Quero desenvolver um tratamento melhor para crianças com ossos quebrados. Especificamente, quero evitar a formação óssea na placa de crescimento da cartilagem fraturada porque, caso contrário. o membro quebrado não se alonga normalmente.
No primeiro passo, tivemos que desenvolver um modelo de camundongo mais preciso para testar novas terapias e determinar o mecanismo de ação. Os tratamentos convencionais envolvem a ressecção da ponte óssea após a lesão e a inserção de materiais interposicionais, como tecido adiposo. Esses métodos não regeneram a cartilagem da placa de crescimento e geralmente requerem cirurgias adicionais.
No entanto, as abordagens emergentes de engenharia de tecidos que estamos testando agora incluem moléculas localizadas para aumentar a regeneração da cartilagem e, ao mesmo tempo, prevenir a formação de pontes ósseas. Modelos animais são essenciais para testar abordagens de engenharia de tecidos para a regeneração da cartilagem da placa de crescimento lesionada. Existem compensações entre precisão e custo.
Animais maiores, como ovelhas, oferecem maior precisão e consistência na modelagem de lesões, mas são muito mais caros do que animais menores, como camundongos. O objetivo de nosso esforço aqui é entender a base celular para essa resposta tecidual que ocorreu após a lesão da placa de crescimento. Usando nossos camundongos fluorescentes de três cores, somos capazes de mapear as células que emanam essas cores, juntamente com outras manchas fluorescentes e minerais somáticos de anticorpos, e mapeá-las de volta para uma coloração cromogênica familiar.
Isso nos permite apreciar o dinamismo do reparo e identificar as células responsáveis por essa resposta tecidual. A fluorescência nativa dos condrócitos hipertróficos nesses camundongos transgênicos jovens permite que o pesquisador crie com precisão uma lesão na placa de crescimento clinicamente relevante que imita a lesão de uma criança. Além disso, a cartilagem articular permanece intacta e os extensos reagentes disponíveis para estudos mecanísticos em camundongos podem ser utilizados.
Para começar, posicione três camundongos anestesiados de cada vez em paralelo em seus estômagos no gabinete de raios-X. Abra as pernas dos camundongos para que os ossos tibiais não fiquem obscurecidos sob eles. Para registrar o comprimento inicial do membro, posicione uma escala radiopaca perto dos camundongos e realize imagens de raios-X com 26 quilovolts e 800 miliamperes para capturar suas imagens tibiais.
Na sala de cirurgia animal, monte o sistema eletrônico de perfuração odontológica de alta velocidade. Conecte o pedal eletrônico e a peça de mão à unidade de controle e cubra o cabo da peça de mão com meias de tubo de barreira de superfície desinfetadas. Defina o controlador em uma relação de acionamento de um para um com um máximo de 30.000 rotações por minuto.
Em seguida, coloque a mangueira flexível da máquina de isoflurano coberta com meias de tubo desinfetadas no microscópio estéreo fluorescente stage. Para começar, determine o comprimento inicial do membro do camundongo com imagens de raios-X. Prenda a broca dentária redonda estéril de 0,5 milímetro à peça de mão e selecione os outros instrumentos cirúrgicos necessários.
Após anestesiar o animal, administre imediatamente metade da dose prescrita de buprenorfina por via subcutânea. Aplique lubrificante ocular para proteger os olhos do mouse do ressecamento e transfira o mouse em decúbito dorsal no estágio do microscópio estéreo. Desinfetar o membro posterior direito, região pélvica, face anterior do membro posterior esquerdo e cauda sequencialmente com iodopovidona, seguido de etanol a 70%.
Sob iluminação de luz brilhante empregando um bisturi número 15, crie uma incisão na pele de cinco milímetros logo abaixo da articulação do joelho para revelar a extremidade proximal da tíbia direita. Mantenha a tíbia contralateral esquerda sem lesões para que ela sirva como um controle interno sem lesões. Em seguida, usando a parte de trás da lâmina do bisturi número 15, faça uma dissecção romba vertical através do músculo sobrejacente na tíbia proximal, removendo o tecido mole para uma exposição clara da cabeça da tíbia.
Depois de desligar as luzes da sala de cirurgia, selecione o canal de fluorescência correto para iluminar a região desejada da placa de crescimento. Em seguida, ajuste a abertura da pele do camundongo um pouco mais proximal e depois distal, para garantir que a área da placa de crescimento hipertrófica da placa de crescimento tibial esteja à vista, e não a placa de crescimento do fêmur. Para criar uma lesão semelhante a Salter-Harris Tipo II, posicione a broca odontológica de 0,5 milímetro no meio da zona da placa de crescimento hipertrófico.
Mantenha a broca e o membro paralelos à superfície de trabalho, de modo que o caminho de entrada da broca não se incline para a epífise, nem passe por toda a placa de crescimento mole. Aplique pressão no pedal da broca para iniciar a rotação da broca e pressione suavemente a broca na placa de crescimento, parando antes que o defeito vá mais fundo do que o diâmetro da broca. Irrigue o local da lesão com uma gota de PBS estéril para remover quaisquer detritos.
Usando uma sonda periodontal, confirme se a profundidade dos defeitos é de 0,5 milímetros. Em seguida, realinhe cuidadosamente as bordas da pele. Em seguida, empregue uma técnica de sutura interrompida com suturas de ácido poliglicólico 5-0 para selar a incisão na pele.
Para a dissecção do tecido, isole os dois membros posteriores intactos do animal sacrificado e remova a pele e o músculo da área capsular do osso e do joelho. Em seguida, usando uma tesoura de microdissecação, excise a patela com cuidado. Empregue uma seringa de insulina de calibre 29 para distribuir completamente a formalina fria tamponada a 10% em todas as áreas da cavidade do joelho.
Finalmente, corte a região diafisária do fêmur e da tíbia para melhorar o acesso do fixador ao espaço medular. Amarre o tecido articular com gaze a um pino fino. Coloque os membros posteriores no fixador e coloque o tecido a quatro graus Celsius para mantê-lo em uma posição totalmente estendida por 24 a 36 horas.
As tíbias lesionadas exibiram um crescimento reduzido em comprimento em comparação com os controles não lesionados três semanas após a cirurgia em seções transversais 2D do osso. As placas de crescimento lesadas mostraram ruptura da zona hipertrófica e camada provisoriamente calcificada com apenas uma leve perturbação na zona proliferativa. A formação de ponte óssea dentro das placas de crescimento lesionadas foi consistentemente observada em todos os seis camundongos, e a maioria se formou perto do meio da placa de crescimento, apesar da abordagem lateral.
A abordagem de fluorescência multicolorida permitiu um exame detalhado da diferenciação de condrócitos dentro da área da ponte óssea.
