30 분 동안 37 ° C에서 250 rpm으로 흔들.
   참고 : SOC가 멸균하지 않아야하지만, 필터는 0.22 μm의 필터를 통해 살균 될 수있다.
7. 건판 이전에 세포를 도금에 10-15 분.
8. 피펫 25, 50 및 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 및 테트라 사이클린 (12.5 ㎍ / ㎖)을 함유하는 항생제 별도 한​​천 플레이트 상 세포 용액 100 μL. 한천 플레이트에 균일하게 솔루션을 배포하는 유리 구슬을 사용합니다.
<리> 15 ~ 18 시간 동안 37 ° C에서 접시에게 거꾸로 품어.
9. 접시에 작은 개별 박테리아의 식민지를 확인하고 추가 사용 (그림 2A)까지 4 ° C에서 거꾸로 저장합니다.
   1. 더 콜로니가 존재하지 않는 경우 :
      1. 버퍼와 공급의 신선함과 불임을 확인합니다.
      2. E. 추가 플라스미드의 양을 증가 대장균 K12 균주.
   2. 큰 식민지가 존재 또는 식민지 (그림 2B 및 2C)의 전면에 자라 난이있는 경우, 낮은 볼륨에서 멸균 접종 루프 또는 플레이트의 세포를 사용하여 새로운 한천 플레이트를 restreak.
10. 접종 5 ㎖ 변형 E.의 단일 콜로니로 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 및 테트라 사이클린 (12.5 ㎍ / ㎖) 항균제를 함유하는 LB 대장균 세포. 성장 - 업 셀 하룻밤 250 ~ 300 rpm에서 37 ° C에서.
11. 다음날, 밤새 GRO로부터 타겟 벡터를 분리하기 위하여, 플라스미드 아이솔레이션 키트를 사용W 업 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 저장할 정제 플라스미드.
    1. 선택 사항 : 260, 280 nm에서 얻은 흡광도 수치를 사용하여 플라스미드의 순도와 농도를 확인합니다.

4. 식 호스트에 플라스미드의 변환

참고 : 조건이 무균 적으로 수행됩니다.

1. 반복 E. 위해 3.2-3.10 단계 다음과 같은 변경 사항과 대장균 BL21 세포 :
   참고 : BL21 세포 따라서 만 암피실린 변환을위한 한천 플레이트에 추가, 추가 항생제가 필요하지 않습니다.
   1. 50 μL E.에 단계 3.12에서 0.5 ng/50 ㎕의 세포에 고립 된 플라스미드의 2-5 μl를 추가 대장균 발현 숙주 세포.
   2. 60 ~ 90 초 동안 열 충격 세포.
   3. 60 분 대신 30 분 동안 250 rpm에서 솔루션을 포함하는 SOC 매체를 흔들어.
2. 아이돌 마스터와 페트리 접시에서 변형 박테리아 세포의 단일 식민지를 뽑아일 주걱 스틱과 장소 암피실린의 적절한 농도 (100 ㎍ / mL)로 5 ㎖ LB 배양액을 포함하는 테스트 튜브.
3. 250 rpm으로 37 ° C에서 하룻밤 진탕에서 테스트 튜브를 놓습니다.
4. 다음날 아침, 밤새 성장까지 200 μL을 100 ㎍ / ml로 암피실린을 포함하는 5 ㎖의 LB에 추가합니다.
5. 750 μL의 문화 (멸균) 250 ㎕의 50 % 글리세롤 나머지 세포를 동결 -80 ° C에 보관
   참고 : 새로운 테스트 식 및 규모 확대 절차 냉동 세포의 스크 레이 핑을 얻기 위해 멸균 주걱 스틱을 사용하고 적절한 항생제로 LB를 접종하여 수행 할 수 있습니다.
6. 광학 밀도 (OD)를 600 ㎚의 흡광도에서 0.7 ~ 0.8 사이에서 측정 될 때까지 37 ° C에서 250 ~ 300 rpm에서 진탕 테스트 튜브를 놓습니다.
7. 최종 농도 1mM IPTG로 세포를 유도한다.
8. 300 rpm에서 37 ° C에서 추가로 4 시간 동안 흔들어. 또는 세포는 또한 수250 ~ 300 rpm으로 18 ° C에서 하룻밤 흔들릴 수. 이것은 표적 단백질에 따라 플라스미드의 높은 수율을 생산할 수있다.
9. 테스트 식의 나트륨 황산 도데 실 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 분석
   1. 1.5 ML 튜브에 문화와 장소 500 μl를 가져 가라. 5 분 동안 13 ~ 15 XG에 스핀 다운. 상층 액을 붓고 레이블 "가용성을." 로딩 염료 (50 μL 2 - 머 캅토 에탄올, 950 ㎕의 램리 샘플 버퍼)의 200 μL의 소용돌이로 교반과를 Resuspend 펠릿.
      참고 : 용해 박테리아 펠릿은 재조합 단백질은 박테리아 세포의 세포질 영역에 있는지 결정하기 위하여 사용될 것이다. 펠렛은 필요할 때까지 염료를로드하지 않고 -80 ° C에 저장 될 수있다. 변형 또는 유도되지 않은 제어 박테리아 문화 가용성뿐만 아니라 비교를 처리 할 수있다.
   2. 1.5 ML 튜브에 문화와 장소의 1,000 μL를 가져 가라. 5 분 동안 13 ~ 15 XG에 스핀 다운.상층 액을 붓고 레이블 "불용을."
      참고 : 불용성 펠렛 박테리아 세포의 봉입체에있는 단백질을 방출하기 위하여 아래 변성 절차를 거칠 것이다. 필요할 때까지 펠릿을 -80 ° C에 저장 될 수있다. 변형 또는 유도되지 않은 제어 박테리아 문화 불용성뿐만 아니라 비교를 처리 할 수있다.
      1. 200 μL Bugbuster에 불용성 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 30 분 동안 남겨.
      2. 5 분 동안 13 ~ 15 XG에 다시 샘플을 스핀 다운 및 뜨는의 50 μl를 가지고 새로운 "불용"1.5 ML 튜브에 추가합니다.
      3. 그런 다음이 새로운 샘플을 로딩 염료의 50 μl를 추가합니다.
   3. SDS-PAGE 분석을위한 단백질을 변성 5 분 동안 모두 수용성과 불용성 샘플을 끓인다.
   4. 표준 사다리와 전기 영동 젤에 각각의 샘플을로드합니다.
   5. 시각화하기 위해 단백질 시료는 stainin를 사용G 시약 회사의 프로토콜을 따르십시오.
   6. 단백질은 SDS-PAGE 겔 (그림에서 (참고 4.9.1과 4.9.2)이 두 차선을 비교뿐만 아니라 수용성과 불용성 제어 차선으로 차선을 비교하여 가용성 및 / 또는 불용의 표현 여부를 결정 2). 어두운 밴드는 가용성 또는 불용성 차선에있는 단백질의 분자량 주위에 나타납니다. 이것은 어떤 분리 절차는 프로토콜 6에서 사용하는 결정합니다.
      참고 : 밴드 분리 방법은 재조합 단백질의 높은 수율 (도 3)를 생성하는 결정하기 위해 프로토콜 6에서 사용한 절연 아래 수행 될 수 있거나, 단백질이 두 가지를 단리 할 수있다 하나보다 이들 영역의 양쪽에있는 경우에 .
   7. 4 시간 밤새 유도가 실시 된 경우, 스케일 - 업 (scale-up)의 가장 높은 단백질 생산 (그림 2)가 유도하는 방법을 결정합니다.

5. 스케일 업 절차 및 주요 문화

1. 좋아요 국물의 85.7 g, 1.8 초순수의 L과 1 시간 동안 액체 사이클에 오토 클레이브의 50 % 글리세롤의 28.8 ㎖로 성장 미디어를 준비합니다.
2. 4.5 단계에서 만든 냉동 세포 주식에서 하룻밤 문화를 시작합니다.
   참고 : 조건이 무균 적으로 수행됩니다.
   1. 멸균 된 125 ㎖의 삼각 플라스크에 100 ㎍ / ml로 20 LB의 ML 암피실린의 최종 농도로 혼합.
   2. 멸균 주걱 스틱을 사용하면 변형 E.의 폐차을 대장균 세포와 플라스크에 드롭 도포. 거품 스토퍼면에 도포 스틱 및 플러그 플라스크를 제거하고 불임을 유지하기 위해 알루미늄 호일로 커버합니다.
   3. 37 ℃에서 250 rpm으로 밤새 흔들어
3. 주 문화
   참고 : 조건이 무균 적으로 수행됩니다.
   1. 멸균 성장 매체의 1.8 L에 하룻밤 문화를 붓고 10에서 암피실린을 추가0 ㎍ / ㎖의 파스퇴르 피펫을 사용하여 멸균 소포제 (204)의 6 ~ 8 방울.
   2. 폭기 돌을 통해 문화에 압축 공기 버블을 여과 0.2 mm와 37 ° C의 물을 욕조에 넣고 문화.
   3. 외경 _{600 ㎚가} 0.7 ~ 0.8에 도달하면, IPTG (1 ㎜)로 유도하고 유도 단계 4.9 SDS-PAGE에서 수용성 / 불용성 결과에 따라 18 ° C에서 37 ° C 또는 야간 4 시간 인해 발생할 수 있습니다.
4. E. 수집 대장균 세포
   1. 4 ℃에서 14,000 XG에 15 분 동안 1 L의 원심 분리기 병 (2 병 / 문화)에서 세포 배양을 스핀 다운
   2. 상청액을 따르고 얇은 주걱을 이용하여,이 박테리아는 50 ㎖ 튜브에 펠렛 국자. 세포는 몇 분 동안 원심 분리에 의해 다시 펠렛 화 될 수있다.
      참고 : 각 1.8 L의 문화는 두 가지 박테리아 펠렛, 각 50 ㎖의 원심 분리 관에 하나 발생합니다.
   3. 단백질 분리 될 때까지 -80 C에 보관 펠렛.

6. 분리 및 재조합 단백질의 정제

단백질이 단계 4.9 SDS-PAGE 분석을 기반으로 가용성 영역에있는 경우 다음 "기본 절연은"사용됩니다 만, 불용성 단백질 "비 고유 분리"절차를 수행합니다 : 참고.

1. 세포 용해
   1. 비 고유
      1. 제거 E.에게 전환 대장균 펠렛 -80 ° C 냉동고에서, 각각의 원심 분리 관에 20 ㎖ 용해 / 워시 버퍼 (표 1)를 추가합니다.
      2. 소용돌이하고 해동하고 큰 덩어리없이 완충 용액에 가용화 될 때까지 고정 된 펠렛을 흔들. 하룻밤 nutator에 품어. 다음날 아침, 펠릿 이제 버퍼로부터의 단백질 변성으로 인한 점성 슬러리이어야한다.
      3. 실온에서 30 분 동안 20,500 XG에 슬러리를 원심 분리기. 격리를위한 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
   2. 기본
      1. 확보 변형 E. -80 ° C 냉동고에서 대장균 펠렛.
      2. 30 ML의 최종 볼륨에 도달하기 위해 원심 분리 관에 용해 버퍼 (표 1)를 추가하고 텍싱 엄격 흔들어 냉동 펠렛을 제거. 얼음에 펠렛을 놓습니다.
      3. 1 ~ 2 분 동안 100 %의 진폭에서 70 % 에탄올로 초음파 분쇄기 프로브를 씻으십시오. 그 후 초순수로 반복합니다.
      4. 초음파 처리 세균은 5 분 (10 분의 총 경과 시간) 얼음에있는 동안 펠렛.
         1. 초 Off on/30 30 초 펄스로 30 % 진폭에서 초음파기를 설정합니다.
         2. 밥 원심 분리기 튜브까지 완전히 세포 펠렛을 분쇄하기 위해 초음파 간격 동안 다운. 총 경과 시간의 끝에서 눈에 보이는 박테리아가 힘줄, 점성 슬러리를 떠나 펠렛 없을 것.
         3. 다른 단백질 절연 부 사이의 초음파기 프로브를 청소뿐만 아니라 단계 6.1.2.3에 설명 된대로 70 % 에탄올 및 초순수를 사용하여 저장.
      5. 30 분 동안 4 ° C에서 20,500 XG에 슬러리를 원심 분리기. 격리를위한 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
2. 니켈 - NTA 친 화성 크로마토 그래피
   1. 비 고유
      1. 추가 1 ㎖의 Ni ^{2 +-NTA} 각 원심 분리 관 (1.8 L의 문화에 대한 2 ㎖ 수지 전체)에 수지 용액 및 nutator에 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다.
      2. 친 화성 컬럼에 슬러리를 붓고 솔루션 폐기물 비커에 완전히 코크 밸브를 통해 똑똑 떨어지는 것을 허용한다.
      3. 각 세척을위한 용해 / 워시 버퍼 10 ㎖로 10 세척을 수행합니다.
         1. 처음 두 세척의 경우, 추가로 수지를 제거한 다음 컬럼에 부어 원심 분리 관에 10 ㎖를 추가합니다. 추가적인 세척 컬럼에 직접 첨가 될 수있다.
         2. 각 세척 후, 유리 교반 막대를 가진 수지를 교반 하였다. 세척 폐기물 비이커에 적하되면, 다음 10 ㎖를 첨가 할 수있다.
      4. 후 완전히 박사를 씻어를 통해 인 IP 가까운 콕 밸브, 폐기물 비커를 제거하고 단백질 수집을위한 50 ㎖ 원심 분리 관으로 교체합니다.
      5. 용출 버퍼 (표 1) 15 mL를 넣고 저어 업 수지를, 용액을 5 분 동안 앉아있게. 오픈 스톱 콕 밸브 및 수집 용출. 추가로 15 ㎖로 다시 반복합니다.
   2. 원주민
      1. 다음 매개 변수를 조정을 제외하고 (단계 6.2.1.1-6.2.1.4) 위의 비 고유 친 화성 크로마토 그래피를 수행
         1. 니켈 ^2를 nutator에 적어도 1 시간 동안 4 ° C에서 ^+-NTA 수지 용액을 품어.
         2. 적절한 세척 버퍼 (표 1)를 사용합니다.
      2. 용출 버퍼 (표 1) 5 mL를 넣고 5 분 동안 수지를 품어.
         1. 오픈 스톱 콕 밸브 및 솔루션의 가장 때까지 용출를 수집 통해 떨어 뜨린.
         2. 96 - 웰 플레이트를 취소 90 μL / 잘 브래드 포드 시약을 추가합니다. 각 용출 허용 한 후 지금의 10 μL물론 90 μL 브래드 포드 시약을 포함에 열에서 똑똑 떨어지는 것을 lution.
         3. 브래드 분석이 더 이상 단백질 (색 취소 연한 파랑으로 어두운 파란색에서 진행) 감지 할 때까지 한 번에 5 ㎖의 용출 버퍼를 계속 추가합니다. 이것은 보통 4-5 용출 볼륨을합니다.
3. 투석 / 탈 변성
   1. 4 ° C에서 비 고유 (탈 변성) 및 기본 투석 버퍼 (표 1) 및 저장을
      참고 : 투석 버퍼의 pH는 목적 단백질의 등전점 (PI)에 의해 결정된다. 엄지 손가락 단백질의 규칙은 파이 값의 위 또는 아래에 적어도 하나의 전체 포인트를 버퍼링해야으로.
   2. 적절한 분획 분자량 (Sema3A에 대한 NGF 50,000 MWCO 25,000 MWCO)으로 투석 튜브에 네이티브 및 비 고유 용리를 전송합니다. 4 ° C에서 4 시간 동안 각각의 투석 버퍼 1에 각각의 단백질 샘플을 위치하게 한 후, 각각의 버퍼 2 이상으로 교체4 ° C. 밤
      참고 : 단백질이 적절한 접힘과 자리를 차지할 버퍼 교환을위한 최소 4 시간 동안 각 버퍼에 투석해야합니다.
   3. 원심 회전 농축기를 사용하여보다 5 ㎖에 투석 단백질 용리을 집중한다.
      주 : 단백질이 더 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)를 사용하여 정제하고 다시 농축 할 수있다.
4. 동결 preweighed microcentrifuge 관에 10 ~ 50 ㎖의 시료를 건조하여 단백질 농도 (㎎ / ㎖)을 결정합니다.
   1. 선택적 : C는 L은 경로 길이 인 _{280 ㎚} / εl을 = 흡광 계수를 결정하는, ε, 단백질의 농도가 맥주 램버트의 법칙을 이용하여 280 nm에서 샘플의 흡광도를 측정함으로써 향후 아이솔레이션에서 결정될 수있다.

7. 정제 된 단백질의 바이오 티 닐화

1. 10,000 MWCO 투석 카세트 AG에서 단백질을 Dialyze10 mM 트리스 ainst (산도 = 8.0), 6 변화의 총 버퍼마다 4 시간을 변경.
2. 바이오 티 닐화 2 ML 마이크로 원심 분리기 튜브에 (지금은 10 mM 트리스 버퍼) 재조합 단백질을 전송합니다.
3. 바이오틴 단백질 리가 제 키트를 사용 Biotinylate 단백질.
4. 3 버퍼 10,000 MWCO 투석 카세트를 사용하여 PBS (산도 = 7.4)에 대한 단백질을 Dialyze 2 일간 하루를 변경합니다.
5. 정량 키트를 사용하여 단백질의 %의 바이오 티 닐화를 결정합니다.
6. 4 ° C에서 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 나누어지는 및 저장에 6.4 및 저장에 설명 된대로 다시 농도를 결정합니다.

복제 및 테스트 식

도금이 정상적으로 수행 될 때, 하나의 고립 된 콜로니를 형질 전환 박테리아 클론 세포 (도 2A)를 버릴 가능성을 증가시키기 위해 형성한다. 너무 많은 세포를 도금하는 경우에는, 플레이트는 37 ° C의 또는 변환에 너무 오래 배양 식민지는 한천 플레이트를 덮거나 세포의 큰 집계 (그림 2B 및 2C)를 형성 할 수있다, 의문이다. 테스트 식 중, NGF와 Sema3A 먼저 37 ° C에서 4 시간 동안 유도 SDS-PAGE 분석은 두 단백질이 가용성 분획 (그림 2D)에 위치하고 있었다 결정되었다. 단백질 발현은 공정하고, 따라서 18 ° C에서 하룻밤 유도와 다른 테스트 식을 조사 하였다 보였다. Sema3A (그림 2E)과 눈에 띄는 차이는 없었다 반면 NGF는 가용 더 나은 표현의 결과.

NGF와 Sema3A 둘 상기 프로토콜에 설명 정화용 FPLC 컬럼을 통해 실행 네이티브 분리 기술을 이용하여 분리 하였다. 또한이 재조합 단백질은 고립되었고 nonnatively 정제. NGF는 테스트 표현식 동안 가용에 있었다하더라도, 기본 분리 절차는 모두 37 ° C (2 L의 4.57 ㎎ / 주 문화), 18 ° C 2 L의 (6.11 ㎎ / 주 배양 후 NGF의 낮은 수율을 생산; 그림 3A, 실선) 입회식. 그러나, NGF의 높은 수율을 탈 변성과 비 고유 분리를 통해 얻은 것 (10.72 ± 1.8 ㎎ / 주요 문화 L 2, 그림 3A, 점선) 18 ° C, 밤새도록 유도 후. 한편, 비 고유 격리는 8.61 ± 3.1 ㎎ / 주 문화 (그림 3 기본 절연을위한 L 2 없음 Sema3A 생산 (그림 3B, 점선)의 결과 B, 실선). Sema3A 37 ℃에서 유도의 4 시간 후 기본 격리를 시행하는 반면 그 결과, NGF는 18 ° C에서 밤새도록 유도 후 비 고유 조건에서 고립 된 FPLC 피크를 수집하고, NGF와 Sema3A 시료는 SDS-PAGE (도 3)로 분석 하였다. Sema3A의 FPLC 출력 (그림 3B)에있는 추가 단백질 피크를 수집하고 분석 SDS-PAGE로하고 Sema3A 분자량 지역에 위치하지 않은되었다. 그림 (b)에 나타낸 Sema3A 피크가했던 것처럼 그들은 세포 기반 분석 기능적으로 작동하지 않았기 때문에이 분수는 대부분 분해 제품입니다. 단백질은 피라 효소를 사용하여 비오틴과 미 반응 종을 제거하는 투석 하였다. 바이오 티 닐화는 비오틴 정량화 키트 및 형광 마이크로 플레이트 리더로 ​​확인되었다.

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그림 1. E.을 이용한 단백질 공학 대장균 발현 시스템. 재조합 단백질 공학의 기본 과정은 E.의 클로닝 및 발현하는 플라스미드의 디자인을 포함 대장균. 형질 전환 된 콜로니를 항생제의 사용으로 선택된다. 소정의 테스트 식은​​ 목적 단백질의 생산 및 용해성을 최적화하고 식별하는 데 사용된다. 이 절차는 스케일 업 대형 배치 cultivati​​ons (리터 규모)에. 크로마토 그래피 방법은 원하는 설계 단백질을 분리하고 정화하는 데 사용됩니다. 이러한 바이오 티 닐화으로 수정 배치 cultivati​​ons 동안이나 정제 한 후 발생할 수 있습니다.

그림 2. ONGF와 Sema3A의 테스트 식을 ptimizing. (A) 변형 E.의 25 μl를 도금 대장균 K12 세포는 작은 격리 된 식민지로 만들었습니다. 개별 식민지 테스트 식을 선택해야합니다. BL21 형질 전환 된 세포의 경우와 유사한 식민지 분포가 발생한다. (BC) 도금 50 μL와 K12 세포 100 μL는 각각 박테리아 식민지의 인구 과잉의 결과. 이 판에서 따 버릴 것은 하나의 변형 된 세포에서 파생 된 식민지를 선택하는 낮은 확률이 발생할 수 있습니다. 형질 전환 된 세포 (D) 시험 식은 IPTG와 함께 37 ℃에서 4 시간 동안 유도하고, SDS-PAGE는 NGF 융합 단백질 (29 kDa의) 및 Sema3A 융합 단백질 (91 kDa의가) 가용성 분획에서 발현되는 것을 알 수 있었다. 그러나, Sema3A에 대한 표현이 향상되지 않고, 18 ° C에서 (E) 숙박 유도 가용 여전히 NGF 식을 보여줍니다.

FPLC를 사용하여 NGF와 Sema3A의 그림 3. 정화. (A) 비 고유 격리 18 ° C 하룻밤 유도 후 (점선) 네이티브 모두 4 시간에서 분리, 37 ° C 하룻밤, 18 ° C의 입회식에 비해 더 나은 NGF 수율 결과 (실선). (B) Sema3A를 들어, 4 시간 및 기본 격리 상태로 37 ° C에서 유도 같은 재배 매개 변수에 비 고유 격리에 비해 더 나은 수율을 생산. SDS-PAGE는 FPLC 피크 컬렉션 (A) NGF와 (B) Sema3A 모두 (화살표)를 보여줍니다. 겔 여과 단백질 표준 피크의 분자량 분포를 확인하기 위해 실행하고있는 kDa의 FPLC 플롯의 배경에 표시된다.

표 1. 재조합 단백질의 분리 버퍼.

재조합 단백질 공학은 여러 분야에 걸쳐있는 매우 강력한 기술이다. 이것은 맞춤 설계 단백질의 높은 수율의 생산을 허용하고 경제적 동조하고 비교적 간단한 절차이다. 이는 설계 및 표적 단백질을 발현하는 것은 항상 간단 아니라는 것을주의하는 것이 중요하다. 기초 표현 및 재조합 단백질의 안정성은 벡터, E.의 특정 선택에 따라 달라집니다 대장균 세포주, 펩타이드 태그 추가 및 재배 매개 변수입니다. 우리의 특정 설계 기준은 잘 확립 E.을 활용 대장균은 단백질 공학에 대한 균주. 또한, 플라스미드 벡터는 T7의 lac 프로모터와 안정 재조합 단백질 발현에 대한 암피실린 내성 유전자가 포함되어 있습니다.

고순도 서브 클로닝 된 플라스미드를 얻은 후, 최초의 주요 절차가 성공적으로 숙주 세포에 표적 단백질을 변형 및 용해도를 결정하는 것이다단백질. 시험 식은 표적 단백질의 합성을 최적화하기위한 최선의 시간이다. 이 플라스미드를 함유하는 세균 세포의 더 나은 선택을 위해 작은 절연 콜로니 (도 2A)를 당기기 위해 중요하다. 이러한 짧은 시간 동안 한천 플레이트를 식민지 재배포 restreaking 또는 배양 등의 문제 해결 전략은 더 콜로니 형성에 도움을 수 있습니다. 그것은 재조합 단백질 생산 호스트 변형 ^36에 스트레스를 유도하는 것은 그리 놀랄 일이 아니다. 발현이 불량 인 경우이 단계에서, 그러한 항생제 및 IPTG 농도뿐만 아니라, 유도 시간 및 온도와 같은 요인이 최적 목표 단백질 (리뷰가 ^37-38을 참조) 달성하도록 조정될 수있다. 최고의 표현이 18 ˚ C (그림 2E)에서 밤새도록 유도에서 유래하는 곳은 NGF에 보였다.

Sema3A은 기본 조건 단백질 생산의 결과 만 nonnativ전자 절연은 단백질 생산 (그림 3B)를 보여 주었다. NGF의 주 문화는 18 ˚ C에서 37 ˚ C에서뿐만 아니라 밤새 4 시간 동안 유도 기본 조건에서 분리되었다. FPLC 정화는 18 ˚ C (그림 3A)에서 밤새도록 유도 한 후 nonnatively 고립 된 주 문화에 비해 NGF의 낮은 수율을 생산. 봉입체 단백질의 형성은 일반적으로 탈 변성 때때로 어렵고 항상 성공적이지 이후 바람직하다고 생각된다. 이것은 가용성 단백질 서열 ^39-41의 추가를 포함한 단백질의 용해도를 향상시키는 기술이 개발되었다. 그러나 단백질은 봉입체에 격리하는 동안 구조적 상태의 형태를 가지고 표시되었습니다, 이러한 낮은 유도 온도와 같은 매개 변수는 이러한 활성 구조에게 ^42-46을 유지하는 데 도움이됩니다. 단백질은 불용성 형태로 표현 될 수있는 경우는 다시 통상 가능우리가 이전에 ^{(21)를보고} 한대로 약간의 수율 손실과 간단한 기술을 사용하여 분리 한 후 자연 단백질을.

우리는 성공적으로 엔지니어링 및 E를 사용하여 biotinylatable 단백질을 생산하는 방법을 보여 주었다 대장균의 복제 및 호스트가 2 L. 그것은 약 8 ~ 10 ㎎ / 주 문화를 산출 등의 발현 시스템 (그림 1) 새로운 재조합 단백질을 제조 할 때 이벤트의 전반적인 순서는 동일하게 유지하는 것이 중요합니다하지만, 각 사용자 지정 - 제 단백질은 특별히 정제 된 생성물의 높은 수율을 생산하는 방법을 결정하는 사​​례별로 처리되어야한다. 우리는 NGF와 Sema3A 같은 재배 시스템 및 방법을 자신의 생산을 최적화하는 방법에 다르게 행동하는 방법을 보여 주었다. 또한, 우리는 현재 다른 E를 사용하는 볼래의 중요성을 보여 다른 표적 단백질에 대한 생체 내에서 ⁴⁷ biotinylate 수 콜라이 B 호스트 균주G 재조합 단백질 공학에 대한 지속적인 발전과 수정에 박식 한.

저자가 공개하는 게 없다.

저자는이 작업을 지원하는 자금 애 크런 대학을 인정하고 싶습니다.