Method Article
Zystische Fibrose-Transmembran-Regulator (CFTR), eine epitheliale Chlorid-Kanal, wurde berichtet, dass mit verschiedenen Proteinen zu interagieren und zu regulieren wichtige zelluläre Prozesse, darunter die CFTR PDZ-Motiv-vermittelte Wechselwirkungen sind gut dokumentiert. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die wir entwickelt, um eine PDZ-abhängigen CFTR makromolekularen Signalkomplexes montieren In-vitro-.
Zystische Fibrose-Transmembran-Regulator (CFTR), ein Chlorid-Kanal in erster Linie auf den apikalen Membranen der Epithelzellen befindet, spielt eine entscheidende Rolle bei der transepithelialen Homöostase 1-3. Zystischer Fibrose (CF) 4 und sekretorische Diarrhoe 5: CFTR wurde in zwei der wichtigsten Krankheiten in Verbindung gebracht. Bei CF wird die Synthese oder die funktionelle Aktivität des CFTR-Cl-Kanal reduziert. Diese Erkrankung betrifft etwa 1 von 2500 Kaukasiern in den Vereinigten Staaten sechs. Übermäßige CFTR-Aktivität wurde auch in Fällen von Toxin-induzierte sekretorische Diarrhöe (z. B. durch Cholera-Toxin und hitzestabil E. coli Enterotoxin), die cAMP oder cGMP-Produktion im Darm 7 stimuliert in Verbindung gebracht.
Es gibt zunehmend Hinweise auf die Existenz der physischen und funktionellen Interaktionen zwischen CFTR und einer wachsenden Zahl von anderen Proteinen, einschließlich Transporter, Ionenkanäle, Rezeptoren, Kinasen, Phosphatasen, SignalIng. Moleküle und Zytoskelett-Elemente, und diese Interaktionen zwischen CFTR und ihre bindenden Proteinen wurde gezeigt, dass kritisch bei der Regulierung CFTR-vermittelten transepithelialen Ionentransport in vitro als auch in vivo 8-19 einbezogen werden. In diesem Protokoll, konzentrieren wir uns nur auf die Methoden, die Hilfe bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen CFTR carboxyterminalen Schwanz, der ein Protein-Bindungsmotiv besitzt [bezeichnet als PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) Motiv], und einer Gruppe von Gerüst-Proteine, die eine spezifische Bindung Modul enthalten, bezeichnet als PDZ-Domänen. Bisher wurden verschiedene PDZ Gerüstproteine wurde berichtet, dass die Carboxyl-terminalen Schwanz des CFTR mit verschiedenen Affinitäten wie NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-assoziierten Liganden), SHANK2 binden und GRASP 20-27. Die PDZ-Motivs innerhalb CFTR, die von PDZ Gerüstproteine erkannt wird, ist die letzten vier Aminosäuren am C-Terminus (dh 1477-DTRL-1480 in humanen CFTR) 20. InteressanterweiseCFTR binden können mehr als eine PDZ-Domäne beider NHERFs und PDZK1, wenn auch mit unterschiedlicher Affinitäten 22. Diese Multivalenz bezüglich CFTR Bindung wurde gezeigt, dass von funktionaler Bedeutung sein, was darauf hindeutet, dass PDZ Gerüstproteine kann die Bildung von CFTR makromolekularen Komplexen ermöglichen Signalisierung für spezifische / selektive und effiziente Signalisierung in Zellen 16-18.
Mehrere biochemische Assays wurden entwickelt, um zu studieren CFTR-Protein-Interaktionen beteiligt, wie z. B. Co-Immunopräzipitation, Pull-Down-Assay, paarweise Bindungsassay, kolorimetrische paarweise Bindungsassay und makromolekulare komplexe Montage-Assay 16-19,28,29 . Hier haben wir auf die genauen Verfahren zum Zusammenbau eines PDZ-Motiv-abhängige CFTR-haltigen makromolekularen Komplex in vitro, die ausgiebig in unserem Labor zu Protein-Protein-oder Domain-Domain-Wechselwirkungen unter Beteiligung von CFTR 16-19,28,29 Studie konzentrieren.
1. Expression und Aufreinigung von rekombinanten Tagged Fusionsproteine in Bakterien
2. Cell Culture und Zelllysat Vorbereitung
3. In-vitro-Montage eines CFTR-haltigen Makromolekulare Komplexe (CFTR-PDZK1-MRP4)
Ein Beispiel von CFTR-enthaltenden makromolekularen Signalkomplexes, die in vitro zusammengebaut wurde, wird in 1 gezeigt. Ein makromolekularen Komplex wurde zwischen MRP4 C-terminalen 50 Aminosäuren (MRP4-CT50), PDZK1, und in voller Länge CFTR (Abbildung 1, unten) gebildet. Die Komplexbildung erhöht dosisabhängig mit steigenden Mengen des Proteins Überträger, PDZK1 (Abbildung 1, unten) 18.
Abbildung 1. Eine bildliche Darstellung der makromolekularen Komplex-Assay (oben). Ein makromolekularen Komplex wurde in vitro mit drei (GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1, und Flag-CFTRwt) in einer Dosis-abhängigen Weise (unten) 18 erfasst.
CFTR-NHERF1-β 2 AR (Code 14) | CFTR-NHERF2 LPA-2 (Ref. 15) | CFTR-Proteine PDZ-MRP 2 (Ref. 17) | CFTR-PDZK1-MRP4 (Ref. 16) | |
Affinitätsbeads | Amyloseharz | S-Protein-Agarose | Amyloseharz | Glutathion-Agarose |
Gereinigtes Protein-1 | MBP-β 2 AR CT | His-S-CFTR-CT | MBP-CFTR CT | GST-MRP4 CT |
Gereinigtes Protein-2 | GST-NHERF1 | GST-NHERF2 | GST-PDZ-Proteine | His-S-PDZK1 |
Gereinigtes Protein-3 (oder Zelllysaten) | CFTR-wt oder CFTR-His10 (BHK-oder HEK-Zelllysaten) | FlaggeLPA-2-wt oder Flag-LPA 2-ΔSTL (BHK Zelllysaten) | MRP2 (MDCK Zelllysaten) | Gereinigtes Flag-CFTR-wt oder CFTR-His10 (oder Zelllysaten) |
Antikörper | Anti-CFTR-IgG | Anti-Flag HRP | Anti-MRP2-IgG | Anti-Flag HRP |
Tabelle 1. Zusammenfassung verschiedener CFTR-enthaltende makromolekulare Komplexe in vitro montiert.
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, ein Verfahren zur In-vitro-Nachweis von Montage und ein CFTR-enthaltenden makromolekularen Signalkomplexes mit gereinigten Proteine (oder Proteinfragmente) und / oder Zell-Lysate, wie zuvor berichtet 16-19,29,30. Um die besten Ergebnisse erzielt die folgenden kritischen Punkte während des Herstellungsverfahrens erfordern besondere Aufmerksamkeit:
Die Technik demonstriert hier bietet eine bequeme und reproduzierbare Tests zu definieren, biochemisch eine CFTR-Protein-Komplex mit tertiären. Es gibt mehrere Möglichkeiten, um die In-vitro CFTR makromolekularen Komplexen montieren, wie in Tabelle-1 skizziert.
Jedoch Erfassung des CFTR makromolekularen Komplex in vitro unter Verwendung purifiED-Proteine (oder Protein-Fragmente) oder Lysaten aus Zellen überexprimieren, dass CFTR oder die interagierende Proteine nicht an, ob die makromolekulare Signalkomplexes in Zellen besteht, dass diese endogen exprimieren interagierende Proteine. Um dieses Problem anzugehen, kann Co-Immunopräzipitation durchgeführt, um die endogenen CFTR-Komplexe in Zellen wie Epithelzellen der Luftwege 16 bewerten und Epithelzellen des Darms 17,18 werden. Darüber hinaus kann die Massenspektrometrie-Analyse und 2-dimensionale Gelelektrophorese 29 durchgeführt, um unbekannte Bindungspartner für CFTR zu identifizieren. Es ist jedoch über den Rahmen dieses Protokoll, um diese Techniken zu demonstrieren.
Darüber hinaus kann die subzelluläre Lokalisation von interagierenden Proteinen in vivo auch auf molekularer Wechselwirkungen. So hat sich gezeigt, dass MRP4 in beiden apikalen und basolateralen Membranen ausgedrückt werden, während CFTR in erster Linie auf der apikalen Membran lokalisiert, obwohl sie de gewesenmonstrated um physikalisch und funktionell miteinander interagieren über die PDZ Gerüstprotein PDZK1 18. Darüber hinaus Überexpression der Proteine, wie in dem aktuellen Protokoll verwendet, kann sich auf ihre subzelluläre Lokalisierung und ermöglichen so Wechselwirkungen, die sonst nicht auftreten. Diese Möglichkeit sollte auch berücksichtigt werden, wenn die Daten interpretiert und Extrapolation der Ergebnisse.
Obwohl die aktuelle Protokoll konzentriert sich auf das Verfahren zur PDZ-abhängigen CFTR-haltigen makromolekularen Komplexen montieren, dieses Protokoll auch über mögliche Anwendungen in der Montage nicht-CFTR beteiligt Multi-Protein-Komplex (entweder PDZ-abhängig oder unabhängig). In jüngster Zeit mit diesen makromolekularen Anordnung Assay, haben wir gezeigt, dass ein Chemokinrezeptor CXCR2 physikalisch bildet einen Protein-Komplex mit seinem stromabwärtigen Effektor PLCβ 2 vermittelten über NHERF1 in Neutrophilen und das CXCR2 makromolekularen Komplex funktionelleRelevanz als Störung des Komplexes (über Verwendung einer exogenen CXCR2 Peptid) signifikant abgeschwächt Neutrophilenfunktionen 31.
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Unsere Arbeit wurde durch Zuwendungen von der American Heart Association (Großraum Südost Affiliate) Beginning-Grant-in-Hilfe-0765185B, der Elsa U. Pardee Foundation Research Grant und der Wayne State University intramuralen Gründerfonds und Cardiovascular Research Institute Isis-Initiative ausgezeichnet unterstützt worden. Diese Methode der in vitro CFTR makromolekularen Komplex Montage wurde ursprünglich Pionierarbeit von Dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
pGEX4T-1-Vektor | GE Healthcare | 28-9545-49 | früher Amersham Biosciences |
pMAL-c2-Vektor | New England Biolabs | ||
pET30 Vektor | EMD Chemicals | 69077-3 | früher Novagen |
Glutathion-Agarose-Kügelchen | BD Biosciences | 554780 | |
Amyloseharz | New England Biolabs | E8021S | |
Talon Perlen | Clontech | 635501 | |
reduziertem Glutathion | BD Biosciences | 554782 | |
Imidazol | Fischer | BP305-50 | |
Maltose | Fischer | BP684-500 | |
S-Protein-Agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | früher Novagen |
Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
Anti-CFTR-IgG | Maßgeschneidert | R1104 | mAb erkennt CFTR-Epitop aa 722-734 bei |
Anti-MRP2-IgG | Chemicon International | MAB4148 | Jetzt ein Teil von Millipore |
Tabelle 2. Spezifischen Reagenzien und Geräte.
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten