Method Article
وقد أبلغ الكيسي تصرف عبر الغشاء منظم التليف (CFTR)، وقناة كلوريد الظهارية، للتفاعل مع مختلف البروتينات وتنظيم العمليات الخلوية الهامة، من بينها قد تم PDZ CFTR عزر بوساطة التفاعلات موثقة توثيقا جيدا. يصف هذا بروتوكول طرق التي قمنا بتطويرها لتجميع الجزيئات CFTR PDZ التي تعتمد على إشارات معقدة في المختبر.
الكيسي تصرف عبر الغشاء منظم التليف (CFTR)، وهي قناة كلوريد تقع في المقام الأول على الأغشية قمية من الخلايا الظهارية، يلعب دورا حاسما في توازن السوائل بطريق الظهارة 1-3. وقد تورط CFTR في اثنين من أهم الأمراض: التليف الكيسي (CF) (4) وإفرازي الإسهال 5. في قوات التحالف، ويتم تقليل توليف أو النشاط الوظيفي للقناة الكلور CFTR. هذا الاضطراب يصيب حوالي 1 في 2500 القوقازيين في الولايات المتحدة 6. كما تم الإفراط في النشاط CFTR المتورطين في حالات السموم التي يسببها الاسهال إفرازي (على سبيل المثال، بواسطة بكتيريا الكوليرا والحرارة كولاي معوي مستقر) الذي يحفز المخيم أو إنتاج المركب في القناة الهضمية 7.
تراكم الأدلة تشير إلى وجود تفاعلات المادية والوظيفية بين CFTR وعدد متزايد من البروتينات الأخرى، بما في ذلك شركات النقل، والقنوات الأيونية، والمستقبلات، كاينيسات، phosphatases، إشارةوقد تبين أن الجزيئات جي، وعناصر هيكل الخلية، وهذه التفاعلات بين CFTR وبروتينات لها ملزم للمشاركة حاسمة في تنظيم CFTR بوساطة نقل أيون بطريق الظهارة في المختبر، وأيضا في الجسم الحي 8-19. في هذا البروتوكول، ونحن نركز فقط على الطرق التي تساعد في دراسة التفاعلات بين ذيل CFTR محطة الكربوكسيل، التي تمتلك عزر بروتين ملزمة [يشار إلى PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) عزر]، و وأشار مجموعة من البروتينات سقالة، والتي تحتوي على وحدة نمطية محددة وملزمة لمثل المجالات PDZ. حتى الآن، تم الإبلاغ عن عدة بروتينات مختلفة PDZ سقالة لربط محطة الذيل الكربوكسيل من CFTR مع الانتماءات المختلفة، مثل NHERF1، NHERF2، PDZK1، PDZK2، CAL (CFTR المرتبطة يجند)، Shank2، وغراسب 20-27. وعزر PDZ ضمن CFTR معترف بها من قبل البروتينات سقالة PDZ هو آخر أربعة الأحماض الأمينية في محطة C (أي، 1477، DTRL-1480 في CFTR الإنسان) 20. ومن المثير للاهتمام،يمكن CFTR ربط أكثر من واحد PDZ نطاق كل من NHERFs وPDZK1، وإن كان ذلك بدرجات متفاوتة من الانتماءات 22. وقد تبين أن هذا multivalency فيما يتعلق ملزم CFTR أن تكون ذات أهمية وظيفية، مما يوحي بأن PDZ البروتينات سقالة قد تسهل تشكيل الجزيئات CFTR يشير مجمعات لإشارات محددة / انتقائي وفعال في الخلايا 16-18.
وقد وضعت فحوصات الكيمياء الحيوية متعددة لدراسة CFTR، التي تنطوي على تفاعلات البروتين، مثل مناعي المشترك، فحص المنسدلة، زوج من الحكمة فحص ملزم، اللونية الزوج الحكيم فحص ملزمة، وفحص الجزيئات المعقدة الجمعية 16-19،28،29 . هنا نركز على الإجراءات التفصيلية لتجميع عزر التي تعتمد على PDZ CFTR المحتوية على الجزيئات المعقدة في المختبر، والذي يستخدم على نطاق واسع من قبل مختبر لدينا لدراسة البروتين البروتين أو المجال نطاق التفاعلات التي تنطوي على CFTR 16-19،28،29.
1. التعبير وتنقية البروتينات المؤتلف المرتبطة دلاليا الانصهار في البكتيريا
2. خلية ثقافة وتحضير الخلايا المحللة
3. في الجمعية المختبر من مجمع ضخم الجزيئات CFTR التي تحتوي على (CFTR-PDZK1-MRP4)
ويرد مثال على مجمع الجزيئات CFTR التي تحتوي على إشارات التي تم تجميعها في المختبر في الشكل 1. وأشار إلى تشكيل مجمع الجزيئات بين MRP4 الأحماض 50 C-محطة الأمينية (MRP4-CT50)، PDZK1، وكامل طول CFTR (الشكل 1، أسفل). زيادة في تشكيل مجمع الجرعة بشكل تابع مع كميات متزايدة من البروتين وسيط، PDZK1 (الشكل 1، أسفل) 18.
الشكل 1. عرضا مصورا لفحص الجزيئات المعقدة (أعلى). تم الكشف عن الجزيئات المعقدة في المختبر مع ثلاثة من البروتينات (GST-MRP4-CT50، صاحب-S-PDZK1، وعلم CFTRwt-) بطريقة تعتمد على الجرعة (أسفل) 18.
CFTR-NHERF1 β-AR 2 (المرجع 14) | CFTR-NHERF2 LPA-2 (المرجع: 15) | CFTR-PDZ البروتينات-MRP 2 (المرجع: 17) | CFTR-PDZK1-MRP4 (المرجع 16) | |
تقارب الخرز | أميلوز الراتنج | S-بروتين الاغاروز | أميلوز الراتنج | الجلوتاثيون الاغاروز |
تنقية البروتين-1 | MBP β-2 AR CT | له-S-CT CFTR | MBP-CT CFTR | ضريبة السلع والخدمات، MRP4 CT |
تنقية البروتين-2 | ضريبة السلع والخدمات، NHERF1 | ضريبة السلع والخدمات، NHERF2 | ضريبة السلع والخدمات، PDZ البروتينات | له-S-PDZK1 |
تنقية البروتين-3 (أو lysates الخلية) | CFTR-بالوزن أو CFTR-his10 (BHK أو lysates خلية كلوة الجنين البشري) | علمLPA-2-بالوزن أو علم LPA-2-ΔSTL (lysates خلية BHK) | MRP2 (lysates خلية MDCK) | تنقية العلم، CFTR-بالوزن أو CFTR his10-(أو lysates الخلية) |
الجسم المضاد | المضادة للمفتش CFTR | المضادة للعلم HRP | المضادة للمفتش MRP2 | المضادة للعلم HRP |
الجدول رقم 1. ملخص لمختلف المجمعات الجزيئات CFTR التي تحتوي على تجميعها في المختبر.
في هذا البروتوكول أثبتنا وسيلة لتجميع في المختبر والكشف عن CFTR التي تحتوي على مجمع الجزيئات يشير الى استخدام البروتين النقي (أو أجزاء بروتين) و / أو lysates خلية كما ذكرت سابقا 16-19،29،30. لتحقيق أفضل النتائج في النقاط التالية الحاسمة خلال عملية الإعداد تتطلب اهتماما خاصا:
هذا الاسلوب أثبت هنا يوفر فحص مريحة وقابلة للتكرار لتحديد كيميائيا 1 CFTR المحتوية على بروتين مجمع العالي. هناك طرق متعددة لتجميع المختبر في المجمعات الجزيئات CFTR على النحو المبين في الجدول رقم 1.
ومع ذلك، كشف للمجمع الجزيئات CFTR في المختبر باستخدام purifiالبروتينات إد (أو أجزاء البروتين) أو lysates من الخلايا التي overexpress CFTR أو البروتينات المتفاعلة لا يشير إلى ما إذا كانت معقدة الجزيئات يشير الى وجود خلايا في أن التطور الطبيعي التعبير عن هذه البروتينات المتفاعلة. لمعالجة هذه المسألة، يمكن تنفيذ التعاون مناعي لتقييم المجمعات CFTR الذاتية في الخلايا مثل الخلايا الظهارية الهوائية 16 والقناة الهضمية الخلايا الظهارية 17،18. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تحليل الطيف كتلة و 2 الأبعاد الكهربائي للهلام 29 إلى تحديد الشركاء ملزم غير معروف لCFTR. ومع ذلك، فإنه يقع خارج نطاق هذا البروتوكول لإثبات هذه التقنيات.
وبالإضافة إلى ذلك، يجوز للتوطين التحت خلوية للتفاعل البروتينات في الجسم الحي تؤثر أيضا على التفاعلات الجزيئية. على سبيل المثال، فقد تبين MRP4 أن أعرب في الأغشية على حد سواء وbasolateral قمي، في حين يكون موضعيا CFTR في المقام الأول إلى غشاء قمي، على الرغم من أنها كانت ديmonstrated للتفاعل جسديا وظيفيا مع بعضها البعض عن طريق بروتين سقالة PDZ PDZK1 18. وعلاوة على ذلك، overexpression من البروتينات المؤتلف، كما هو مستخدم في بروتوكول الحالي، قد تؤثر على توطين هذه التحت خلوية وبالتالي تمكين التفاعلات التي لولاها لم يحدث. وينبغي أيضا هذه إمكانية أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير البيانات واستقراء النتائج.
على الرغم من أن بروتوكول الحالي يركز على إجراءات لتجميع PDZ التي تعتمد على المجمعات الجزيئات CFTR التي تحتوي على هذا البروتوكول أيضا التطبيقات المحتملة في تجميع غير CFTR تشارك متعددة بروتين معقد (إما PDZ التي تعتمد على أو مستقلة). في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام هذا الفحص الجمعية الجزيئات، وقد أثبتنا أن CXCR2 مستقبلات chemokine يشكل بدنيا مجمع بروتين له مع المصب المستجيب بوساطة 2 PLCβ عبر NHERF1 في العدلات، وهذه الجزيئات المعقدة CXCR2 لديه وظيفيأهمية وتعطيل مجمع (عن طريق استخدام الخارجية CXCR2 الببتيد) الموهن بشكل كبير وظائف العدلات 31.
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
وقد تم دعم عملنا من المنح المقدمة من جمعية القلب الأميركية (جنوب شرق الكبرى التابعة ل) 0765185B البداية للمنح في والمعونة، وU. باردي إلسا مؤسسة منح البحوث، وجامعة واين ستيت صندوق بدء التشغيل ضمن الجدران والقلب والأوعية الدموية بحوث مبادرة إيزيس جائزة المعهد. وكان في الأصل هذه الطريقة في المختبر من الجزيئات CFTR الجمعية المعقدة التي بدأها الدكتور AP نارين (جامعة تينيسي مركز علوم الصحة).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
pGEX4T-1 ناقلات | جنرال إلكتريك للرعاية الصحية | 28-9545-49 | سابقا أمرشام العلوم البيولوجية |
pMAL-C2 ناقلات | نيو انغلاند BioLabs | ||
pET30 ناقلات | EMD كيماويات | 69077-3 | سابقا Novagen |
الجلوتاثيون الخرز الاغاروز | العلوم البيولوجية دينار بحريني | 554780 | |
أميلوز الراتنج | نيو انغلاند BioLabs | E8021S | |
الخرز تالون | Clontech | 635501 | |
انخفاض الجلوتاثيون | العلوم البيولوجية دينار بحريني | 554782 | |
إيميدازول | الصياد | BP305-50 | |
الملتوز سكر الشعير | الصياد | BP684-500 | |
S-بروتين الاغاروز | EMD كيماويات | 69704-3 | سابقا Novagen |
المضادة للعلم HRP | سيغما | A8592 | |
المضادة للمفتش CFTR | تفصيل | R1104 | خريطة موقع الاعتراف CFTR حاتمة في AA 722-734 |
المضادة للمفتش MRP2 | Chemicon الدولية | MAB4148 | الآن جزء من ميليبور |
الجدول 2. كواشف ومعدات معينة.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved