In-vitro-Analyse der PDZ-abhängigen CFTR Makromolekulare Signalkomplexe

Zystische Fibrose-Transmembran-Regulator (CFTR), eine epitheliale Chlorid-Kanal, wurde berichtet, dass mit verschiedenen Proteinen zu interagieren und zu regulieren wichtige zelluläre Prozesse, darunter die CFTR PDZ-Motiv-vermittelte Wechselwirkungen sind gut dokumentiert. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die wir entwickelt, um eine PDZ-abhängigen CFTR makromolekularen Signalkomplexes montieren In-vitro-.

Zystische Fibrose-Transmembran-Regulator (CFTR), ein Chlorid-Kanal in erster Linie auf den apikalen Membranen der Epithelzellen befindet, spielt eine entscheidende Rolle bei der transepithelialen Homöostase ^1-3. Zystischer Fibrose (CF) ⁴ und sekretorische Diarrhoe ^5: CFTR wurde in zwei der wichtigsten Krankheiten in Verbindung gebracht. Bei CF wird die Synthese oder die funktionelle Aktivität des CFTR-Cl-Kanal reduziert. Diese Erkrankung betrifft etwa 1 von 2500 Kaukasiern in den Vereinigten Staaten ^sechs. Übermäßige CFTR-Aktivität wurde auch in Fällen von Toxin-induzierte sekretorische Diarrhöe (z. B. durch Cholera-Toxin und hitzestabil E. coli Enterotoxin), die cAMP oder cGMP-Produktion im Darm ⁷ stimuliert in Verbindung gebracht.

Es gibt zunehmend Hinweise auf die Existenz der physischen und funktionellen Interaktionen zwischen CFTR und einer wachsenden Zahl von anderen Proteinen, einschließlich Transporter, Ionenkanäle, Rezeptoren, Kinasen, Phosphatasen, SignalIng. Moleküle und Zytoskelett-Elemente, und diese Interaktionen zwischen CFTR und ihre bindenden Proteinen wurde gezeigt, dass kritisch bei der Regulierung CFTR-vermittelten transepithelialen Ionentransport in vitro als auch in vivo ^8-19 einbezogen werden. In diesem Protokoll, konzentrieren wir uns nur auf die Methoden, die Hilfe bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen CFTR carboxyterminalen Schwanz, der ein Protein-Bindungsmotiv besitzt [bezeichnet als PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) Motiv], und einer Gruppe von Gerüst-Proteine, die eine spezifische Bindung Modul enthalten, bezeichnet als PDZ-Domänen. Bisher wurden verschiedene PDZ Gerüstproteine ​​wurde berichtet, dass die Carboxyl-terminalen Schwanz des CFTR mit verschiedenen Affinitäten wie NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-assoziierten Liganden), SHANK2 binden und GRASP ^20-27. Die PDZ-Motivs innerhalb CFTR, die von PDZ Gerüstproteine ​​erkannt wird, ist die letzten vier Aminosäuren am C-Terminus (dh 1477-DTRL-1480 in humanen CFTR) ^20. InteressanterweiseCFTR binden können mehr als eine PDZ-Domäne beider NHERFs und PDZK1, wenn auch mit unterschiedlicher Affinitäten ^22. Diese Multivalenz bezüglich CFTR Bindung wurde gezeigt, dass von funktionaler Bedeutung sein, was darauf hindeutet, dass PDZ Gerüstproteine ​​kann die Bildung von CFTR makromolekularen Komplexen ermöglichen Signalisierung für spezifische / selektive und effiziente Signalisierung in Zellen ^16-18.

Mehrere biochemische Assays wurden entwickelt, um zu studieren CFTR-Protein-Interaktionen beteiligt, wie z. B. Co-Immunopräzipitation, Pull-Down-Assay, paarweise Bindungsassay, kolorimetrische paarweise Bindungsassay und makromolekulare komplexe Montage-Assay ^16-19,28,29 . Hier haben wir auf die genauen Verfahren zum Zusammenbau eines PDZ-Motiv-abhängige CFTR-haltigen makromolekularen Komplex in vitro, die ausgiebig in unserem Labor zu Protein-Protein-oder Domain-Domain-Wechselwirkungen unter Beteiligung von CFTR ^16-19,28,29 Studie konzentrieren.

1. Expression und Aufreinigung von rekombinanten Tagged Fusionsproteine ​​in Bakterien

1. Amplify definierte Bereiche des C-Schwänze (die letzten 50 bis 100 Aminosäuren mit den PDZ Motive am C-Terminus) für CFTR, LPA _2, MRP2, MRP4, β ₂ AR und NHERFs (in voller Länge oder PDZ1 oder PDZ2 Domains ) durch PCR-Ansatz.
2. Klonen der PCR-Produkte in pGEX4T-1-Vektor für GST-Fusionsproteine ​​(wie GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-c2-Vektor für MBP-Fusionsproteine ​​(wie MBP-β ₂ AR CT, CT MBP-CFTR ) und pET30 für His-S-Fusionsproteine ​​(z. B. His-S-CFTR-CT, His-S-PDZK1).
3. Verwandeln Sie in einem Protease-defizienten E. coli-Stamm (BL21-DE3), um mögliche rekombinanten Proteins zu minimieren.
4. Die Kultur über Nacht bei 37 ° C in Luria-Bertani-Medium (pH 7,0) mit entsprechenden Antibiotika (wie Ampicillin oder Kanamycin). Verdünnen Sie die Übernacht-Kultur bei 1:10 und wachsen für weitere 2 h bei 37 ° C InDuce mit 0,5-1 m M IPTG für die nächsten 4 Stunden bei 30 ° C Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 8000 × g für 10 min bei 4 ° C
5. Lyse der Zellen in Saccharose-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF und 10% Saccharose) mit Lysozym (1 mg / ml), 0,2% Triton X-100, und Protease Inhibitoren. Verwenden Sie für 20 ml Zellpellet Ursprung aus 1 l Kultur.
6. Mit Hilfe eines rotierenden Schüttler für 30 min bei 4 ° C
7. Zentrifugieren bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C Sammeln Sie die klare Überstand.
8. In den klaren Überstand, fügen Sie 1 mL der folgenden Harz / Agaroseperlen (50% Gülle in Saccharose-Puffer):
   • Glutathion-Agarose-Beads für GST-Fusionsproteine.
   • Talon Perlen für His-S-Fusionsproteine.
   • Amylose-Harz für MBP-Fusionsproteine.
9. Mischung für 4 h bei 4 ° C auf einem Rotationsschüttler.
10. Waschen der Kügelchen durch Resuspendieren in 1 × PBS (15 ml), Mischen für 2 Meilenn, Schleudern bei 800 × g für 2 min, und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie diesen Schritt für das Sechsfache.
11. Eluieren des Proteins aus den Kügelchen unter Verwendung der jeweiligen Elutionspuffer (2 ml Elutionspuffer pro 1 ml Kügelchen).
    • Elutionspuffer für GST-Fusionsproteine: 25 m M Tris-HCl (pH 8,0), 140 mM NaCl und 20 mM reduziertes Glutathion.
    • Elutionspuffer für seine Fusionsproteine: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl und 200 mM Imidazol.
    • Elutionspuffer für MBP-Fusionsproteine: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 10 mM Maltose.
12. Dialysieren der eluierten Proteine ​​gegen 2 l 1 × PBS bei 4 ° C (um die Protein-Abbau zu vermeiden). Das PBS wechseln alle 4 Stunden für das Vierfache. Konzentrieren Sie sich das Protein mit einem Centricon-Filter (Cutoff 10.000 MW, Millipore) und speichern als kleinen Aliquots bei -80 ° C
13. DetHermelin die Proteinkonzentration durch das Bradford-Verfahren. Bewerten Proteinqualität durch SDS-PAGE unter Verwendung von BSA als Standard. Wenn die Integrität des Proteins nicht zufriedenstellend ist, kann die sekundäre Reinigungsverfahren, wie Gelfiltration oder Ionenaustausch verwendet werden. (ZB haben wir eine G-75-Sepharose-Säule verwendet werden, um weiter zu reinigen GST-Fusionsprotein).

2. Cell Culture und Zelllysat Vorbereitung

1. Kultur Babyhamsternierenzellen (BHK)-Zellen, die stabil überexprimieren CFTR-wt und _CFTR-His10 oder BHK-Zellen, die vorübergehend über-Express-Flag-LPA _2-wt oder Flag-LPA _2-ΔSTL und Madin-Darby Canine Kidney (MDCK Zellen), die stabil überexprimieren MRP2 in Minimum Essential Eagle-Medium (MEM) 10% fötalem Kälberserum und Penicillin / Streptomycin in Polystyrol-Kolben bei 37 ° C, die mit 5% CO _2.
2. Kultur humanen embryonalen Nieren-293 (HEK293), die stabil überexprimieren CFTR-wt und _CFTR-His10 in Dulbecco'S modified Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und Penicillin / Streptomycin in Polystyrol-Kolben bei 37 ° C mit 5% CO _2.
3. Lyse der Zellen in Lysepuffer (PBS - 0,2% Triton-X-100 mit einer Mischung von Protease-Inhibitoren, die 1 m M Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 pg / ml Aprotinin, 1 ug / ml Leupeptin, 1 pg / ml Pepstatin ergänzt); Einsatz 500 ul Lysepuffer für jeden 60-mm-Petrischale, und 1000 ul Lysispuffer für jeden 100-mm-Petrischale.
4. Rock the Zelllysaten für 20 min bei 4 ° C, und Entfernen des unlöslichen Materials durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 15 min bei 4 ° C Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Bradford-Assay.

3. In-vitro-Montage eines CFTR-haltigen Makromolekulare Komplexe (CFTR-PDZK1-MRP4)

1. In 200 &mgr; l Lysepuffer (PBS - 0,2% Triton X-100 + Protease-Inhibitoren), fügen Sie 20 ug gereinigtes GST-MRP4-C Terminal50 aa (CT50) Fusionsprotein.
2. In unterschiedlichen Mengen (0-40 ug) von gereinigtem His-S-PDZK1 Fusionsprotein.
3. Mischen der beiden Proteine ​​auf einem Schüttler bei 22 ° C für 1-2 h.
4. In 20 uL Glutathion-Kügelchen (50% Gülle) in die Protein-Mischung, und weiterhin noch 1 h zu mischen. Dieser Schritt wird auch als paarweise Bindung bezeichnet.
5. Während dieser Zeit bereitet die HEK293 Zelllysaten überexprimieren Flag-CFTR (wt), wie oben beschrieben in Schritt 2).
6. Waschen Sie den Komplex zweimal mit Lysepuffer. Spin bei 800 × g für 1 min bei jeder Wäsche und vorsichtig den Überstand aspirieren nach jeder Wäsche. Seien Sie vorsichtig, nicht zum Absaugen der Perlen in der unteren.
7. In der oben hergestellten HEK293 Zelllysaten an die Kügelchen und sanft bei 4 ° C für 3 h gemischt (oder über Nacht).
8. Waschen der Kügelchen umfassend dreimal mit Lysepuffer, wie in Schritt 3.6) beschrieben.
9. Eluieren die Proteine ​​mit 30 ul Probenpuffer (5 ×): 0,6 m Tris-HCl (pH 6,8), 50% Glycerin, 2% SDS und 0,1% Bromphenolblau, enthaltend 5% β-Mercaptoethanol.
10. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 10-15 min und Spin bei 5.000 × g für 30 s, die gebildeten Kügelchen.
11. Laden Sie alle das Eluat auf 4-15% Gel.
12. SDS-PAGE etwa 30-40 Minuten.
13. Transfer-Protein-Bands auf die PVDF-Membran, für 1,5 Stunden.
14. Blockieren Sie die Membran in TBS-Tween mit 5% fettfreie Milch.
15. Inkubieren der Membran mit primärem Antikörper (wie anti-IgG CFTR, R1104) bei 4 ° C über Nacht.
16. Waschen der Membran mit TBS-Tween für 5 min, sechsmal.
17. Inkubieren der Membran mit sekundärem Antikörper (z. B. Ziegen-Anti-Maus-HRP-konjugierten ^2. Antikörper) für 45 min bei 22 ° C
18. Waschen der Membran mit TBS-Tween für 5 min, sechsmal.
19. Visualisieren Sie die Proteinbanden mittels ECL.
20. Repräsentative Daten sind in Abbildung 1 dargestellt.

Ein Beispiel von CFTR-enthaltenden makromolekularen Signalkomplexes, die in vitro zusammengebaut wurde, wird in 1 gezeigt. Ein makromolekularen Komplex wurde zwischen MRP4 C-terminalen 50 Aminosäuren (MRP4-CT50), PDZK1, und in voller Länge CFTR (Abbildung 1, unten) gebildet. Die Komplexbildung erhöht dosisabhängig mit steigenden Mengen des Proteins Überträger, PDZK1 (Abbildung 1, unten) ^18.

Abbildung 1. Eine bildliche Darstellung der makromolekularen Komplex-Assay (oben). Ein makromolekularen Komplex wurde in vitro mit drei (GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1, und Flag-CFTRwt) in einer Dosis-abhängigen Weise (unten) ¹⁸ erfasst.

Tabelle 1. Zusammenfassung verschiedener CFTR-enthaltende makromolekulare Komplexe in vitro montiert.

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, ein Verfahren zur In-vitro-Nachweis von Montage und ein CFTR-enthaltenden makromolekularen Signalkomplexes mit gereinigten Proteine ​​(oder Proteinfragmente) und / oder Zell-Lysate, wie zuvor berichtet ^16-19,29,30. Um die besten Ergebnisse erzielt die folgenden kritischen Punkte während des Herstellungsverfahrens erfordern besondere Aufmerksamkeit:

• Es ist wichtig, dass der pH des Elutionspuffers auf 8,0 nach Zugabe reduziertem Glutathion bei der Reinigung des GST-Fusionsprotein wie in Schritt 1) ​​beschrieben eingestellt werden. Der pH-Wert kann so niedrig wie 3,0 nach der Zugabe von reduziertem Glutathion. Wenn der pH-Wert wird nicht vor der Elution eingestellt, wird die Effizienz der Elution drastisch reduziert.
• Wenn Protein von den Beads eluiert wird, müssen sie sofort dialysiert werden, da sonst das gereinigte Protein könnte kommen aus der Lösung. Wenn Protein Dialyse ist nicht direkt nach der Elution Prozess möglichst nicht zu eluieren, die das Protein und lassen sie mit the Agarose / Perlen.
• Es wird dringend empfohlen, nicht die CFTR-haltigen makromolekularen Komplex Proben für die Western-Blot als CFTR-Aggregation ist ein häufiges Problem vorbereitet kochen. Stattdessen sollten die Proben bei 37 ° C für 10-15 min erhitzt werden, bevor in das Gel geladen.
• Für die Protein-Komplexes mit niedriger Affinität Wechselwirkung kann die Immunoblot sichtbar machen, indem SuperSignal West Femto (oder Pico) Maximale Empfindlichkeit Substrat (Pierce), um das Signal zu erhöhen.

Die Technik demonstriert hier bietet eine bequeme und reproduzierbare Tests zu definieren, biochemisch eine CFTR-Protein-Komplex mit tertiären. Es gibt mehrere Möglichkeiten, um die In-vitro CFTR makromolekularen Komplexen montieren, wie in Tabelle-1 skizziert.

• Um überzeugende Ergebnisse zu erzielen, sollte man versuchen, den Komplex in beide Richtungen, dh i) montieren CFTR - PDZ Gerüstprotein (en) - das dritte Protein, ii) die dritte Protein - PDZ Gerüstprotein (n) - CFTR.
• Um die PDZ-Motiv-Abhängigkeit der makromolekularen Komplex-Bildung zeigen, _{CFTR-His10 (CFTR-His10} enthält 10 His-Reste in der C-terminalen Schwanz, das Protein eine interne PDZ-Motiv und nicht binden können NHERFs ^29), Proteine ​​mit ihren PDZ Motive mutiert oder deletiert (zB β ₂ AR-L413A; LPA _2-ΔSTL, etc) parallel in der makromolekularen Komplex Probe als auch verwendet werden.
• Anstatt die gesamte Lysaten von Zellen enthalten, die auch viele andere Komponenten, kann man gereinigten Proteine ​​(wie die dritte Protein) im Schritt-3.7 verwenden) (wie in der Anordnung von MRP4-PDZK1-CFTR, verwendeten wir das gereinigte Flag-CFTR; ref ^18).. Dies bietet deutliche Ergebnis einer ausschließlich Tri-Protein-Komplex, da nur 3 gereinigte Proteine ​​in der gesamten Baugruppe System enthalten sind.

Jedoch Erfassung des CFTR makromolekularen Komplex in vitro unter Verwendung purifiED-Proteine ​​(oder Protein-Fragmente) oder Lysaten aus Zellen überexprimieren, dass CFTR oder die interagierende Proteine ​​nicht an, ob die makromolekulare Signalkomplexes in Zellen besteht, dass diese endogen exprimieren interagierende Proteine. Um dieses Problem anzugehen, kann Co-Immunopräzipitation durchgeführt, um die endogenen CFTR-Komplexe in Zellen wie Epithelzellen der Luftwege ¹⁶ bewerten und Epithelzellen des Darms ^17,18 werden. Darüber hinaus kann die Massenspektrometrie-Analyse und 2-dimensionale Gelelektrophorese ²⁹ durchgeführt, um unbekannte Bindungspartner für CFTR zu identifizieren. Es ist jedoch über den Rahmen dieses Protokoll, um diese Techniken zu demonstrieren.

Darüber hinaus kann die subzelluläre Lokalisation von interagierenden Proteinen in vivo auch auf molekularer Wechselwirkungen. So hat sich gezeigt, dass MRP4 in beiden apikalen und basolateralen Membranen ausgedrückt werden, während CFTR in erster Linie auf der apikalen Membran lokalisiert, obwohl sie de gewesenmonstrated um physikalisch und funktionell miteinander interagieren über die PDZ Gerüstprotein PDZK1 ^18. Darüber hinaus Überexpression der Proteine, wie in dem aktuellen Protokoll verwendet, kann sich auf ihre subzelluläre Lokalisierung und ermöglichen so Wechselwirkungen, die sonst nicht auftreten. Diese Möglichkeit sollte auch berücksichtigt werden, wenn die Daten interpretiert und Extrapolation der Ergebnisse.

Obwohl die aktuelle Protokoll konzentriert sich auf das Verfahren zur PDZ-abhängigen CFTR-haltigen makromolekularen Komplexen montieren, dieses Protokoll auch über mögliche Anwendungen in der Montage nicht-CFTR beteiligt Multi-Protein-Komplex (entweder PDZ-abhängig oder unabhängig). In jüngster Zeit mit diesen makromolekularen Anordnung Assay, haben wir gezeigt, dass ein Chemokinrezeptor CXCR2 physikalisch bildet einen Protein-Komplex mit seinem stromabwärtigen Effektor PLCβ ₂ vermittelten über NHERF1 in Neutrophilen und das CXCR2 makromolekularen Komplex funktionelleRelevanz als Störung des Komplexes (über Verwendung einer exogenen CXCR2 Peptid) signifikant abgeschwächt Neutrophilenfunktionen ^31.

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Unsere Arbeit wurde durch Zuwendungen von der American Heart Association (Großraum Südost Affiliate) Beginning-Grant-in-Hilfe-0765185B, der Elsa U. Pardee Foundation Research Grant und der Wayne State University intramuralen Gründerfonds und Cardiovascular Research Institute Isis-Initiative ausgezeichnet unterstützt worden. Diese Methode der in vitro CFTR makromolekularen Komplex Montage wurde ursprünglich Pionierarbeit von Dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).