Аутологичных эндотелиальных клеток-предшественников-Посев Технология и Биосовместимость Тестирование Для сердечно-сосудистой устройства в Большой Модель животных

Метод посева крови титана контактирующих биоматериалов с аутологичных клеток и тестирование биосовместимости описано. Этот метод использует эндотелиальных клеток-предшественников и титановых труб, отобранный через несколько минут после хирургической имплантации в свиной полых вен. Этот метод можно адаптировать ко многим другим имплантируемых биомедицинских устройств.

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation^1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)⁴. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces^5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo.

Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs^4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes.

We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating⁹. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed.

After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.

We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.

Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

1. Эндотелиальных клеток-предшественников изоляции

1. Тридцать дней до EPC-посеян трубки имплантации, готовят 60 мл шприц с 15 мл антикоагулянта цитрат декстрозы решения и безопасный с 3-х ходовой кран для ЕРС изоляции из периферической крови свиньи. За 24 часов до крови рисовать, намывной два 12-луночных планшетах с 1 типа крыса коллагена (50 мкг / мл, растворенный в 0,02 н раствор уксусной кислоты) ^4.
2. Поведение всех ухода за животными и эксперименты в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и только после одобрения надзора Институциональные уходу и использованию животных комитета.
3. Седативный женщин Йоркшир свиней (45 кг) с Acepromazine (1,1 мг / кг) и кетамина (22 мг / кг) с помощью внутримышечной иглой 19 G бабочки.
4. Интубировать свинья с эндотрахеальной трубки (30 см длиной, 8 мм ID) и обезболить свинья с изофлюрана (4,5% от дыхательного объема по маске).
5. Монитор свиньи во время процедуры путем измерения насыщения крови кислородом, частоты сердечных сокращений и температуры. Поддерживать терморегуляции с помощью автоматизированной подогревом операционный стол и отопления одеялом и при нагревании придают жидкости.
6. Место кота в положении лежа на операционном столе, обеспечить его задние конечности caudolaterally, и чистый с Хлоргексидин следуют DuraPrep стерилизации. Затем приступить драпировки тазовой области.
7. Вставьте 21 G х 7 см иглу из 5 F микро-интродьюсер комплект просто медиальнее бедренной ощутимым импульсом (медиальнее vastus медиальной и латеральной к мышце гасШз) в бедренную вену иглу и вены с использованием Сельдингера техники. Подключите подготовлены 60 мл шприца внутрисосудистого катетера и привлечь 45 мл крови.
8. Держите давление на сайте судна прокол для достижения гемостаза (5 мин), следует прекратить анестезии и восстановить свиньи. Животное отслеживается до полного восстановления и вернулся в свою клетку.
9. Развести крови решение 1:1 с буферный раствор соли Хэнка (без CaCl _2, MgCl _2, MgSO ₄₎ и слой на равных объемов Histopaque для создания четко определенных слоев. Центрифуга (30 мин, 740 г, низкое значение перерыва) и собирать мононуклеарных клеток (МНК) слоя. Ресуспендируют и мыть МНК х 3 с фосфатом Дульбеко буферного раствора (DPBS) (10 мин, 515 г), прежде чем покрытие на два 12-луночных планшетах в полной питательной среде (ДМ-2 среде с 2% свиной сыворотки (PS) и EGM-2 SingleQuots) при 37 ° C, 5% СО _2.
10. Медленно изменение среды каждые 24 часа в течение первых 7 дней, затем через день. Определить EPC колоний после среднее время
    от 7 дней (рис. 2).
11. Развернуть ЕРС в культуре как только они покрывают четверть 12-а площадью поверхности. Подтвердите EPC идентичность с проточной цитометрии путем проверки на наличие поверхностных маркеров CD31 и отсутствие CD14, CD45. Другие анализы, которые могут быть выполнены включают морфологии клеток и оксид азота III активность после воздействия потока ^4.

2. Титан трубкой

1. Раздел трубки Ti продольно на 3 равные 120 градусов единиц (4,5 см в длину) с 72 зубами HHS резки видел удерживается на месте увидели беседка в вертикальный фрезерный станок. Запустите его на 300 оборотов в минуту и держать лесосеки насыщенный Нажмите Магия смазочно-охлаждающая жидкость в течение всего времени резания (рис. 3).
2. Польский внутренней поверхности с мясорубки скамейке и Scotch-Brite металлообработки колеса. Затем вручную полируют наждачной бумагой 3M дальнейшего гладкой и ровной поверхности, чтобы удалить все видимые ямы.
3. Чистый титан куски с решением Алконокс мылом, затем 5 минут погружения в царской водке (1:3 концентрированной азотной кислоты в концентрированной соляной кислоты), с последующей промывкой с несколькими литрами воды ^10. Проявлять крайнюю осторожность, как царская водка является сильно едким веществом и взрывоопасной!
4. Разрушать ультразвуком Ti разделы х 16 мин в растворе Алконокс мыло, поднимайтесь х 30 в деионизированной воды и снова разрушать ультразвуком х 16 мин в деионизованной воде. Дайте высохнуть в ламинарный поток капот.
5. Вырезать из ПВХ термоусадочные трубки до 4,5 см в длину и тщательно очистить в 2,4.
6. Используйте пинцет, чтобы место 3 очищены Ti разделы на поддержку оправки (изготовлены из алюминия, диаметр 8,5 мм) и поместите рукав ПВХ термоусадочной трубки вокруг разделы Ti (рис. 4). Термоусадочная трубка с тепловой пушки во время поворота оправки равномерно обернуть Ti разделы тесно вместе.

3. Устройство Посевная и сборки компонентов

1. Вырезать силиконовые трубки в длину 2,5 см и 3,5 см.
2. Раздел 5 мл пластиковый шприц на 0,8 мл марку и сохранить "головной убор" Луер с конца.
3. Тщательно очистите 2 х силиконовых разделы: "головной убор" шприц и крышка Луер ультразвуком как описано в разделе 2.4.
4. Добавить силиконовые трубки на каждом конце трубки Ti собран с 2,5, расширенийдинь на 5 мм на трубы из ПВХ.
5. Вставьте обрезанный конец "головной убор" шприца в короткие трубки силиконовые, так что он примыкает Ti трубки (рис. 5).
6. Печать готового Ti трубкой с одним Луер колпачок в сумке Tyvek и газа стерилизации окисью этилена (18 часов при 55 ° С).
7. Горы синхронного двигателя сроки (10 РПХ) на оргстекло платформу и подключить его оси до шприца держатель (обрабатываемых из алюминия, подходит 5 мл шприц) (рис. 6).

4. EPC-посев Ti внутренней поверхности трубки

1. Развернуть ЕРС как изолированные в возрасте до 1. Сливающийся до 3 Т-75 колб (или, по крайней мере, 9 х 10 ⁶ клеток).
2. В день операции, флуоресцентно этикетке клетки с долгосрочными красителя (PKH26) ^11. Начните с промывки культурный ЕРС дважды в бессывороточной среде. Внимание ограничить освещенности для защиты клеток во время и после маркировки.
3. Обложка клетки с 4 мкМ PKH26 в Разбавитель С (раствор красителя) при комнатной температуре в течение 4 минут.
4. Стоп маркировки реакцию добавлением свиной сыворотки в равном объеме с раствором красителя. Один мин позже, развести комбинированное решение 1:1 с полным средний рост.
5. Аспирацию жидкости и промойте клетки х 3 с полной средний рост.
6. Вымойте ЕРС дважды в DPBS (без CaCl _2, MgCl _2).
7. Обложка клеток в трипсина и инкубировать при 37 ° С в течение 3 минут и подтвердите отряд под световым микроскопом. Добавить Трипсин нейтрализации раствора в двойном объеме трипсина используется.
8. Комбинат ячейки решений в единую трубку и перемешать с помощью пипетки. Добавьте 10 мкл клеточного раствора в каждую сторону гемоцитометра для подсчета.
9. Центрифуга клетка решение (1500 RPH, 5 мин.). Граф клетки и ресуспендируют гранул в 2 - 2,5 х 10 ⁶ ЕРС / мл в сыворотке крови свободной среде. Обратите внимание, минимальный объем для заполнения трубки сборки составляет 4,5 мл.
10. Разложите стерильную полотенце в биологических капот для стерильных области. Открытые газовые стерилизовать Ti сборки труб и дополнительные 5 см шприц на стерильную области.
11. С стерильные перчатки, снимите поршень от 5 мл шприц и держать на поле для дальнейшего использования. Прикрепите Луер шапка на этот шприц.
12. Внесите 4,5 - 5 мл EPC подвески под 4,9 в открытую бочку шприц. Вставьте поршень надежно обратно в открытый конец шприца.
13. Держите шприц с цоколем вверх и снимите крышку. Вставьте шприц Луер концу первого в открытые трубки силиконовые собраний трубка Ti до уютно, не переходят в трубку Ti.
14. Advance поршень шприца медленно, пока клетка решение достигает верхнего среза шприц "головной убор", удаляя пузырьки из системы. Закрыть крышкой с Луер и вставьте всю сборку в стерильные оболочки, герметизации открытого конца с лентой.
15. Вставьте этот диск в сборе с держателем обрабатываемых в шприц 3.7. Место в инкубаторе при температуре 37 ° С и отрегулировать платформы так, чтобы часть трубки Ti посева камера уровне, с использованием воды датчик уровня (рис. 6).
16. Разрешить Ti трубкой, чтобы повернуть за 30 минут до имплантации.

5. Имплантация Ti трубку в свиной нижней полой вены

1. Двадцать четыре часа до операции, premedicate свинья (из которого было выделено ЕРС) с Фентанил патч (100 мкг / ч трансдермального; сохранить патч на месте х 72 часов).
2. Держите свинья НПО в ночное время и администрировать Baytril (Энрофлоксацин) до операции в день операции (5 мг / кг, IM) и в течение 7 дней со дня, каждые 24 часов, как профилактика антибиотиками.
3. Седативный, интубация и обезболить свиньи, как описано в разделе 1.3 (дыхательный объем на 10 -15 мл / кг) и закрепите кота в лежачем положении на операционной стол. Монитор свиньи во время процедуры путем измерения насыщения крови кислородом, частоты сердечных сокращений и температуры. Поддерживать терморегуляции с помощью автоматизированной подогревом операционный стол и отопления одеялом и при нагревании придают жидкости.
4. Вставьте 18 G IV катетер в вену уха свиньи и защищать глаза свиньи с каплями Vetropolycin глаз.
5. Чистый, приготовительные и драп живота свиньи, как в 1.6. Надрезать средней линии с # 15 лезвие скальпеля из второго набора молочных желез краниально до 2-го по последний набор каудально.
6. Carry вскрытия до брюшной фасции с электрокоагуляции.
7. Поднимите брюшины с Mosquito щипцами и осторожно ввести его с Metzenbaum ножницами.
8. Externalize мочевого пузыря и место 3-О Викрил кисетный шва в стенку мочевого пузыря. Место удара разрез в ее середине и вставьте 16 F катетер Фолея. Администрирование внутривенное введение жидкости (лактат Рингера) для титрования на диурез> / = 1 мл / кг / час во время операции.
9. После, экстернализации малого и толстого кишечника и место Бальфура два хирургических преднатяжителями подвергать задней поверхности брюшной полости и выявить нижней полой вены (НПВ).
10. Использование острые и тупые рассечение, тщательно бесплатный IVC от окружающих тканей и скелетируют судно с правой почечной артерии проксимальнее бифуркации IVC дистальной. Упражнение крайне осторожно во время вскрытия IVC так как даже очень маленький дефект IVC может привести к быстрому кровоизлияния и обескровливание животного.
11. Перевязывать все стороны ветвями сегменте IVC, чтобы не будет кровотечение вокруг трубки Ti для имплантации. Обратите внимание, обычно больших двух задних поясничной вены, которые требуют очень осторожны, вскрытие и труб. Кроме того, обратите внимание, что сразу проксимальнее бифуркации IVC, большой поясничной вены часто встречающихся на задне стороне и должны быть свободными и расчлененный управляться с судном петель в подготовке к зажим размещения.
12. Приступить к посевной трубки Ti одновременно, как указано в 4.
13. Администрирование 100 USP / кг гепарина непосредственно перед зажима IVC. Место под углом 45 градусов хирургические зажимы дистально на IVC и поясничной вены, а затем проксимально.
14. Создать продольной veinotomy (4 см) между проксимальной и дистальной зажимы использованием # 11 лезвие скальпеля следует расширение с Поттс ножницами.
15. Эвакуация любых кровь из IVC и промойте его внутреннюю полость стерильным DPBS.
16. Теперь вставьте EPC-посеян Ti трубку (или голой контроль металла) в IVC и залейте его DPBS (с CaCl _2, MgCl ₂₎ для предотвращения клетки от высыхания и эвакуировать воздух.
17. Закрыть veinotomy с 4-0 Prolene швом и удалить одну проксимальных зажим для де-воздух IVC через небольшое количество резервного кровотечение. Место пребывания-шов "через стенку вены в трубы из ПВХ для предотвращения миграции имплантата с течением времени.
18. Закрыть панель с O-ПДС на иглу КТ и подкожного пространства с 2-O Викрил (бег швов). Закрыть кожи с помощью скоб.
19. Администрирование до 20 мл 0,25% Marcaine (Бупивакаин) подкожно вдоль разреза и покрывают рану марлей и Tegaderm. Также дайте Flunixin (2,2 мг / кг Q 24 ч) и оксиморфон (0,15 мг / кг, Q 3 - 4 ч) подкожно, сколько необходимо для боли.
20. Прекратите анестезии, мониторинг свинья, пока проснуться и вернуться в клетку. Монитор свинью два раза в день в течение признаки бедствия / боль, стоя и ходьбе, кала и мочи, и цвет кожи указывает нормальное перфузии.

6. Эксплантации Ti трубки

1. Через 3 недели, степенный, интубация и обезболить свиньи, как описано в 1.3 - 1.4.
2. Приступить к лапаротомии, как описано в 5.5 - 5.8.
3. Обратите внимание, что рубцы будут скрывать имплантата сайт, но вы можете прощупать жесткой трубки Ti на месте.
4. Рассеките из IVC, как описано в 5.9 - 5.11 и эксплантов трубки Ti ан-блока с окружающими IVC с тяжелыми ножницами.
5. Усыпить животное с Euthasol эвтаназии раствора (390 мг / мл, фенобарбитала натрия и 50 мг / мл фенитоин натрия на 1 мл / 10 кг).

7. Фиксация и визуализации внутренней поверхности Ti

1. Промыть вырезали вены сегмента с трубкой Ti в растворе DPBS и сфотографировать его просвета (патент или окклюзия) с высоким разрешением цифровой камерой (рис. 7).
2. После, исправить образца путем погружения в 3,7% параформальдегида в течение минимум 15 минут. Полоскание в растворе образца DPBS.
3. Очень осторожно надрезать окружающие вены и ПВХ трубы, чтобы открыть трубку Ti. Место 3 секции под флуоресцентным микроскопом с внутренних поверхностей перед цель / источник света и образ при длине волны 550 нм возбуждения визуализировать PKH26 меченных ЕРС в красный / оранжевый цвет (рис. 8А). При желании, клетки могут быть дополнительно окрашенный (например, тромбоцитов эндотелиальных маркеров клеточной адгезии (PECAM)-пятном для визуализации границ ячеек (рис. 8Б), DAPI-пятном для визуализации ядер и т. д.).

8. Представитель результаты:

После выполнения этого протокола, врачи и ученые могут endothelialize твердые структуры трубки с аутологичной крови полученных эндотелиальных клеток-предшественников в модель большого животного. Рисунок 2 показывает, что ЕРС изолированы с помощью нашего метода выглядят как колонии с булыжником морфологии приблизительно через 7 дней культуры. Наши посева Устройство, изображенное на рисунках 5 и 6 позволяет медленное вращение трубы Ti заполнены EPC подвески и приводит к равномерное покрытие внутренней поверхности трубки в стерильных условиях ^9.

Наши операции имплантации позволяет испытывать склонность биоматериалов, таких как Ti, развития тромбоза в модель большого животного. Мы обнаружили, что свиньи переносят эту процедуру, и что это имплантация может быть достигнуто только с минимальной потерей крови и без нарушения слоя EPC.

Рисунок 1. Схема аутологичных эндотелиальных клеток-предшественников (EPC) посева эксперимента. Во-первых, периферическая кровь берется из свиньи. Далее, ЕРС изолированы от крови и расширена в культуре. ЕРС затем используются для линии титана (Ti) трубки устройства, который затем имплантируется в нижней полой вены одного и того же свинья, из которого клетки были изолированы.

Рисунок 2. Представитель колонии ЕРС в области культуры, около 7 дней после изоляции процедуры (полученную с перевернутой Leica DMIL микроскоп с изображениями камеры и QCapture программного обеспечения).

Рисунок 3. Ti трубки разделы перед сборкой. Ti трубки разрезают на три равные секции продольно, а затем сократить до 4,5 см длиной. Внутренние поверхности раздела Ti полируются использованием дробилки скамьи и наждачной бумагой, чтобы удалить видимые ямы.

Рисунок 4. Ассамблея разделов Ti трубки ПВХ термоусадочные трубки (синий) и тепловые пушки. Ti разделы поддерживаются на обрабатываемой алюминиевой оправки, которая проходит через разделы Ti и соответствует размерам трубка Ti внутреннего диаметра.

Рисунок 5 Титан трубкой, с указанием всех компонентов:. Луер шапка, "головной убор", шприц силиконовые трубки, и Ti трубки ПВХ обертывание (синий). Ассамблея вместе взятые перед стерилизацией для хирургического использования.

Рисунок 6. Ti трубки посева установки внутри инкубатора, показывая двигателя, платформы, механически обработанные алюминий шприц держатель, Ti трубкой и 5 мл шприца. Примечание: Ассамблея показана без защитной оболочки стерильные для визуализации целей.

Рисунок 7. Представителю валового результатов имплантации хирургии. () End вида контроля голой металлической трубки Ti после имплантации в свиной нижней полой вены (НПВ). Труба просвет полностью окклюзии с твердым сгусток. (В) Конечные зрения EPC-посеян трубки Ti после имплантации. Труба просвет полностью патент и ясно. (С) расчлененный зрения контроля (голый) Ti трубку после 3 дня имплантации, показывающие степень тромбоза (эксперименты проводились до 3-х недель продолжительности с одинаковыми результатами).

Рисунок 8. ЕРС на поверхности трубки Ti следующие 3 дня имплантации (полученную с вертикально Leica DMRB микроскоп с QImaging QICAM монохромный цифровой камерой и изображение Pro Plus программного обеспечения). (А) Сливной клеток на поверхности показывает PKH26 перед операцией маркировки. (B) Сливной слой ЕРС. Красный: PKH26 перед операцией маркировки. Зеленый: EPC-PECAM пятно.

Метод клеточной посева труб Ti, представленные здесь позволяет врачам и ученым, чтобы быстро и равномерно endothelialize крови контактирующих поверхностей имплантируемых устройств. Так как мы изолировать и расширить ЕРС из периферической крови, никаких серьезных инвазивные процедуры, необходимые для сбора этих клеток. Более того, ЕРС являются аутологичных, поэтому риск любых иммунной реакции на клеточной посеяны имплантат устранены. Принципы продемонстрировал в своей протокол может быть использован не только для Ti трубы, но и для многих других биоматериалов, которые используются в сердечно-сосудистой медицины.

Критические шаги в этом протоколе тщательной очистки Ti трубы, как мы выяснили, что любой приверженец пленки загрязнений соблюдение ячейки компромиссов. Кроме того, низкая скорость вращения (обратно пропорциональна диаметру трубы) имеет важное значение во время посева процесс, например, что ЕРС может медленно адаптироваться и придерживаться поверхности трубки Ti находится в движении.

Наш метод посева непосредственно перед имплантацией избегает непрактично раз естественных бывший культуры, клетки придерживаться индивидуально и поздняя форма вырожденная лист в естественных условиях, не допуская возможности эмболизации, как лист сразу же после восстановления потока. Наши предыдущие исследования показали, что когда-то ЕРС выросли до сливной слой, они делают внеклеточного матрикса, к которым они твердо придерживаться, кроме того, свести к минимуму любые возможные отторжения эндотелиальных листа. Хотя возможность эмболии отряд не может быть полностью исключена, это, кажется, многократно снизить риск тромбоза, чем вся поверхность устройства, проблемы, что эта терапия направлена ​​на предотвращение.

Наш подход к имплантации в низкой скорости сдвига, протромботическое среду нижней полой вены использует один из самых надежных больших моделей животных для исследования совместимости крови и тромбоз устройств ^5,6. Заметим, что все ухода за животными и экспериментов был проведен в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и только после одобрения Университета Дьюка Институциональные уходу и использованию животных комитета.

Для того чтобы успешно использовать этот метод имплантации биоматериалов для тестирования и устройств, важно, чтобы терпеливо скелетируют сегменте IVC и перевязывать все венозной ветви судов в рамках подготовки к устройству вставки, например, что ни кровотечение вокруг устройство берет свое начало в «ложный просвет. Другим важным шагом является добавление DPBS в устройстве просвета, что клетки на поверхности трубки внутри остаются влажными во время закрытия veinotomy а до реперфузии начинается. Если устройство не может быть найден в том месте, где он был имплантирован, он может мигрировать "вверх" в IVC. Это можно предотвратить путем размещения шва (4-O Prolene) через стенки вены и через 2 - 3 мм разделе трубы из ПВХ так, чтобы трубка прочно закрепились в его нынешнем месте. В случае, если исследователь не удается найти флуоресцентно предварительно меченых клеток показано на рисунке 8 после эксплантации в противном случае патент трубки, вполне вероятно, что клетки снимают как единое листа. Это можно предотвратить, очень нежный рассечение окружающие вены и рас-сборка 3 секции Ti трубки, после фиксации вены вместе с трубкой.

Наша технология обеспечивает доказательство правильности концепции для предотвращения сердечно-сосудистых тромбозов устройства через EPC-посева. Эта технология может быть использована в развитии "биогенные" имплантаты выстроились с пациентами собственных эндотелиальных клеток-предшественников. Технико-экономическое обоснование в нашей свиного животной модели предусматривает первые шаги к переводу этого «персонализированной медицины» в клинической практике.

Нет конфликта интересов объявлены.

Авторы хотели бы поблагодарить Leica Microsystems за ценные советы по визуализации разделов титана и Близнецы био-продукты для обеспечения свиной сыворотки, используемые в данном исследовании. Мы также хотели бы поблагодарить NIH за их поддержку через Грант "Аутологичная EPC подкладки для улучшения биосовместимости кровообращения помощи устройства", RC1HL099863-01. Кроме того, мы благодарны за поддержку Национального Научного Фонда исследований Высшей Братства Александра Jantzen. Мы также хотели бы поблагодарить Джорджа Быстрый, Майк Лоу и Ianthia Паркер за помощь многие аспекты хирургической процедуры и обращения наших животных исследования. Стивен Оуэн была неоценима в обработке многих частях нашего посева устройства и резки титановых труб.