Análisis in vitro de PDZ-dependientes de complejos macromoleculares de señalización CFTR

Transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), un canal de cloro del epitelio, se ha informado de interactuar con varias proteínas y regular procesos celulares importantes, entre ellos los CFTR PDZ mediadas por motivo de las interacciones han sido bien documentados. Este protocolo describe los métodos que hemos desarrollado para montar un macromolecular CFTR PDZ-dependiente de señalización complejos In vitro.

Transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), un canal de cloruro encuentra principalmente en la membrana apical de las células epiteliales, juega un papel fundamental en la homeostasis de los fluidos ^1-3 transepitelial. CFTR se ha implicado en dos enfermedades importantes: la fibrosis quística (FQ) ⁴ y la diarrea secretora ^5. En CF, la síntesis o la actividad funcional de la CFTR Cl-canal se reduce. Este trastorno afecta a aproximadamente 1 de cada 2,500 caucásicos en los Estados Unidos ^6. La actividad del CFTR excesiva también ha sido implicado en casos de toxina inducida diarrea secretora (por ejemplo, por la toxina del cólera y estable al calor enterotoxina de E. coli) que estimula la producción de AMPc o GMPc en el intestino ^7.

La acumulación de pruebas sugieren la existencia de interacciones físicas y funcionales entre CFTR y un número creciente de otras proteínas, incluyendo transportadores, canales iónicos, receptores, quinasas, fosfatasas, la señalIng. moléculas, y los elementos del citoesqueleto, y estas interacciones entre CFTR y sus proteínas de unión se ha demostrado que ser críticamente involucrada en la regulación mediada por CFTR transporte iónico transepitelial in vitro y también in vivo ^8-19. En este protocolo, nos centraremos únicamente en los métodos que ayudan en el estudio de las interacciones entre la cola CFTR carboxilo terminal, que posee un motivo de unión a proteínas [conocido como PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], y un grupo de proteínas de andamiaje, que contienen un módulo de unión específica a que se refiere a dominios PDZ. Hasta ahora, varios diferentes PDZ proteínas de andamiaje se ha informado que se unen a la cola carboxilo terminal de CFTR con afinidades diferentes, tales como, las NHERF1 NHERF2, los PDZK1, los PDZK2, Cal (CFTR asociada a ligando), Shank2, y GRASP ^20-27. El motivo PDZ en CFTR que es reconocido por PDZ proteínas de andamiaje son los últimos cuatro aminoácidos en el terminal C (es decir, 1477-DTRL-1480 en el ser humano CFTR) ^20. Curiosamente,CFTR puede obligar a más de un dominio PDZ de ambos NHERFs y PDZK1, aunque con distintas afinidades ^22. Esta multivalencia con respecto a CFTR unión ha demostrado ser de importancia funcional, lo que sugiere que las proteínas PDZ andamio puede facilitar la formación de complejos macromoleculares CFTR señalización para la señalización específicos / selectiva y eficiente en las células ^16-18.

Múltiples ensayos bioquímicos se han desarrollado para estudiar CFTR que implica interacciones de proteínas, como la co-inmunoprecipitación, ensayo de pull-down, por pares ensayo de unión, colorimétrico pares ensayo de unión, y el ensayo de ensamblaje complejo macromolecular ^16-19,28,29 . Aquí nos centramos en las particularidades del procedimiento de montaje de un PDZ motivo dependiente de CFTR que contiene complejo macromolecular in vitro, que se utiliza ampliamente en nuestro laboratorio para estudiar proteína-proteína o de dominio de dominio-interacciones que implican CFTR ^16-19,28,29.

1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes de fusión con la etiqueta en las bacterias

1. Amplificar las regiones definidas de la C-colas (en los últimos 50-100 aminoácidos que contienen los motivos PDZ en C-terminal) de CFTR, LPA _2, MRP2, MRP4, β ₂ AR, y NHERFs (de larga duración o dominios PDZ1 o PDZ2 ) por el método PCR.
2. Clonar los productos de PCR en pGEX4T-1 vector de fusión GST-proteínas (como GST-NHERFs, GST-MRP4 TC), pMAL-C2 vector de las proteínas de fusión MBP-(como MBP-β ₂ AR CT, PAM-CFTR CT ), y pET30 para His-S-proteínas de fusión (tales como Su-S-CT CFTR, Su-S-PDZK1).
3. Transformación en una E. proteasa deficiente coli cepa (BL21-DE3) para minimizar la posible degradación de proteínas recombinantes.
4. Mantener el cultivo durante la noche a 37 ° C en medio Luria-Bertani (pH 7,0) que contenía los antibióticos adecuados (por ejemplo, ampicilina o kanamicina). Diluir el cultivo durante la noche a 1:10 y crecer durante otras 2 horas a 37 ° C. Enducir con 0,5-1 m M IPTG durante los próximos 4 horas a 30 ° C. Precipitar las células por centrifugación a 8.000 × g durante 10 min a 4 ° C.
5. Lisar las células en tampón de sacarosa (50 m M de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, y 10% de sacarosa) que contenía lisozima (1 mg / ml), 0,2% de Triton X-100, y la proteasa inhibidores. Utilizar 20 ml de sedimento de células procedentes de 1 litro de cultivo.
6. Mezclar en un agitador rotatorio durante 30 min a 4 ° C.
7. Girar a 20.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante claro.
8. En el sobrenadante claro, añadir 1 ml de los siguientes resina / agarosa bolas (50% suspensión en tampón de sacarosa):
   • Glutatión agarosa para las proteínas de fusión GST.
   • Talon cuentas de Sus-S proteínas de fusión.
   • La amilosa resina para las proteínas de fusión MBP.
9. Mezclar durante 4 horas a 4 ° C en un agitador rotatorio.
10. Lavar las perlas por resuspensión en PBS 1x (15 ml), mezclando durante 2 millasn, girando a 800 xg durante 2 min, y desechar el sobrenadante. Repita este paso para seis veces.
11. Eluir la proteína de las perlas usando tampón de elución respectivo (2 tampón de elución ml por 1 ml de perlas).
    • Tampón de elución de proteínas de fusión GST: 25 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M de NaCl, y 20 m M glutatión reducido.
    • La elución de las proteínas tampón Sus fusión: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M de NaCl, y 200 m M imidazol.
    • La elución tampón para proteínas de fusión MBP: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M de NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT y 10 m M de maltosa.
12. Dializar las proteínas eluidas contra 2 l de 1x PBS a 4 ° C (para evitar la degradación de proteínas es posible). Cambio de PBS cada 4 h durante cuatro veces. Concentrar la proteína utilizando un filtro Centricon (10.000 MW de corte, Millipore) y almacena como pequeñas alícuotas a -80 ° C.
13. Detarmiño la concentración de proteínas por el método de Bradford. Evaluación de la calidad de proteínas por SDS-PAGE utilizando BSA como estándares. Si la integridad de la proteína no es satisfactoria, los procedimientos secundarios de purificación tales como filtración en gel o intercambio iónico puede ser utilizado. (Por ejemplo, hemos utilizado una columna G-75 para purificar más Sepharosa fusión GST-proteína).

2. Cultivo de células y preparación de lisado celular

1. Cultura de riñón de cría de hámster (BHK), células que sobre-expresan de forma estable CFTR-CFTR en peso y _His10-o células BHK que transitoriamente sobre-expresan la _{bandera-LPA-2} en peso o la bandera de la _LPA-2-ΔSTL, y de Madin-Darby de riñón canino (MDCK ) células que sobreexpresan establemente MRP2 en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) que contienen 10% de suero fetal de ternero y penicilina / estreptomicina en matraces de poliestireno a 37 ° C con 5% de CO _2.
2. Cultura riñón embrionario humano 293 (HEK293) células que sobre-expresan de forma estable CFTR en peso y el CFTR _His10 en Dulbecco'S medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con fetal al 10% de suero bovino y penicilina / estreptomicina en matraces de poliestireno a 37 ° C con 5% de CO _2.
3. Lisar las células en tampón de lisis (PBS - 0,2% de Triton-X-100 suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas que contienen 1 m M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mg / ml de aprotinina, 1 mg / ml de leupeptina, 1 mg / ml de pepstatina); uso 500 l de tampón de lisis para cada plato 60-mm de Petri, y 1000 l de tampón de lisis para cada plato de Petri de 100 mm.
4. Rock the lisados ​​celulares durante 20 min a 4 ° C, y eliminar el material insoluble por centrifugación a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Determinar la concentración de proteína por el ensayo de Bradford.

3. En la Asamblea in vitro de un complejo macromolecular que contiene CFTR (CFTR PDZK1-MRP4)

1. En 200 l de buffer de lisis (PBS - 0,2% de Triton X-100 + inhibidores de la proteasa), añadir 20 g purificado GST-MRP4-C-terminal50 bis (CT50) proteína de fusión.
2. Añadir varias cantidades (0-40 g) de su purificada-S-PDZK1 proteína de fusión.
3. Mezclar las dos proteínas en un mezclador rotatorio a 22 ° C durante 1-2 h.
4. Añadir 20 perlas de glutatión l (50% suspensión) en la mezcla de proteínas, y continuar mezclando durante otras 1. Este paso se conoce también como pares de enlace.
5. Durante este tiempo, preparar las HEK293 lisados ​​de células que sobreexpresan Bandera-CFTR (en peso) como se describió anteriormente en el Paso 2).
6. Lavar el complejo dos veces con tampón de lisis. Gira a 800 xg durante 1 minuto por cada lavado y cuidado aspirar el sobrenadante después de cada lavado. Tenga cuidado de no chupar las bolas en la parte inferior.
7. Añadir los anteriormente preparadas HEK293 lisados ​​celulares a las perlas, y mezcle suavemente a 4 ° C durante 3 horas (o durante la noche).
8. Lavar las perlas extensamente tres veces con tampón de lisis tal como se describe en el Paso 3,6).
9. Eluir las proteínas con 30 muestras de búfer l (5 x): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), 50% de glicerol, 2% de SDS, y 0,1% de azul de bromofenol; que contiene 5% β-mercaptoetanol.
10. Incubar en baño de agua 37 ° C durante 10-15 minutos, y giran a 5.000 rpm durante 30 s para precipitar las cuentas.
11. Cargar todo el eluato en 4-15% de gel.
12. Ejecutar SDS-PAGE durante aproximadamente 30-40 min.
13. Transferir bandas de proteína a la membrana de PVDF, durante 1,5 horas.
14. Bloque de la membrana en TBS-Tween que contenía 5% de leche sin grasa.
15. Incubar la membrana con el anticuerpo primario (tales como anti-IgG de CFTR, R1104) a 4 ° C, durante la noche.
16. Lavar la membrana con TBS-Tween durante 5 minutos, seis veces.
17. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (como cabra anti-ratón conjugado HRP-anticuerpo ^nd 2) durante 45 min a 22 ° C.
18. Lavar la membrana con TBS-Tween durante 5 minutos, seis veces.
19. Visualizar las bandas de proteínas a través de ECL.
20. Los datos representativos se muestran en la Figura 1.

Un ejemplo de complejo macromolecular que contiene CFTR de señalización que se montó en vitro se muestra en la Figura 1. Un complejo macromolecular se formó entre MRP4 C-terminal de 50 aminoácidos (MRP4-CT50), los PDZK1 y de larga duración CFTR (Figura 1, abajo). La formación del complejo mayor dosis-dependiente con cantidades crecientes de la proteína intermediario, PDZK1 (Figura 1, parte inferior) ^18.

Figura 1. Una representación pictórica del ensayo complejo macromolecular (arriba). Un complejo macromolecular fue detectado in vitro con tres proteínas (GST-CT50-MRP4, Su-S-PDZK1, y la bandera CFTRwt) de una manera dosis-dependiente (abajo) ^18.

Tabla 1. Resumen de diversos complejos macromoleculares que contienen CFTR ensamblados in vitro.

En este protocolo, se demostró un método para ensamblar in vitro y la detección de un complejo macromolecular que contiene CFTR señalización utilizando proteínas purificadas (o fragmentos de proteínas) y / o lisados ​​de células como se informó anteriormente ^16-19,29,30. Para lograr los mejores resultados los siguientes puntos críticos durante el proceso de preparación requieren una atención especial:

• Es importante que el pH del tampón de elución se ajustó a 8,0 después de la adición de glutatión reducido cuando la purificación de la proteína de fusión GST-como se describe en el paso 1). El pH puede ser tan bajo como 3,0 después de la adición de glutatión reducido. Si el pH no se ajustó antes de la elución, la eficiencia de elución se reduce drásticamente.
• Cuando la proteína se eluyó de las perlas, es necesario que se dializa de inmediato, de lo contrario, la proteína purificada puede salir de la solución. Si la diálisis proteína no es posible inmediatamente después del proceso de elución, no eluir la proteína y dejarlos con ªe agarosa / perlas.
• Se recomienda no hervir las muestras macromoleculares CFTR que contienen complejos preparados para Western Blot, como la agregación de CFTR es un problema común. En su lugar, las muestras se debe calentar a 37 ° C durante 10-15 minutos antes de cargarse en el gel.
• Para el complejo de la proteína con la interacción de baja afinidad, la inmunotransferencia puede ser visualizada mediante SuperSignal West Femto (o Pico) Sustrato máxima sensibilidad (Pierce) para aumentar la señal.

La técnica ha demostrado aquí proporciona un ensayo conveniente y reproducible para definir bioquímicamente un complejo que contiene la proteína CFTR terciaria. Hay varias formas para montar el en complejos macromoleculares CFTR in vitro como se indica en la Tabla-1.

• Con el fin de obtener resultados convincentes, uno debe tratar de armar el complejo en ambos sentidos, es decir, i) CFTR - PDZ andamio proteína (s) - la tercera proteína, ii) la tercera proteína - proteína PDZ andamio (s) - CFTR.
• A fin de demostrar el PDZ motivo-dependencia de la formación de macromoléculas complejas, CFTR _His10 (CFTR _His10 contiene 10 Sus residuos en la cola C-terminal; esta proteína tiene un interior motivo PDZ y no se puede enlazar NHERFs ^29), las proteínas con su motivos PDZ mutado o suprimido (como β ₂ AR-L413A; LPA _2-ΔSTL; etc) que pueden utilizarse en paralelo en el ensayo macromolecular complejo también.
• En lugar de utilizar los lisados ​​enteros de células que contienen también muchos otros componentes, se puede utilizar proteínas purificadas (como la tercera proteína) en el paso 3.7) (tal como en el montaje de MRP4-PDZK1-CFTR, que también se utiliza la purificó Bandera de CFTR, referencia ^18).. Esto proporciona una convincente resultado de un complejo único de tres proteínas, ya que sólo hay tres proteínas purificadas que figuran en el sistema de asamblea.

Sin embargo, la detección del complejo macromolecular CFTR in vitro utilizando purificacióned (proteínas o fragmentos de proteínas) o lisados ​​de las células que sobreexpresan CFTR o las proteínas que interactúan no indican si el complejo macromolecular de señalización que existe en las células que expresan endógenamente estas proteínas que interactúan. Para abordar esta cuestión, co-inmunoprecipitación se puede realizar para evaluar los complejos endógenos CFTR en las células como las células epiteliales de las vías ¹⁶ y células epiteliales del intestino ^17,18. Además, el análisis de espectrometría de masas y 2-dimensional electroforesis en gel de ²⁹ se puede realizar para identificar desconocidos parejas de unión para CFTR. Sin embargo, está fuera del alcance de este protocolo para demostrar estas técnicas.

Además, la localización subcelular de interacción de proteínas in vivo puede afectar también a las interacciones moleculares. Por ejemplo, MRP4 se ha demostrado que se expresa en las membranas tanto apical y basolateral, mientras que CFTR se localiza principalmente a la membrana apical, aunque han sido demonstrated para interactuar física y funcionalmente entre sí a través de la proteína PDZ andamio PDZK1 ^18. Además, la sobreexpresión de las proteínas recombinantes, tal como se utiliza en el protocolo actual, puede afectar a su localización subcelular y permitir así que las interacciones de otro modo no se producen. Estas posibilidades también deben tenerse en cuenta al interpretar los datos y la extrapolación de los resultados.

Aunque el protocolo actual se centra en el procedimiento para ensamblar PDZ-dependientes contienen CFTR complejos macromoleculares, este protocolo también tiene aplicaciones potenciales en el montaje no-CFTR involucrados múltiples proteínas complejas (ya sea PDZ-dependiente o independiente). Más recientemente, utilizando este ensayo ensamblaje macromolecular, hemos demostrado que un receptor de quimioquinas CXCR2 físicamente forma un complejo proteína con su corriente abajo PLCβ efector ₂ mediada a través de NHERF1 en los neutrófilos, y este complejo macromolecular CXCR2 tiene funcionalrelevancia como perturbar el complejo (a través de uso de un péptido exógeno CXCR2) funciones de los neutrófilos significativamente atenuados ^31.

No hay conflictos de interés declarado.

Nuestro trabajo ha sido apoyado por becas de la American Heart Association (Gran Afiliado Sureste) 0765185B A partir de la concesión en la ayuda, la Fundación Elsa U. Pardee beca de investigación, y la Universidad Estatal de Wayne fondo de intramuros de inicio y de Investigación Cardiovascular del Instituto premio Iniciativa Isis. Este método de in vitro conjunto complejo macromolecular CFTR fue originalmente iniciado por el Dr. AP Naren (Universidad de Tennessee Health Science Center).