Method Article
Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure épithéliale, a été signalé à interagir avec des protéines et de réglementer divers processus cellulaires importants, parmi lesquels les CFTR PDZ motif-médiées par les interactions ont été bien documentés. Ce protocole décrit les méthodes que nous avons développés pour assembler un macromoléculaire CFTR PDZ-dépendante complexe de signalisation In vitro.
Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure situés principalement au niveau des membranes apicales des cellules épithéliales, joue un rôle crucial dans l'homéostasie du fluide transépithélial 1-3. CFTR a été impliqué dans deux maladies majeures: la fibrose kystique (CF) 4 et la diarrhée sécrétoire 5. Dans FC, la synthèse ou l'activité fonctionnelle de la protéine CFTR Cl-canal est réduite. Ce trouble affecte environ 1 sur 2500 personnes de race blanche aux États-Unis 6. Activité de la CFTR excessive a également été impliquée dans des cas de toxine induit une diarrhée sécrétoire (par exemple, par la toxine du choléra et de la chaleur entérotoxine stable de E. coli) qui stimule la production de GMPc AMPc ou dans l'intestin 7.
Les preuves qui s'accumulent suggèrent l'existence d'interactions physiques et fonctionnelles entre CFTR et un nombre croissant d'autres protéines, y compris les transporteurs, canaux ioniques, récepteurs, les kinases, les phosphatases, de signauxmolécules ING et éléments du cytosquelette, et ces interactions entre la protéine CFTR et de ses protéines de liaison ont été montré à la critique impliquée dans la régulation de CFTR-médiée transport des ions transépithélial in vitro et également in vivo 8-19. Dans ce protocole, nous nous concentrons uniquement sur les méthodes que l'aide dans l'étude des interactions entre la queue CFTR carboxyle terminal, qui possède un motif liaison aux protéines [dénommé PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], et une un groupe de protéines échafaudage, qui contiennent un module de liaison spécifique dénommé domaines PDZ. Jusqu'à présent, plusieurs différentes protéines d'échafaudage PDZ ont été signalés à se lier à la queue carboxyle terminal de la protéine CFTR avec des affinités différentes, telles que NHERF1, les NHERF2, les PDZK1, les PDZK2, CAL (CFTR associée à un ligand), Shank2, et le GRASP 20-27. Le motif PDZ dans CFTR qui est reconnu par PDZ protéines d'échafaudage est les quatre derniers acides aminés à l'extrémité C-terminale (c.-à-1477-DTRL-1480 chez l'homme CFTR) 20. Il est intéressant,CFTR peut se lier plus d'un domaine PDZ des deux NHERFs et PDZK1, quoique avec plus ou moins d'affinités 22. Cette polyvalence à l'égard de la protéine CFTR contraignant a été démontré que de l'importance fonctionnelle, ce qui suggère que PDZ protéines d'échafaudage peuvent faciliter la formation de complexes de signalisation macromoléculaire CFTR pour la signalisation spécifiques / sélective et efficace dans les cellules 16-18.
Multiples dosages biochimiques ont été développées pour étudier la protéine CFTR-impliquant les interactions entre protéines, telles que la co-immunoprécipitation, pull-down assay, par paire test de liaison, colorimétrique paires test de liaison, et le dosage assemblage macromoléculaire complexe 16-19,28,29 . Nous nous concentrons ici sur les procédures détaillées d'assemblage d'une PDZ motif-dépendante CFTR contenant macromoléculaire complexe in vitro, qui est largement utilisé par notre laboratoire pour étudier protéine-protéine ou un domaine à domaine interactions impliquant la protéine CFTR 16-19,28,29.
1. Expression et purification de protéines recombinantes de fusion associés à des bactéries
2. Culture cellulaire et préparation lysat cellulaire
3. Assemblage in vitro d'un complexe macromoléculaire CFTR contenant (CFTR-PDZK1-MRP4)
Un exemple de complexe macromoléculaire contenant du CFTR de signalisation qui a été assemblé in vitro est représenté sur la figure 1. Un complexe macromoléculaire a été formé entre MRP4 C-terminales de 50 acides aminés (MRP4-CT50), les PDZK1 et pleine longueur du gène CFTR (figure 1, en bas). La formation d'un complexe augmentation de la dose-dépendante avec des quantités croissantes de la protéine intermédiaire, PDZK1 (Figure 1, en bas) 18.
Figure 1. La représentation graphique de l'analyse complexe macromoléculaire (en haut). Un complexe macromoléculaire a été détectée in vitro avec trois protéines (TPS-MRP4-CT50, Son-S-PDZK1, et Flag-CFTRwt) d'une manière dose-dépendante (en bas) 18.
CFTR-NHERF1-β 2 AR (réf. 14) | CFTR-NHERF2-APL 2 (réf. 15) | CFTR-PDZ protéines-MRP 2 (réf. 17) | CFTR-PDZK1-MRP4 (réf. 16) | |
Perles d'affinité | Résine d'amylose | S-protéine d'agarose | Résine d'amylose | Le glutathion agarose |
Protéine purifiée-1 | MBP-β 2 AR CT | Son-S-CFTR CT | MBP-CFTR CT | TPS-MRP4 CT |
Protéine purifiée-2 | TPS-NHERF1 | TPS-NHERF2 | TPS-PDZ protéines | Son-S-PDZK1 |
Protéine purifiée-3 (ou lysats cellulaires) | CFTR-poids ou CFTR-his10 (BHK ou lysats cellulaires HEK) | DrapeauLPA-2-poids ou Drapeau-APL 2-ΔSTL (lysats cellulaires BHK) | MRP2 (lysats de cellules MDCK) | Purifiée Drapeau-CFTR-poids ou CFTR-his10 (ou lysats cellulaires) |
Anticorps | Anti-IgG CFTR | Anti-Flag HRP | Anti-IgG MRP2 | Anti-Flag HRP |
Tableau 1. Résumé des différents complexes macromoléculaires CFTR contenant assemblés in vitro.
Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode in vitro le montage et la détection d'une protéine CFTR contenant un complexe macromoléculaire de signalisation utilisant des protéines purifiées (ou fragments de protéines) et / ou de lysats cellulaires comme indiqué précédemment 16-19,29,30. Pour obtenir les meilleurs résultats sur les points suivants critiques au cours du processus de préparation nécessitent une attention particulière:
La technique décrite ici fournit un test pratique et reproductible pour définir biochimiquement un complexe protéine CFTR contenant tertiaire de la protéine. Il ya plusieurs façons de se réunir dans les complexes in vitro de la protéine CFTR macromoléculaires comme indiqué dans le tableau 1.
Cependant, la détection du complexe macromoléculaire CFTR in vitro en utilisant purificationprotéines ED (ou fragments de protéines) ou de lysats de cellules qui surexpriment la protéine CFTR ou les protéines qui interagissent n'indique pas si le complexe macromoléculaire de signalisation existe dans les cellules que de façon endogène expriment ces protéines en interaction. Pour résoudre ce problème, co-immunoprécipitation peut être effectuée pour évaluer les complexes CFTR dans les cellules endogènes telles que les cellules épithéliales des voies aériennes et 16 cellules épithéliales d'intestin 17,18. En outre, l'analyse par spectrométrie de masse et l'électrophorèse sur gel à 2 dimensions 29 peut être effectuée pour identifier les inconnus partenaires de liaison pour la protéine CFTR. Cependant, il est au-delà du champ d'application de ce protocole afin de démontrer ces techniques.
En outre, la localisation subcellulaire des protéines qui interagissent in vivo peut également affecter les interactions moléculaires. Par exemple, MRP4 a été montré pour être exprimé dans les membranes à la fois apical et basolatéral, alors que la protéine CFTR est localisé principalement à la membrane apicale, si elles ont été demonstrated d'interagir physiquement et fonctionnellement avec l'autre par la protéine PDZ échafaudage PDZK1 18. En outre, la surexpression des protéines recombinantes, tel qu'il est utilisé dans le protocole actuel, pourrait influer sur leur localisation subcellulaire et donc permettre des interactions qui autrement n'auraient pas lieu. Ces possibilité devrait également être pris en considération lorsqu'on interprète les données et en extrapolant les résultats.
Bien que le protocole actuel se concentre sur la procédure à assembler PDZ-dépendants complexes macromoléculaires CFTR contenant, ce protocole a également des applications potentielles dans le montage non-CFTR impliquée multi-protéique complexe (soit PDZ-dépendant ou indépendant). Plus récemment, en utilisant ce test assemblage macromoléculaire, nous avons démontré qu'un récepteur de chimiokine CXCR2 forme physiquement un complexe protéique avec son aval 2 PLCβ effecteur médiation par l'intermédiaire NHERF1 dans les neutrophiles, et ce complexe macromoléculaire a CXCR2 fonctionnellela pertinence de perturber le complexe (par l'intermédiaire en utilisant un peptide exogène CXCR2) sensiblement atténués fonctions des neutrophiles 31.
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Notre travail a été soutenu par des subventions de l'American Heart Association (Grand Sud-affiliation) Début-grant-in-aid 0765185B, l'Elsa U. Pardee Fondation une subvention de recherche, et la Wayne State University intra-muros de fonds de démarrage et de recherche cardiovasculaire de l'Institut d'attribution Initiative Isis. Cette méthode in vitro CFTR assemblage complexe macromoléculaire a été initialement mis au point par le Dr AP Naren (Université du Tennessee Health Science Center).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nom du réactif | Entreprise | Le numéro de catalogue | Commentaires |
pGEX4T-1 vecteur | GE Healthcare | 28-9545-49 | anciennement Amersham Biosciences |
pMAL-C2 vecteur | New England Biolabs | ||
pET30 vecteur | EMD Chemicals | 69077-3 | anciennement Novagen |
Glutathion billes d'agarose | BD Biosciences | 554780 | |
Résine d'amylose | New England Biolabs | E8021S | |
Perles Talon | Clontech | 635501 | |
glutathion réduit | BD Biosciences | 554782 | |
imidazole | Pêcheur | BP305-50 | |
maltose | Pêcheur | BP684-500 | |
S-protéine d'agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | anciennement Novagen |
Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
Anti-IgG CFTR | Fait sur mesure | R1104 | mAb reconnaissant CFTR épitope à aa 722-734 |
Anti-IgG MRP2 | Chemicon International | MAB4148 | Maintenant une partie de Millipore |
Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques.
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon