Quiero desarrollar un mejor tratamiento para los niños con huesos rotos. Específicamente, quiero evitar la formación de hueso en la placa de crecimiento del cartílago fracturado porque, de lo contrario. La extremidad rota no se alargará normalmente.
El primer paso fue desarrollar un modelo de ratón más preciso para probar nuevas terapias y determinar el mecanismo de acción. Los tratamientos convencionales consisten en resecar el puente óseo después de una lesión e insertar materiales interposicionales como tejido graso. Estos métodos no regeneran el cartílago de la placa de crecimiento y, a menudo, requieren cirugías adicionales.
Sin embargo, los enfoques emergentes de ingeniería de tejidos que ahora estamos probando incluyen moléculas localizadas para estimular la regeneración del cartílago y prevenir la formación de puentes óseos. Los modelos animales son esenciales para probar los enfoques de ingeniería de tejidos para la regeneración del cartílago de la placa de crecimiento lesionada. Hay compensaciones entre la precisión y el costo.
Los animales más grandes, como las ovejas, ofrecen una mayor precisión y consistencia en el modelado de lesiones, pero son mucho más caros que los animales más pequeños, como los ratones. El objetivo de nuestro esfuerzo aquí es comprender la base celular de esta respuesta tisular que se produjo después de la lesión en la placa de crecimiento. Usando nuestros ratones fluorescentes de tres colores, podemos mapear las células que emanan estos colores, junto con otras tinciones fluorescentes y minerales somáticos de los anticuerpos, y mapearlos a una tinción cromogénica familiar.
Esto nos permite apreciar el dinamismo de la reparación e identificar las células que son responsables de esta respuesta tisular. La fluorescencia nativa de los condrocitos hipertróficos en estos ratones transgénicos jóvenes permite al investigador crear con precisión una lesión de la placa de crecimiento clínicamente relevante que imita la lesión de un niño. Además, el cartílago articular permanece intacto y se pueden utilizar los amplios reactivos disponibles para estudios mecánicos en ratones.
Para comenzar, coloque tres ratones anestesiados a la vez en paralelo sobre sus estómagos en el gabinete de rayos X. Separe las patas de los ratones para que los huesos tibiales no se oscurezcan debajo de ellos. Para registrar la longitud inicial de la extremidad, coloque una escala radiopaca cerca de los ratones y realice imágenes de rayos X con 26 kilovoltios y 800 miliamperios para capturar sus imágenes tibiales.
En la sala de cirugía animal, ensamble el sistema electrónico de perforación dental de alta velocidad. Conecte el controlador de pie electrónico y la pieza de mano a la unidad de control y cubra el cable de la pieza de mano con un tubo de barrera de superficie desinfectado. Ajuste el controlador a una relación de accionamiento de uno a uno con un máximo de 30.000 revoluciones por minuto.
A continuación, coloque la manguera flexible de la máquina de isoflurano cubierta con un tubo desinfectado en la platina del microscopio estereoscópico fluorescente. Para comenzar, determine la longitud inicial de la extremidad del ratón con imágenes de rayos X. Coloque la fresa dental redonda estéril de 0,5 milímetros en la pieza de mano y seleccione los demás instrumentos quirúrgicos necesarios.
Después de anestesiar al animal, administrar inmediatamente la mitad de la dosis prescrita de buprenorfina por vía subcutánea. Aplique lubricante ocular para proteger los ojos del ratón del secado y transfiera el ratón en posición supina en la platina del microscopio estereoscópico. Desinfectar la extremidad posterior derecha, la región pélvica, la cara anterior de la extremidad posterior izquierda y la cola secuencialmente con povidona yodada, seguido de etanol al 70%.
Bajo una iluminación de luz brillante empleando un bisturí número 15, cree una incisión en la piel de cinco milímetros justo debajo de la articulación de la rodilla para revelar el extremo proximal de la tibia derecha. Mantenga la tibia contralateral izquierda intacta para que sirva como un control interno sin lesiones. A continuación, utilizando la parte posterior de la hoja de bisturí número 15, realice una disección roma vertical a través del músculo suprayacente en la tibia proximal, eliminando el tejido blando para una exposición clara de la cabeza tibial.
Después de apagar las luces del quirófano, seleccione el canal de fluorescencia correcto para iluminar la región deseada de la placa de crecimiento. A continuación, ajuste la abertura de la piel del ratón un poco más proximal, y luego distal, para asegurarse de que el área de la placa de crecimiento hipertrófica de la placa de crecimiento tibial esté a la vista, y no la placa de crecimiento del fémur. Para crear una lesión similar a la de Salter-Harris tipo II, coloque la fresa de fresa dental de 0,5 milímetros en el centro de la zona de la placa de crecimiento hipertrófica.
Mantenga la fresa y la extremidad paralelas a la superficie de trabajo, de modo que la vía de entrada de la fresa no se incline hacia la epífisis ni atraviese toda la placa de crecimiento suave. Aplique presión sobre el pedal de perforación para iniciar la rotación de la fresa y presione suavemente la fresa en la placa de crecimiento, deteniéndose antes de que el defecto sea más profundo que el diámetro de la fresa. Irrigar el sitio de la lesión con una gota de PBS estéril para eliminar cualquier residuo.
Con una sonda periodontal, confirme que la profundidad de los defectos es de 0,5 milímetros. Luego, realinee con cuidado los bordes de la piel. Luego, emplee una técnica de sutura interrumpida con suturas de ácido poliglicólico 5-0 para sellar la incisión en la piel.
Para la disección de tejidos, aísle las dos extremidades traseras intactas del animal sacrificado y extraiga la piel y el músculo del hueso y el área capsular de la rodilla. Luego, con unas tijeras de microdisección, extirpe la rótula con cuidado. Utilice una jeringa de insulina de calibre 29 para distribuir completamente la formalina fría tamponada al 10% dentro de todas las áreas de la cavidad de la rodilla.
Por último, cortar la región diafisaria del fémur y la tibia para mejorar el acceso del fijador al espacio de la médula. Ate el tejido articular con una gasa a una clavija delgada. Coloque las extremidades traseras en el fijador y coloque el tejido a cuatro grados centígrados para mantenerlo en una posición completamente extendida durante 24 a 36 horas.
Las tibias lesionadas mostraron un crecimiento reducido en longitud en comparación con los controles no lesionados a las tres semanas después de la cirugía en secciones transversales 2D del hueso. Las placas de crecimiento lesionadas mostraron disrupción de la zona hipertrófica y capa provisionalmente calcificada con solo una ligera alteración en la zona proliferativa. La formación de puentes óseos dentro de las placas de crecimiento lesionadas se observó consistentemente en los seis ratones, y la mayoría se formó cerca de la mitad de la placa de crecimiento, a pesar del abordaje lateral.
El enfoque de fluorescencia multicolor permitió un examen detallado de la diferenciación de condrocitos dentro del área del puente óseo.
