L'analyse in vitro de PDZ-dépendants complexes macromoléculaires CFTR de signalisation

Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure épithéliale, a été signalé à interagir avec des protéines et de réglementer divers processus cellulaires importants, parmi lesquels les CFTR PDZ motif-médiées par les interactions ont été bien documentés. Ce protocole décrit les méthodes que nous avons développés pour assembler un macromoléculaire CFTR PDZ-dépendante complexe de signalisation In vitro.

Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure situés principalement au niveau des membranes apicales des cellules épithéliales, joue un rôle crucial dans l'homéostasie du fluide transépithélial ^1-3. CFTR a été impliqué dans deux maladies majeures: la fibrose kystique (CF) ⁴ et la diarrhée sécrétoire ^5. Dans FC, la synthèse ou l'activité fonctionnelle de la protéine CFTR Cl-canal est réduite. Ce trouble affecte environ 1 sur 2500 personnes de race blanche aux États-Unis ^6. Activité de la CFTR excessive a également été impliquée dans des cas de toxine induit une diarrhée sécrétoire (par exemple, par la toxine du choléra et de la chaleur entérotoxine stable de E. coli) qui stimule la production de GMPc AMPc ou dans l'intestin ^7.

Les preuves qui s'accumulent suggèrent l'existence d'interactions physiques et fonctionnelles entre CFTR et un nombre croissant d'autres protéines, y compris les transporteurs, canaux ioniques, récepteurs, les kinases, les phosphatases, de signauxmolécules ING et éléments du cytosquelette, et ces interactions entre la protéine CFTR et de ses protéines de liaison ont été montré à la critique impliquée dans la régulation de CFTR-médiée transport des ions transépithélial in vitro et également in vivo ^8-19. Dans ce protocole, nous nous concentrons uniquement sur les méthodes que l'aide dans l'étude des interactions entre la queue CFTR carboxyle terminal, qui possède un motif liaison aux protéines [dénommé PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], et une un groupe de protéines échafaudage, qui contiennent un module de liaison spécifique dénommé domaines PDZ. Jusqu'à présent, plusieurs différentes protéines d'échafaudage PDZ ont été signalés à se lier à la queue carboxyle terminal de la protéine CFTR avec des affinités différentes, telles que NHERF1, les NHERF2, les PDZK1, les PDZK2, CAL (CFTR associée à un ligand), Shank2, et le GRASP ^20-27. Le motif PDZ dans CFTR qui est reconnu par PDZ protéines d'échafaudage est les quatre derniers acides aminés à l'extrémité C-terminale (c.-à-1477-DTRL-1480 chez l'homme CFTR) ^20. Il est intéressant,CFTR peut se lier plus d'un domaine PDZ des deux NHERFs et PDZK1, quoique avec plus ou moins d'affinités ^22. Cette polyvalence à l'égard de la protéine CFTR contraignant a été démontré que de l'importance fonctionnelle, ce qui suggère que PDZ protéines d'échafaudage peuvent faciliter la formation de complexes de signalisation macromoléculaire CFTR pour la signalisation spécifiques / sélective et efficace dans les cellules ^16-18.

Multiples dosages biochimiques ont été développées pour étudier la protéine CFTR-impliquant les interactions entre protéines, telles que la co-immunoprécipitation, pull-down assay, par paire test de liaison, colorimétrique paires test de liaison, et le dosage assemblage macromoléculaire complexe ^16-19,28,29 . Nous nous concentrons ici sur les procédures détaillées d'assemblage d'une PDZ motif-dépendante CFTR contenant macromoléculaire complexe in vitro, qui est largement utilisé par notre laboratoire pour étudier protéine-protéine ou un domaine à domaine interactions impliquant la protéine CFTR ^16-19,28,29.

1. Expression et purification de protéines recombinantes de fusion associés à des bactéries

1. Amplification des régions définies du C-queue (les 50-100 derniers acides aminés contenant des motifs PDZ à extrémité C-terminale) pour CFTR, APL _2, MRP2, MRP4, β ₂ AR, et NHERFs (pleine longueur ou PDZ1 ou PDZ2 domaines ) par l'approche de PCR.
2. Cloner les produits de PCR en pGEX4T-1 vecteur de la TPS-protéines de fusion (comme la TPS-NHERFs, TPS-MRP4 CT), pMAL-C2 vecteur de protéines de fusion MBP (comme MBP-β ₂ AR CT, MBP-CFTR CT ), et pour ses pET30-S-protéines de fusion (tel que son-S-CFTR CT, Son-S-PDZK1).
3. Transformer dans un E. déficiente en protéase souche de E. coli (BL21-DE3) pour minimiser la dégradation possible de protéines recombinantes.
4. Cultiver la culture pendant une nuit à 37 ° C dans du milieu Luria-Bertani (pH 7,0) contenant des antibiotiques appropriés (tels que l'ampicilline ou la kanamycine). Diluer la culture de nuit à 1:10 et se développer pendant encore 2 h à 37 ° C. Dansduire avec 0,5-1 m M IPTG pour le prochain 4 h à 30 ° C. Pellet les cellules par centrifugation à 8000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
5. Lyse des cellules dans le tampon de saccharose (50 m M Tris-HCl, pH 8,0, 1 m M EDTA, 1 m M PMSF, et 10% de saccharose) contenant du lysozyme (1 mg / ml), 0,2% de Triton X-100, et de la protéase inhibiteurs. Utilisez 20 ml pour culot cellulaire provenant de 1 L de la culture.
6. Mélanger sur un agitateur rotatif pendant 30 min à 4 ° C.
7. Centrifuger à 20000 g pendant 30 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant clair.
8. Dans le surnageant clair, ajouter 1 ml de résine les suivantes / agarose perles (coulis 50% dans le tampon de saccharose):
   • Glutathion billes d'agarose pour les protéines de fusion GST.
   • Talon perles pour Ses-S protéines de fusion.
   • Résine d'amylose pour les protéines de fusion MBP.
9. Mix pendant 4 h à 4 ° C sur un agitateur rotatif.
10. Laver les billes en remettant en suspension dans du PBS 1X (15 ml), mélanger pendant 2 min, tournant à 800 × g pendant 2 min, et élimination du surnageant. Répétez cette étape pour six fois.
11. Eluer la protéine à partir des billes en utilisant un tampon d'élution respectifs (2 ml de tampon d'élution pour 1 ml de billes).
    • Tampon d'élution des protéines de fusion GST: 25 m M Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M de NaCl, et 20 m M glutathion réduit.
    • Tampon d'élution pour ses protéines de fusion: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), à 500 m M de NaCl, et à 200 m M d'imidazole.
    • Un tampon d'élution pour des protéines de fusion MBP: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M de NaCl, 1 m M d'EDTA, de 1 m M DTT, et 10 m M maltose.
12. Dialyser les protéines éluées contre 2 L de PBS 1x à 4 ° C (pour éviter la dégradation des protéines du possible). Changer PBS toutes les 4 h, quatre fois. Concentrer la protéine à l'aide d'un filtre Centricon (10.000 MW de coupure, Millipore) et le magasin en tant que de petites aliquotes à -80 ° C.
13. Dethermine de la concentration en protéines par la méthode de Bradford. Évaluer la qualité des protéines par SDS-PAGE en utilisant la BSA comme normes. Si l'intégrité de la protéine n'est pas satisfaisante, les procédures de purification secondaires telles que la filtration sur gel ou d'échange d'ions peut être utilisé. (Par exemple, nous avons utilisé une colonne G-75 Sepharose pour purifier davantage la TPS-protéine de fusion).

2. Culture cellulaire et préparation lysat cellulaire

1. Culture rein de bébé hamster (BHK) que de manière stable sur-expriment la protéine CFTR-poids et _CFTR-his10 ou des cellules BHK que transitoirement sur-expriment le drapeau-APL _2-poids ou Drapeau-APL _2-ΔSTL, et Madin-Darby Canine Kidney (MDCK cellules) que de manière stable sur-express MRP2 à Eagle du milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10% sérum de veau foetal et de la pénicilline / streptomycine dans des flacons en polystyrène à 37 ° C avec 5% de CO _2.
2. Culture embryonnaires humaines de rein 293 (HEK293) des cellules qui expriment de manière stable sur-CFTR-poids et _CFTR-his10 dans Dulbecco«Moyen s de Eagle modifié (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin et de la pénicilline / streptomycine dans des flacons en polystyrène à 37 ° C avec 5% de CO _2.
3. Lyse des cellules dans le tampon de lyse (PBS - 0,2% de Triton-X-100 complété par un mélange d'inhibiteurs de la protéase contenant 1 m M phénylméthylsulfonyle fluorure, 1 ug / ml d'aprotinine, 1 ug / ml de leupeptine, 1 ug / ml de pepstatine); utilisation 500 ul de tampon de lyse pour chaque plat de 60 mm de Petri, et 1000 ul de tampon de lyse pour chaque plat de 100 mm de Petri.
4. Rock the lysats cellulaires pendant 20 min à 4 ° C, et de supprimer l'insoluble par centrifugation à 16.000 g pendant 15 min à 4 ° C. Déterminer la concentration en protéines par la méthode de Bradford.

3. Assemblage in vitro d'un complexe macromoléculaire CFTR contenant (CFTR-PDZK1-MRP4)

1. Dans 200 ul de tampon de lyse (PBS - 0,2% de Triton X-100 + inhibiteurs de la protéase), ajouter 20 pg purifiée GST-MRP4-C-terminal50 bis (CT50) protéine de fusion.
2. Additionner les montants différents (0-40 mg) de purifier Son-S-PDZK1 protéine de fusion.
3. Mélanger les deux protéines sur un mélangeur rotatif à 22 ° C pendant 1-2 h.
4. Ajouter 20 billes de glutathion pi (50% suspension) dans le mélange de protéines, et continuer à mélanger pour un autre h 1. Cette étape est aussi appelée par paire de liaison.
5. Pendant ce temps, préparer les lysats cellulaires HEK293 qui surexpriment la protéine CFTR-Drapeau (en poids) tel que décrit ci-dessus à l'étape 2).
6. Laver le complexe à deux reprises avec un tampon de lyse. Centrifuger à 800 xg pendant 1 min pour chaque lavage et aspirer délicatement le surnageant après chaque lavage. Faites preuve de prudence pour ne pas sucer les billes dans le fond.
7. Ajouter les HEK293 préparés ci-dessus lysats cellulaires aux billes, et mélanger délicatement à 4 ° C pendant 3 h (ou toute la nuit).
8. Laver les billes extensive trois fois avec un tampon de lyse telles que décrites à l'étape 3.6).
9. Éluer les protéines en utilisant 30 uL tampon d'échantillon (5 ×): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), glycérol 50%, 2% de SDS, et 0,1% de bleu de bromophénol, contenant 5% β-mercaptoéthanol.
10. Incuber à 37 ° C bain-marie pendant 10-15 min, et de spin à 5000 × g pendant 30 s pour précipiter les perles.
11. Chargez tous l'éluat sur un gel de 4-15%.
12. Exécuter SDS-PAGE pour environ 30-40 min.
13. Transfert des bandes de protéines à la membrane PVDF, pendant 1,5 heures.
14. Bloquer la membrane dans du TBS-Tween contenant 5% de matière grasse du lait non.
15. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire (comme les anti-IgG CFTR, R1104) à 4 ° C, pendant la nuit.
16. Laver la membrane avec du TBS-Tween pendant 5 min, à six reprises.
17. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire (par exemple la chèvre anti-souris conjugué à HRP 2 anticorps ^e) pendant 45 min à 22 ° C.
18. Laver la membrane avec du TBS-Tween pendant 5 min, à six reprises.
19. Visualisez les bandes de protéines par ECL.
20. Les données représentatives sont présentés dans la figure 1.

Un exemple de complexe macromoléculaire contenant du CFTR de signalisation qui a été assemblé in vitro est représenté sur la figure 1. Un complexe macromoléculaire a été formé entre MRP4 C-terminales de 50 acides aminés (MRP4-CT50), les PDZK1 et pleine longueur du gène CFTR (figure 1, en ​​bas). La formation d'un complexe augmentation de la dose-dépendante avec des quantités croissantes de la protéine intermédiaire, PDZK1 (Figure 1, en ​​bas) ^18.

Figure 1. La représentation graphique de l'analyse complexe macromoléculaire (en haut). Un complexe macromoléculaire a été détectée in vitro avec trois protéines (TPS-MRP4-CT50, Son-S-PDZK1, et Flag-CFTRwt) d'une manière dose-dépendante (en bas) ^18.

Tableau 1. Résumé des différents complexes macromoléculaires CFTR contenant assemblés in vitro.

Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode in vitro le montage et la détection d'une protéine CFTR contenant un complexe macromoléculaire de signalisation utilisant des protéines purifiées (ou fragments de protéines) et / ou de lysats cellulaires comme indiqué précédemment ^16-19,29,30. Pour obtenir les meilleurs résultats sur les points suivants critiques au cours du processus de préparation nécessitent une attention particulière:

• Il est important que le pH du tampon d'élution être ajusté à 8,0 après l'ajout du glutathion réduit lors de la purification de la protéine de fusion GST comme décrit dans l'étape 1). Le pH peut être aussi faible que 3,0 après l'addition de glutathion réduit. Si le pH n'est pas ajusté avant l'élution, l'efficacité de l'élution est considérablement réduite.
• Lorsque la protéine est éluée à partir des perles, ils ont besoin pour être dialysée tout de suite, sinon, la protéine purifiée peut sortir de la solution. Si la dialyse des protéines n'est pas possible tout de suite après le processus d'élution, ne éluer la protéine et les laisser avec ee agarose / billes.
• Il est fortement recommandé de ne pas faire bouillir les échantillons macromoléculaires CFTR contenant complexes préparés pour Western blot que la protéine CFTR agrégation est un problème commun. Au lieu de cela, les échantillons doivent être chauffés à 37 ° C pendant 10-15 min avant de charger dans le gel.
• Pour le complexe protéine d'interaction avec une faible affinité, l'immuno-empreinte peut être visualisée à l'aide de l'Ouest SuperSignal Femto (ou Pico) Substrat sensibilité maximale (Pierce) pour augmenter le signal.

La technique décrite ici fournit un test pratique et reproductible pour définir biochimiquement un complexe protéine CFTR contenant tertiaire de la protéine. Il ya plusieurs façons de se réunir dans les complexes in vitro de la protéine CFTR macromoléculaires comme indiqué dans le tableau 1.

• Afin d'obtenir des résultats probants, il faut essayer d'assembler le complexe dans les deux sens, à savoir i) la protéine CFTR - PDZ protéine d'échafaudage (s) - la troisième protéine; ii) la troisième protéine - protéine d'échafaudage PDZ (s) - CFTR.
• Afin de démontrer l'PDZ motif-dépendance de la formation macromoléculaire complexe, _{CFTR-his10 (CFTR-his10} contient 10 résidus His dans la queue C-terminale; cette protéine a un motif interne PDZ et ne peut pas lier NHERFs ^29), protéines avec leur des motifs PDZ muté ou supprimé (tels que β ₂ AR-L413A; APL _2-ΔSTL; etc) peut être utilisé en parallèle dans le dosage macromoléculaire complexe ainsi.
• Au lieu d'utiliser les lysats de cellules entières qui contiennent aussi de nombreux autres composants, on peut utiliser des protéines purifiées (comme la troisième protéine) à l'étape 3.7) (tels que dans l'assemblage de MRP4-PDZK1-CFTR, nous avons également utilisé l'purifié Drapeau-CFTR; ref ^18).. Cette offre fait convaincante d'un complexe tri-exclusivement de protéines, car il ya seulement 3 protéines purifiées contenues dans le système de montage ensemble.

Cependant, la détection du complexe macromoléculaire CFTR in vitro en utilisant purificationprotéines ED (ou fragments de protéines) ou de lysats de cellules qui surexpriment la protéine CFTR ou les protéines qui interagissent n'indique pas si le complexe macromoléculaire de signalisation existe dans les cellules que de façon endogène expriment ces protéines en interaction. Pour résoudre ce problème, co-immunoprécipitation peut être effectuée pour évaluer les complexes CFTR dans les cellules endogènes telles que les cellules épithéliales des voies aériennes et ¹⁶ cellules épithéliales d'intestin ^17,18. En outre, l'analyse par spectrométrie de masse et l'électrophorèse sur gel à 2 dimensions ²⁹ peut être effectuée pour identifier les inconnus partenaires de liaison pour la protéine CFTR. Cependant, il est au-delà du champ d'application de ce protocole afin de démontrer ces techniques.

En outre, la localisation subcellulaire des protéines qui interagissent in vivo peut également affecter les interactions moléculaires. Par exemple, MRP4 a été montré pour être exprimé dans les membranes à la fois apical et basolatéral, alors que la protéine CFTR est localisé principalement à la membrane apicale, si elles ont été demonstrated d'interagir physiquement et fonctionnellement avec l'autre par la protéine PDZ échafaudage PDZK1 ^18. En outre, la surexpression des protéines recombinantes, tel qu'il est utilisé dans le protocole actuel, pourrait influer sur leur localisation subcellulaire et donc permettre des interactions qui autrement n'auraient pas lieu. Ces possibilité devrait également être pris en considération lorsqu'on interprète les données et en extrapolant les résultats.

Bien que le protocole actuel se concentre sur la procédure à assembler PDZ-dépendants complexes macromoléculaires CFTR contenant, ce protocole a également des applications potentielles dans le montage non-CFTR impliquée multi-protéique complexe (soit PDZ-dépendant ou indépendant). Plus récemment, en utilisant ce test assemblage macromoléculaire, nous avons démontré qu'un récepteur de chimiokine CXCR2 forme physiquement un complexe protéique avec son aval ₂ PLCβ effecteur médiation par l'intermédiaire NHERF1 dans les neutrophiles, et ce complexe macromoléculaire a CXCR2 fonctionnellela pertinence de perturber le complexe (par l'intermédiaire en utilisant un peptide exogène CXCR2) sensiblement atténués fonctions des neutrophiles ^31.

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Notre travail a été soutenu par des subventions de l'American Heart Association (Grand Sud-affiliation) Début-grant-in-aid 0765185B, l'Elsa U. Pardee Fondation une subvention de recherche, et la Wayne State University intra-muros de fonds de démarrage et de recherche cardiovasculaire de l'Institut d'attribution Initiative Isis. Cette méthode in vitro CFTR assemblage complexe macromoléculaire a été initialement mis au point par le Dr AP Naren (Université du Tennessee Health Science Center).