In Vitro Анализ PDZ-зависимый CFTR высокомолекулярных комплексов сигнализации

Муковисцидоз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR), эпителиальный канал хлорид, как сообщается, взаимодействуют с различными белками и регулировать важные клеточные процессы, среди которых CFTR PDZ мотив-опосредованного взаимодействия были хорошо документированы. Этот протокол описывает методы, которые мы разработали, чтобы собрать PDZ-зависимый CFTR макромолекулярных сигнализации комплекс В пробирке.

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis^1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)⁴ and secretory diarrhea⁵. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States⁶. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut⁷.

Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo^8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP^20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)²⁰. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities²². This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells^16-18.

Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay^16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR^16-19,28,29.

1. Выражение и очистка рекомбинантных белков слияния меткой у бактерий

1. Усиление определенных регионах С-хвосты (последние 50-100 аминокислот, содержащих PDZ мотивы в С-конца) для CFTR, ₂ МПУ, MRP2, MRP4, β ₂ AR, и NHERFs (во всю длину или PDZ1 или PDZ2 области ) на подходе ПЦР.
2. Клонирование ПЦР-продуктов в pGEX4T-1 вектор GST-синтез белков (например, GST-NHERFs, GST-MRP4 КТ), pMAL-C2 вектор MBP-синтез белков (например, MBP-β ₂ AR КТ, MBP-CFTR CT ), а pET30 Его-S-белков слияния (например, его-S-CFTR CT Его-S-PDZK1).
3. Преобразование в протеазы с дефицитом E. палочки штамма (BL21-DE3), чтобы минимизировать возможные рекомбинантный деградации белков.
4. Рост культуры в течение ночи при 37 ° C в Лурия-Бертани среды (рН 7,0), содержащий соответствующие антибиотики (например, ампициллин или канамицин). Развести ночной культуры в 1:10 и расти в течение еще 2 ч при 37 ° C. Вдуче с 0,5-1 м М ИПТГ на ближайшие 4 ч при 30 ° C. Гранул клеток путем центрифугирования при 8000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
5. Лизировать клетки Сахароза буфера (50 м М Трис-HCl, рН 8,0, 1 м М ЭДТА, 1 м M PMSF, и 10% сахарозы), содержащий лизоцим (1 мг / мл), 0,2% Triton X-100, а протеазы ингибиторы. Используйте 20 мл в осадок клеток, происходящих из 1 л культуры.
6. Смешайте на роторном шейкере в течение 30 мин при 4 ° C.
7. Спиновая на 20000 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Соберите прозрачный супернатант.
8. В прозрачный супернатант, добавляют 1 мл следующие смолы / агарозных шариков (50% раствор сахарозы в буфер):
   • Глутатион агарозном шарики для белков GST синтеза.
   • Талон бисером Его-S слитых белков.
   • Амилозы смолы для MBP белков слияния.
9. Смешать в течение 4 ч при температуре 4 ° C на роторном шейкере.
10. Вымойте бусины суспендирования в 1x PBS (15 мл), смешивание 2 милип, вращается со скоростью 800 × г в течение 2 минут, и отбрасывая супернатант. Повторите этот шаг для шесть раз.
11. Элюции белка из бисера с использованием соответствующего буфера элюирования (2 мл элюирующего буфера в 1 мл из бисера).
    • Буфер для элюции белков слияния GST: 25 м М Трис-HCl (рН 8,0), 140 м М NaCl и 20 м M восстановленный глутатион.
    • Элюирование буфер для его белков слияния: 20 м М Трис-HCl (рН 8,0), 500 м М NaCl и 200 м М имидазола.
    • Элюции буфера для MBP белков слияния: 20 м М Трис-HCl (рН 8,0), 200 м М NaCl, 1 м М ЭДТА, 1 м M DTT, и 10 м M мальтозы.
12. Диализировать элюированных белки от 2 л 1x PBS при 4 ° С (чтобы избежать возможной деградации белка). Изменение PBS каждые 4 ч в четыре раза. Концентрат белка помощью Centricon фильтр (10000 МВт среза, Millipore) и хранить в качестве небольшой порции при температуре -80 ° C.
13. Detгорностай концентрации белка методом Брэдфорд. Оцените качество белка на SDS-страницы с помощью BSA в качестве стандартов. Если целостность белка не является удовлетворительным, вторичные процедуры очистки, такие как гель-фильтрации или ионного обмена могут быть использованы. (Например, мы использовали G-75 сефарозы колонке для дальнейшей очистки GST-синтез белка).

2. Культуры клеток и подготовки Клеточный лизат

1. Культуры ребенка почек хомяка (ВНК) клеток, что стабильно более-экспресс CFTR-вес и _CFTR-his10 или ВНК клетки, которые временно по-экспресс Флаг-LPA _2-вес или флаг-LPA _2-ΔSTL и Мадин-Darby собачьи почки (MDCK ) клеток, что стабильно более-экспресс MRP2 в минимально необходимого среднего орла (MEM), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллин / стрептомицин в полистирола колбах при температуре 37 ° C с 5% CO _2.
2. Культуры человеческих эмбриональных почек 293 (HEK293) клеток, что стабильно более-экспресс CFTR-вес и _CFTR-his10 в Дульбекко"Среды с изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллин / стрептомицин в полистирола колбах при температуре 37 ° C с 5% CO _2.
3. Лизиса клеток в буфере для лизиса (PBS - 0,2% Triton-X-100 дополнена смеси ингибиторов протеаз, содержащей 1 м M phenylmethylsulphonyl фтора, 1 мкг / мл апротинина, 1 мкг / мл leupeptin, 1 мкг / мл пепстатина), использование 500 мкл буфера для лизиса для каждого 60-мм чашки Петри и 1000 мкл буфера для лизиса для каждого 100-мм чашки Петри.
4. Рок клеточных лизатов в течение 20 мин при 4 ° С, и удалить нерастворимый материал с помощью центрифугирования при 16000 х г в течение 15 мин при 4 ° C. Определение концентрации белка в анализе Брэдфорда.

3. In Vitro Ассамблеи CFTR содержащими высокомолекулярных комплекс (CFTR-PDZK1-MRP4)

1. В 200 мкл лизирующего буфера (PBS - 0,2% Triton X-100 + ингибиторы протеазы), добавьте 20 мкг очищенного GST-MRP4-C терминал50 а (CT50) гибридный белок.
2. Добавить различных количествах (0-40 мг) очищенной Его-S-PDZK1 гибридного белка.
3. Смешайте две белки на роторном смесителе при температуре 22 ° С в течение 1-2 часов.
4. Добавить 20 мкл бисером глутатион (50% раствор) в белковую смесь, и продолжать смешивать еще 1 час. Этот шаг также называют попарно обязательным.
5. За это время подготовить HEK293 клеточные лизаты, что гиперэкспрессией Флаг-CFTR (вес), как описано выше в шаге 2).
6. Вымойте комплекс дважды лизис буфера. Спиновая 800 × г в течение 1 мин для каждого мытья и тщательно аспирации супернатант после каждого мытья. Будьте осторожны, чтобы не сосать у бусин в нижней.
7. Добавьте выше подготовленные HEK293 лизатов клетки бисером, и осторожно перемешать при температуре 4 ° С в течение 3 часов (или ночь).
8. Вымойте бисером широко три раза лизис буфера, как описано в шаге 3.6).
9. Элюции белков с использованием 30 мкл буфера образца (5 ×): 0.6 M Трис-HCl (рН 6,8), 50% глицерина, 2% SDS и 0,1% бромфенола синий, содержащих 5% β-меркаптоэтанола.
10. Инкубируйте в 37 ° С на водяной бане 10-15 мин, а спина при 5000 х г в течение 30 сек для осаждения бисера.
11. Загрузите все элюата на 4-15% гель.
12. Запуск SDS-PAGE около 30-40 мин.
13. Передача белка полосы на мембрану PVDF, за 1,5 часа.
14. Блок мембраны в TBS-твин, содержащий 5% без молочного жира.
15. Инкубировать мембрану с первичными антителами (например, анти-IgG CFTR, R1104) при 4 ° C в течение ночи.
16. Промойте мембрану с TBS-Tween в течение 5 минут, в шесть раз.
17. Инкубируйте мембраны с вторичными антителами (например, антимышиного ^HRP-2 сопряженных антител) в течение 45 мин при 22 ° C.
18. Промойте мембрану с TBS-Tween в течение 5 минут, в шесть раз.
19. Визуализация белка полосы с помощью ECL.
20. Представитель данные представлены на рисунке 1.

Пример CFTR содержащих высокомолекулярные сигнализации комплекса, который был собран в пробирке показано на рисунке 1. Макромолекулярных комплекс был создан между MRP4 С-концевой 50 аминокислот (MRP4-CT50), PDZK1 и полнометражных CFTR (рис. 1, внизу). Образование комплекса увеличена в зависимости от дозы с увеличением количества посредников белка, PDZK1 (рис. 1, внизу) ^18.

Рисунок 1. Наглядное представление анализа сложных высокомолекулярных (сверху). Макромолекулярных комплекс был обнаружен в пробирке с тремя белками (GST-MRP4-CT50 Его-S-PDZK1, и флаг-CFTRwt) в зависимости от дозы (внизу) ^18.

Таблица 1. Обзор различных CFTR содержащих высокомолекулярные комплексы собраны в пробирке.

В этом протоколе мы показали метод в пробирке сборки и обнаружения CFTR содержащие высокомолекулярные сигнализации комплексного использования очищенных белков (или фрагменты белка) и / или клеточных лизатов, как сообщалось ранее ^16-19,29,30. Для достижения наилучших результатов следующих критических точек в процессе подготовки требуют особого внимания:

• Важно, что рН элюирующего буфера быть скорректирована до 8,0 после добавления восстановленного глутатиона при очистке GST-синтез белка, как описано в шаге 1). РН может быть как 3.0 после того восстановленного глутатиона. Если рН не решен до вымывания, эффективность элюирования резко снижается.
• Когда белок вымывается из бисера, они должны быть диализу сразу, в противном случае очищенного белка может выйти из решения. Если белок диализ не представляется возможным сразу после элюирования процесс, не вымывались белки и оставить их с гоэлектронной агарозы / бус.
• Настоятельно не рекомендуется кипятить CFTR содержащих высокомолекулярные сложные образцы, приготовленные для западных промокательной как CFTR агрегации является общей проблемой. Вместо этого, образцы должны быть нагреты при 37 ° С в течение 10-15 мин до загруженной в геле.
• Для белкового комплекса с низким уровнем взаимодействия близости, иммуноблот могут быть визуализированы использованием SuperSignal Запад Femto (или Pico) основания Максимальная чувствительность (Pierce) для увеличения сигнала.

Техника показала здесь обеспечивает удобный и воспроизводимый анализ в биохимической определить CFTR содержащие третичный комплекс белка. Есть несколько способов, чтобы собрать в пробирке комплексов CFTR высокомолекулярные, как указано в таблице-1.

• Для получения убедительных результатов, надо попробовать собрать комплекс в обоих направлениях, то есть я) CFTR - PDZ леса белка (ы) - третьего белка, II), третья белка - PDZ леса белка (с) - CFTR.
• Для того, чтобы продемонстрировать PDZ мотив-зависимость высокомолекулярные сложные образования, _{CFTR-his10 (CFTR-his10} содержит 10 его остатков в С-концевой хвост, этот белок имеет внутренний мотив PDZ и не может связать NHERFs ^29), белки с их PDZ мотивы мутировал или удалены (например, β _2-АР L413A; МПУ _2-ΔSTL, и т.д.) могут быть использованы параллельно в макромолекулярных комплекс анализа, а также.
• Вместо того чтобы использовать весь лизаты клеток, которые также содержат много компонентов, можно использовать очищенные белки (в качестве третьего белка) на шаг 3.7) (например, при сборке MRP4-PDZK1-CFTR, мы также использовали очищенный Флаг-CFTR, ссылка ^18).. Это служит убедительным результатом только три-белкового комплекса, а есть только 3 очищенных белков, содержащихся во всей системе сборки.

Однако обнаружение сложных высокомолекулярных CFTR в пробирке использованием purifiред белки (или фрагменты белка) или лизатов из клеток, которые гиперэкспрессией CFTR или взаимодействующих белков не указывает ли макромолекулярных сигнализации комплекс существует в клетках, которые эндогенно экспресс этих взаимодействующих белков. Для решения этой проблемы, со-иммунопреципитации могут быть выполнены для оценки эндогенной комплексов CFTR в клетках, таких как клетки эпителия дыхательных путей ¹⁶ и кишки эпителиальные клетки ^17,18. Кроме того, масса-спектрометрического анализа и 2-мерных гель-электрофореза ²⁹ могут быть выполнены, чтобы определить неизвестные обязательными партнерами CFTR. Тем не менее, выходит за рамки этого протокола, чтобы продемонстрировать эти методы.

Кроме того, внутриклеточной локализации взаимодействующих белков в естественных условиях также может влиять на молекулярные взаимодействия. Например, MRP4 было показано, что выражается как в апикальной и базальной мембраны, в то время как CFTR локализуется в основном в апикальной мембране, хотя они и были де-monstrated взаимодействовать физически и функционально друг с другом с помощью белка PDZ леса PDZK1 ^18. Кроме того, избыточная экспрессия рекомбинантных белков, используемые в текущий протокол, может повлиять на их внутриклеточной локализации и тем самым дать взаимодействия, которые могли бы не произойти. Эти возможности также должны быть приняты во внимание при интерпретации данных и экстраполяции результатов.

Хотя в настоящее время сосредоточена протокол о порядке собрать PDZ-зависимый CFTR содержащих макромолекулярных комплексов, этот протокол также могут применяться в сборке, не CFTR участие мульти-белкового комплекса (либо PDZ-зависимой или независимой). Совсем недавно, с помощью этого анализа высокомолекулярных сборки, мы продемонстрировали, что CXCR2 хемокинов рецептор физически образует белковый комплекс с его вниз по течению эффекторных PLCβ ₂ опосредованного через NHERF1 нейтрофилов, и это CXCR2 макромолекулярных комплекса функциональныхактуальность, как нарушение комплекса (через использование экзогенных CXCR2 пептид) значительно ослабленной функции нейтрофилов ^31.

Нет конфликта интересов объявлены.

Наша работа была поддержана грантами от Американской ассоциации сердца (Большой Юго-Восточной Партнерская) Начало-грантов в помощь 0765185B, Эльза У. Парди фонда грант, и Wayne State University очной запуске фонда и научно-исследовательского института сердечно-сосудистой Isis инициативы награду. Этот метод экстракорпорального CFTR сборки сложных высокомолекулярных изначально первым доктором AP Naren (Университет Теннесси Научного центра здоровья).