Мы представляем В естественных условиях Анализ для проверки проницаемость кровеносных сосудов. Этот анализ основан на внутривенное введение красителя и последующей визуализацией его диффузии в интерстициального пространства.

Этот метод основан на внутривенном введении Evans Blue мышей в качестве модели испытаний на животных. Эванс синий краситель, который связывается альбумином. В физиологических условиях эндотелий является непроницаемой для альбумина, так Эванса синего связанного альбумина остается ограниченным в кровеносных сосудах. В патологических условиях, которые способствуют повышение сосудистой проницаемости эндотелиальных клеток частично теряют свои тесные контакты и эндотелий становится проницаемой для небольших белков, таких как альбумин. Это условие позволяет экстравазации Evans Blue в тканях. Здоровый эндотелий предотвращает кровоизлияние красителя в соседние ткани васкуляризированной. Органы с повышенной проницаемостью покажет значительно увеличилось синюю окраску по сравнению с органов с интактным эндотелием. Уровень проницаемости сосудов можно оценить по простой визуализации или количественного измерения красителя включены на миллиграмм ткани контроля в сравнении с экспериментальными животными / ткань. Два Пауrful аспекты этого анализа являются его простота и количественных характеристик. Evans Blue красителей могут быть извлечены из тканей путем инкубации определенное количество ткани в формамида. Evans Blue максимум поглощения находится при 620 нм и поглощения минимум при 740 нм. С помощью стандартной кривой для Evans Blue, измерения оптической плотности могут быть преобразованы в миллиграммах красителя захватили на миллиграмм ткани. Статистический анализ должен быть использован для оценки существенных различий в проницаемости сосудов.

Формирование и поддержание избирательный проницаемые барьеры, необходимые для нормального развития органов и производительностью ^1,2. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и образуют полупроницаемый барьер, который играет важную роль в избирательный перевозок между кровью и интерстициальным пространством всех органов. Адекватный барьер проницаемости поддерживается благодаря тесной клетки к клетке соединений, которые строго контролируются факторы роста, цитокины и другие связанные со стрессом молекулы ^3. Нарушение эндотелиального барьера клетки может привести к увеличению проницаемости сосудистой и утечки. Эти эффекты проявляются в различных болезненных состояний и понимание подчеркивание молекулярного сигнального требует междисциплинарных методов ^4,5. В этой статье мы опишем в естественных условиях метод измерения проницаемости судна с помощью мыши модели.

Анализ, который мы описываем, также известный как анализ Майлз, это хорошо establбедных и обнищавших слоев метод для тестирования проницаемости сосудов в естественных условиях. Анализ основан на том факте, что при физиологических условиях базальная, альбумин не пересекает эндотелиального барьера. Evans Blue, азокрасителя с высоким сродством к альбумина, вводится в кровоток подопытных животных, и в физиологических условиях, как ожидается, будет ограничен в пределах кровеносных сосудов. При сосудистой проницаемости стимул добавляется, либо местно или системно, кровеносные сосуды начинают течь белка и, таким образом, также синего Эванса, который связан с альбумином. Это приводит к быстрому голубовато окраска тканей, которые имеют проницаемые сосуды.

Успешное введение красителя в мышь латеральную хвостовую вену имеет решающее значение для хорошего результата эксперимента. Хвостовую вену инъекцию техника требует обширной практики и должны быть освоены до начала эксперимента.

Судно проницаемость сильно зависит от возраста и весамальных, так что при сравнении различных линий мышей важно, что у мышей или других испытуемых имеют близкие к идентичным даты рождения и весом. Другие факторы, которые влияют на проницаемость эндотелиального барьера условий окружающей среды, таких как температура, влажность, и очень важно, обработка стресс мыши. В связи с множеством факторов, которые могут повлиять на результаты эксперимента это всегда желательно, что эксперимент повторяется не менее трех раз и статистический анализ выполняется.

Этот анализ может быть использован либо для сравнения судна проницаемость мышей, которые были генетически модифицированы, а также мышей с различным генетическим фоном. Проницаемость может быть оценена в присутствии или в отсутствии стимула, в зависимости от функции генов, которые модулируют. Этот анализ также может быть использован и для проверки влияния различных соединений на судне проницаемость.

1. Внутривенное введение Evans Blue в мышь латеральную хвостовую вену

1. Подготовка 0,5% стерильный раствор голубого Эванса в PBS. При необходимости фильтр-стерилизовать раствором для удаления любых твердых частиц, которые не растворяются.
2. Аспирируйте 200 мкл Evans Blue раствор в шприц. Избегайте пузырьков воздуха, которые могли бы бежал в шприц.
3. Место мышей, 8-12 недель в удерживающего устройства так, чтобы животное не является свободно мобильный, но ее хвост может быть обработано.
4. Поместите устройство мыши сдержанность на бок, так латеральную хвостовую вену хорошо видно и вверх.
5. Держи хвост с не доминирующей руки между большим и указательным пальцами.
6. Вставьте иглу (малый калибр, 27-30) на 10-15 градусов, скосом вверх, продвижение в латеральную хвостовую вену в направлении головы. Держите иглу и шприц параллельно хвост.
7. Рео не применять обратное давление, чтобы подтвердить правильность размещения, так как это может рухнуть в вену.
8. Медленно вводят 200 мкл Evans Blue решение в хвостовую вену мыши.
9. Обратите внимание на легкость, с которой поршень достижений, так как это является доказательством правильное размещение иглы в вену.
10. Наведите обратно в свою клетку и соблюдать его в течение 30 мин.

2. Коллекция органной и добыча Evans Blue от органов

1. Жертва мышей через смещения шейных позвонков. Для целей анализа Miles смещения шейных позвонков рекомендуется, поскольку он ограничивает значительное вмешательство проницаемость сосудов. Жертва всех мышей в то же время, как можно быстрее. Работа с когортами 6 мышей или меньше, потому что вскоре после смерти сосудов крови становятся более проницаемыми.
2. Поместите мышь на спину и связывают свои ноги на белой доске.
3. Откройте брюшной и грудной полости подвергать ТорACIC и органов брюшной полости.
4. Возьмите представитель фотографии, чтобы показать различия в экстравазации Evans Blue. Включить все мышей в той же области, чтобы иметь одинаковые условия освещения для всех мышей.
5. Сбор органах интерес и положить их в пробирки на 1,5 мл
6. Взвесьте пустой трубы и привести балансовую стоимость до нуля.
7. Передача образца ткани и веса он. Повторите для всех образцов ткани. Ткани могут быть сушат на воздухе, устранить изменчивость содержания воды между различными органами.
8. . Добавить 500 мкл формамида в каждую пробирку образец ткани.
9. Перенесите все трубы на 55 ° C ванну воды или тепла блока. Выдержите в течение 24-48 часов, чтобы извлечь Evans Blue из ткани.

3. Количественное Evans Blue Extravasated в интерстициальной ткани

1. Центрифуга Формамид / Evans Blue смесь гранул оставшихся фрагментов ткани.
2. Измерьте абсорбцию при 610нм. Используйте 500 мкл Формамид как пустые.
3. Расчет нг Evans Blue extravasated в тканях мг.
4. Постройте все данные в виде графика.
5. Выполнить статистический анализ для определения существенных различий.

Мы использовали в анализе проницаемость естественных для проверки судна утечки на мышах 8-12 недель. Этот тест полезен при сравнении относительной проницаемости сосудов между животными разных генетических фоне или в один штамм мышей, подвергавшихся лечения, которые влияют на сосудистую систему. Наши результаты показывают, что штамм генетически модифицированных мышей, которые мы создали в нашей лаборатории имеет более проницаемыми эндотелия по сравнению с мышами дикого типа. Эти изменения очевидны на макроскопическом уровне во многих органах (рис. 1).

Мы смогли определить разницу в емкости проницаемости spectophotometricaly измерения Evans Blue, который был захвачен на грамм ткани в различных органах. Как мы видели на рисунке 2 различных органов показывают разные реакции на сигналы проницаемость индуктора и таким образом показать различные накопления красителя. Это также зависит от уровня васкуляризации в различных тканях.

Рисунок 1. Evans Blue Экстравазация в тканях. Через 30 минут после мышам инъекции голубого Эванса были принесены в жертву путем смещения шейных позвонков. Представитель изображения органов интересов были приняты.

Рисунок 2. Количественный экстравазации Evans Blue в различных тканях. 50-100 мг ткани инкубировали с 500 мкл формамида для извлечения extravasated Evans Blue. Оптическая плотность измеряли при 610 нм и измерения преобразуются в нг красителя в ткань extravasated мг. Эксперимент был повторен три раза.

Проницаемости сосудов является важным маркером для крови статуса судна. Повышенная проницаемость сосудов, как было показано присутствовать в нескольких системных заболеваний, включая диабет, гипертонию и аутоиммунных заболеваний ^6,7,8. Повышенная проницаемость сосудов была показана при посредничестве напряжения сдвига, факторы роста, как фактор роста эндотелия сосудов и фактора роста фибробластов, воспалительных медиаторов, как серотонин, гистамин и брадикинин ^9. Экстравазация воды и небольших молекул, как полагают, происходит через небольшие отверстия между клетками эндотелия. Сила клетки к клетке переходы строго регламентируется взаимодействие между молекулами ^10.

В физиологических условиях эндотелий является проницаемой для воды и ионов и непроницаема для белков. Таким образом, при отсутствии воспалительных стимулов, альбумин ограничивается приток крови и не двигается во внеклеточной жидкости. Вводя Eфургоны синий, краситель, который связывается альбумином, мы можем контролировать степень утечки белка из крови в интерстициальную ткань.

Модифицированная версия этого анализа используются флуоресцентные-меченных микросфер. При использовании различных размеров микросфер или различной молекулярной массой флуоресцентного-меченого декстрана (4-70 кДа), можно лучше оценить степень повреждения эндотелия. Однако этот вариант исключает простоты визуализации и она требует фиксации тканей и флуоресцентной микроскопии изображений, или измерение с помощью флуоресцентного ридере.

В лабораторных исследованиях судна проницаемости были успешно использованы в литературе ^11. Важным элементом любого исследования в пробирке проницаемость является нетронутым, сливающийся монослой клеток. Эти анализы использовать классическую двойную камеру, где эндотелиальные клетки культивируют в монослое на мембране расположены в верхней палате. Краситель наносится на верхнееКамера и эндотелиальной проницаемости клеточных оценивают путем измерения количества красителя, который достигает нижней палаты. Результаты имитировать в большинстве случаев в естественных результатах анализа. Тем не менее, они не имеют соответствующих физиологических контекст и тем самым осложняется сложностью результаты. В пробирке подход также устраняет роль перициты, клетки, которые, в живых тканей, находятся в тесном контакте с эндотелиальные клетки и посылать сигналы на пролиферацию эндотелиальных клеток, судно роста и ветвления.

Результаты тестов Miles в идеале должна сопровождаться молекулярных исследований, что дальнейшее изучение гипотезы, что проходит испытания. Как уже упоминалось, в целом организме, проницаемость сосудов зависит от многих переменных, и, следовательно, результаты анализа в естественных условиях проницаемости необходимо интерпретировать в свете сложности системы анализа.

Авторы не имеют никакого конфликта или конкурирующих финансовых интересов.

Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья, R01CA142928.