Name: culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification
Uploaded: 2016-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification at JoVE.com

We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF &amp; VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram realizados em conformidade com os Animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act 1986 e os animais foram mantidos de acordo com o Ministério do Interior publicou Código de Boas Práticas para o alojamento e tratamento dos animais criados, transmitidos ou utilizados para fins científicos. NOTA: As experiências levadas a cabo utilizando o tipo selvagem C57BL / 6J são bem estabelecida e descrita a seguir. Metatarsos embrionárias a partir de diferentes estirpes de ratinho podem similarmente ser cultivadas in vitro, apesar de as suas taxas de crescimento e a mineralização pode ser diferente para os aqui detalhados. 1. As condições dissecação e preparação de instrumentos <ol><li> Executar toda a preparação de mídia, tecidos dissecções e trabalhar a cultura em uma capela de fluxo laminar para garantir a esterilidade da mídia e rudimentos embrionárias. </li><li> Permitir cultura e meios de dissecção a equilibrar durante, pelo menos, 1 hora num banho a 37 ° C, 5% de CO2 antes da utilização. </li><li> esterilizar dissecçãotesouras, Dumont # 5 e # 4 Dumont pinças ao lado de um par de superfino Vannas micro tesoura (8 cm em linha reta, lâminas de 3 mm) por autoclavagem. Após autoclavagem, mergulhar o material de dissecação em etanol 70% antes da utilização. </li></ol> 2. Preparação de Dissecção e Meios de Cultura <ol><li> Prepare meio de dissecção <ol><li> Dilui-se meio essencial mínimo α-(sem nucleósidos, aMEM) em tampão fosfato salino (PBS) (01:13) e ressuspender a albumina de soro bovino (BSA) a 2 mg / m L, antes da esterilização por filtração através de uma seringa de diâmetro de 0,22 um, 33 milímetros filtro. NOTA: O meio de dissecção podem ser feitas, esterilizada por filtração e armazenada em alíquotas a -20 ° C indefinidamente. </li></ol></li><li> Prepare meio de cultura <ol><li> Culturas metatarsos embrionárias em 300 ul de meio de cultura (em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços). Prepara-se o meio de cultura pela adição de 0,2% w / v de BSA; 5 ug / ml de L-ASCOfosfato ácido rbic; 1 mM β-glicerofosfato (βGP; opcional - veja seção de resultados); 0,05 mg / ml de gentamicina e 1,25 mg de anfotericina B a aMEM e filtro de esterilização através de um filtro de seringa de 0,22 um de diâmetro, 33 mm. </li></ol></li></ol> 3. Murino Embryonic metatarso Dissecção e Cultura <ol><li> Abater o mouse grávida, abrigando embriões de 15 dias de idade, por deslocamento cervical, de acordo com as diretrizes de escritório em casa no Reino Unido </li><li> Coloque o supino animais e desinfectar a pele por pulverização com 70% de etanol. Utilizando tesouras de dissecação fazer uma grande incisão na linha média, penetrar a pele e o peritoneu para expor a cavidade abdominal. </li><li> Localizar os dois cornos uterinos do animal na região dorsal da cavidade do corpo. Retire os cornos uterinos, começando por libertar cada uterina do mesométrio por incisões cuidadosas com tesouras de dissecação e, finalmente, cortar os cornos uterinos livre em sua base. Place cornos uterinos em meio de dissecção. </li><li> Separe cada embrião, cortando entre locais de implantação ao longo do corno uterino e remover os embriões de seus sacos individuais usando uma pinça. embriões de reforma por decapitação, em conformidade com as diretrizes de escritório em casa no Reino Unido </li><li> Após desinfecção da pele por pulverização com 70% de etanol, usa Vannas micro tesouras para remover os membros posteriores dos embriões por incisão em torno do fémur proximal. Isto assegura tanto do membro posterior quanto possível é removido. Colocar os membros posteriores para uma placa de Petri em meio submerso dissecção antes da dissecação metatarso. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, começar a remover a pele ao redor do pé embrionário, por beliscar e puxá-lo usando o # 5 pinças, enquanto segurando o membro posterior constante usando o # 4 pinças. Isto é mais eficazmente realizada, agarrando a pele em torno do nível da tíbia e puxando para as falanges. A utilização de tesouras, nesta fase, para cortar opele muito fina não é necessária. </li><li> Cuidadosamente manter os tarsos do pé embrionária com # 4 pinças e retire o primeiro e quinto metatarsos por beliscar fora perto dos tarsos utilizando # 5 pinças e descarte. </li><li> Com o pé realizada na mesma posição, utilize o # 5 pinças para perturbar os tecidos conjuntivos entre as três falanges restantes e metatarsos. Insira a ponta do # 5 pinças na articulação entre as falanges e metatarsos para remover as falanges dos metatarsos. </li><li> Finalmente, use # 5 pinças para perturbar os tecidos conjuntivos entre os tarsos e metatarsos. Mais uma vez colocar a ponta do # 5 pinças no espaço da articulação entre os tarsos e metatarsos e gentilmente liberar os metatarsos dos tarsos. </li><li> Levante com cuidado os metatarsos agora livres com # 4 pinças e lugar em meio dissecção fresco. NOTA: dissecção cuidadosa deve fornecer 6 metatarsos de cada embrião. </li><li> Quando todos os metatarsos necessários foram dissecados, carefully lugar metatarsos individualmente em placas de 24 poços pré-aquecido contendo 300 ul de meio de cultura. Metatarsos de cultura a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5% durante até 14 dias. NOTA: Não altere os meios de comunicação de culturas E15, pelo menos até o dia 5 de cultura como isso afeta a sua capacidade de mineralização 26. As razões para isso não são claras, mas o crescimento linear e mineralização da matriz pode ser dependente de estimulação por fatores de crescimento liberados a partir dos metatarsos. </li></ol> 4. Análise e manipulação de culturas Metatarsal <ol><li> No dia da dissecção (dia 0) fazer medições longitudinais iniciais utilizando um microscópio com uma câmara montada e análise de imagem digital de software. Medir o comprimento da zona de mineralização central quando aparece depois de alguns dias de cultura. </li><li> Periodicamente, se necessário, fazer as medições posteriores (geralmente a cada 2º dia) até o último dia da cultura em que ponto mossos etatarsal são processados ​​depende de resultados necessários (discutido na introdução). </li><li> Médio Suplemento de culturas metatarso de órgãos com vários factores exógenos, por exemplo, fatores de crescimento, hormônios e agentes farmacológicos do dia 0 da cultura 22,24. Em todos os estudos deste tipo, o controlo não tratados metatarsos são necessários. NOTA: Embora seja aconselhável que os ossos de controle são o rudimento equivalente da perna contralateral, até hoje não houve quaisquer diferenças no crescimento linear ou potencial mineralização da cultura E15 2º, 3º e 4º metatarsos (ver abaixo, Figura 2) . </li></ol>

<ol>
	<li>Farquharson, C., Staines, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+no+bones+about+it.">The skeleton: no bones about it.</a> J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).</li><li>Berendsen, A. D., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development.">Bone development.</a> Bone. 80, 14-18 (2015).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423, 332-336 (2003).</li><li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+development+and+extracellular+matrix+protein+genes+by+RUNX2.">Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2.</a> Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).</li><li>de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+the+pathways+of+cartilage+and+bone+formation.">Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).</li><li>Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , (2005).</li><li>Farquharson, C., Jefferies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+and+longitudinal+bone+growth:+The+development+of+tibial+dyschondroplasia.">Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia.</a> Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495, 375-378 (2013).</li><li>Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles:+structure,+composition,+formation+and+function+in+calcification.">Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification.</a> Front. Biosci. 16, 2812 (2011).</li><li>Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+involvement+of+PHOSPHO1+in+matrix+vesicle-mediated+skeletal.">Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal.</a> J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).</li><li>Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+matrix+vesicles+in+skeletal+and+soft+tissue+mineralisation.">Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation.</a> Bone. 87, 147-158 (2016).</li><li>Brighton, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Growth+Plate.">Structure and Function of Growth Plate.</a> Clin. Orthop. , 22-32 (1978).</li><li>Shim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pubertal+growth+and+epiphyseal+fusion.">Pubertal growth and epiphyseal fusion.</a> Annals of pediatric endocrinology &amp; metabolism. 20, 8-12 (2015).</li><li>Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transitions+in+health+and+disease.">Cartilage to bone transitions in health and disease.</a> J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).</li><li>Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Chondrocyte+Performance+in+Growth-Plate+Cartilage+During+Longitudinal+Bone-Growth.">Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth.</a> Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).</li><li>Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Relationship+Between+The+Volume+Of+Hypertrophic+Chondrocytes+And+The+Rate+Of+Longitudinal+Bone-Growth+In+Growth+Plates.">Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates.</a> J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture.">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).</li><li>Thesingh, C. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchyme+in+embryonic+long+bones+as+early+deposition+site+for+osteoclast+progenitor+cells.">The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells.</a> Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).</li><li>Scheven, B. A., Hamilton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+bone+growth+in+vitro:+effects+of+insulin-like+growth+factor+I+and+growth+hormone.">Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone.</a> Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).</li><li>Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+IGF+regulation+of+longitudinal+bone+growth+in+rat+metatarsal+rudiments+cultured+in+serum-free+medium.">Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium.</a> Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).</li><li>Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+cartilage+and+bone+development.">Methods to study cartilage and bone development.</a> Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).</li><li>Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-I+augments+chondrocyte+hypertrophy+and+reverses+glucocorticoid-mediated+growth+retardation+in+fetal+mice+metatarsal+cultures.">Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures.</a> Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).</li><li>Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+plate+sparing+effects+of+the+selective+glucocorticoid+receptor+modulator,+AL-438.">The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).</li><li>MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+restricted+potential+for+recovery+of+growth+plate+chondrogenesis+and+longitudinal+bone+growth+following+exposure+to+pro-inflammatory+cytokines.">The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines.</a> J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).</li><li>Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch-up+growth+after+dexamethasone+withdrawal+occurs+in+cultured+postnatal+rat+metatarsal+bones.">Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones.</a> J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).</li><li>Haaijman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+terminal+chondrocyte+differentiation+by+bone+morphogenetic+protein+7+(OP-1)+in+vitro+depends+on+the+periarticular+region+but+is+independent+of+parathyroid+hormone-related+peptide.">Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide.</a> Bone. 25, 397-404 (1999).</li><li>Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OP-1+(BMP-7)+affects+mRNA+expression+of+type+1,+II,+X+collagen,+and+matrix+Gla+protein+in+ossifying+long+bones+in+vitro.">OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro.</a> J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEPE+is+a+novel+regulator+of+growth+plate+cartilage+mineralization.">MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization.</a> Bone. 51, 418-430 (2012).</li><li>Kaufman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of mouse development. , (1992).</li><li>Boskey, A. L., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture+Systems+for+Studies+of+Bone+and+Tooth+Mineralization.">Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization.</a> Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined.</a> Bone Miner. 12, 141-155 (1991).</li><li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+calcification+of+growth+plate+cartilage+as+a+result+of+compressive+force+in+vitro.">Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro.</a> Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).</li><li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+osteoclastic+bone-resorption+by+mechanical+stimulation+in+vitro.">Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro.</a> Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).</li><li>Dobie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+linear+bone+growth+by+GH+in+the+absence+of+SOCS2+is+independent+of+IGF-1.">Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1.</a> J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).</li><li>Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+1+receptor+(IGF1R)+signaling+regulates+osterix+expression+and+cartilage+matrix+mineralization+during+endochondral+ossification.">Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification.</a> Bone. 83, 48-57 (2016).</li><li>Huesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+co-operativity+of+tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+(TNAP)+and+PHOSPHO1+during+initiation+of+skeletal+mineralization.">The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+Growth+Defect+and+Deployment+of+Transient+Chondrocyte+Behaviors+Underlie+Osteoarthritis+Onset+in+a+Natural+Murine+Model.">Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 68, 880-891 (2016).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fetal+mouse+metatarsal+bone+explant+as+a+model+of+angiogenesis.">The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis.</a> Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).</li><li>Libby, P., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C,+collagen,+and+cracks+in+the+plaque.">Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque.</a> Circulation. 105, 1396-1398 (2002).</li><li>Alvarez, J., Serra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+and+redundant+roles+of+Smad3+in+TGF-beta-mediated+regulation+of+long+bone+development+in+organ+culture.">Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture.</a> Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).</li><li>Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOCS2+is+the+critical+regulator+of+GH+action+in+murine+growth+plate+chondrogenesis.">SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A cultura dos metatarsos embrionárias murinas fornece um modelo altamente fisiológica de crescimento endocondral e mineralização. Os primeiros estudos têm validado que E15 metatarsos do rato passar por um padrão normal de crescimento do esqueleto e diferenciação. A cartilagem (condrócitos) e o osso (osteoblastos e osteoclastos) células e as respectivas matrizes colagénicas são indistinguíveis dos observados in vivo. No entanto, existem algumas limitações reconhecidas desse modelo. A velocidade da diferenciação dos osteoclastos é prejudicada, como é o crescimento ósseo (mas não cartilagem diferenciação). O crescimento ósseo é de aproximadamente 50% mais lenta do que a observada in vivo e pode ser devido a deficiências em factores sistémicos que influenciam a produção de factores locais (por exemplo, IGF-1, BMP, etc.) 31. Além disso, é bem reconhecido que o osso é sensível ao ambiente mecânico e este é também o caso para metatarsos cultivadas, que respondem a CHanges em 32,33 carga mecânica. Por isso, em situações de carga, como descrito no presente protocolo, a mineralização e reabsorção mineral pode ser comprometida. No entanto, o modelo metatarso oferece a capacidade de medir directamente o crescimento ósseo linear que não é possível através de 2D e 3D em sistemas de cultura in vitro. Nós fornecemos uma descrição abrangente do protocolo envolvido na dissecção e cultura de E15 metatarsos murino e, na verdade, pela primeira vez, confirmar a validade de reunir o 2º, 3º e 4º metatarsos para experimentos. Metatarsos de E17 / E18 são comumente utilizados para investigar os mecanismos de crescimento de osso, devido ao seu grande potencial para crescer ex vivo por longos períodos de tempo (isto é, para além de 14 dias em cultura). Eles são um modelo bem estabelecido para investigar os papéis de fatores de crescimento no crescimento ósseo longitudinal embrionário.Além disso, a dissecção e a cultura de metatarsos pós-natal é normalmente utilizados para delinear os mecanismos que rodeiam o crescimento do osso pós-natal, como é entendido que o crescimento do osso e o crescimento pós-natal do osso fetal são reguladas de forma diferente 21. O crescimento do osso observada nos metatarsos cultivadas pós-natais é contudo significativamente menor do que a observada em rudimentos embrionárias 25,34, o que limita o seu potencial em estudos a longo prazo e destacando a influência sistémica mais no crescimento ósseo, nesta fase, pós-natal. Com efeito, 3 dias de idade de ratos pós-natais metatarsos são tipicamente o último estágio que podem ser usadas para se obter 34 crescimento mensurável. Aqui nós descrevemos nosso protocolo para o isolamento de ossos metatarsos embrionárias em E15. A ausência de mineral nos ossos metatarsos hydroxyapaptite E15 significa que eles proporcionam um modelo inigualável para investigar não apenas os mecanismos em torno do crescimento longitudinal do osso, mas também a iniciaçãode mineralização óssea. A matriz mineralizada da zona de condrócitos hipertrófica terminal fornece um andaime para invadir osteoblastos fixar um osso matriz específica (osteóide), que é posteriormente mineralizada, e como tal esta mineralização inicial é vital para a formação óssea bem-sucedido e funcional 35. Com efeito, uma série de relatórios recentes que utilizam metatarsos E15 já confirmaram a sua capacidade única para a investigação do 28,36,37 processo de mineralização. Além disso, os investigadores descreveram a utilização de metatarsos E15 como um modelo de angiogénese 38, destacando o potencial de metatarsos embrionárias como modelo fora do ambiente de crescimento de osso / mineralização. O protocolo, descrevemos requer apenas equipamentos de laboratório padrão, incluindo um capuz de fluxo laminar, um microscópio de dissecação para a realização da dissecção e uma incubadora de CO 2 para a cultura de rudimentos excisadas. Além disso, um cul muito básicostura contendo meio aMEM, BSA, antibióticos, antimicóticos e ácido L-ascórbico (um co-factor na síntese de hidroxiprolina e hidroxilisina, dois ácidos aminados essenciais para a produção de colagénio 39) evita o uso de aditivos não definidos, tais como soros de animais . Tradicionalmente, os investigadores têm adicionado βGP aos meios usados ​​para cultura metatarsos embrionárias mas como revelado nos nossos resultados, o uso de uma fonte de fosfato adicional não é necessária para a mineralização sucesso neste sistema de cultura. Este é um achado importante em nossa busca da compreensão dos mecanismos subjacentes ECM mineralização. Metatarsos tenham sido previamente infectadas com adenovírus contendo formas dominantes negativas de Smad2 para explorar o papel do fator transformador de crescimento β na regulação do desenvolvimento a longo osso 40. Aqui, também revelam a transfecção bem sucedida de ossos de tipo selvagem E15 metatarsos com partículas de vírus GFP, indicando ttécnicas de chapéu de lentivírus podiam ser facilmente adotado para manipular a expressão de genes em culturas metatarso. Da mesma forma, o sistema de cultura de órgãos metatársico é um excelente modelo em que a comparação do crescimento de ossos de ratos geneticamente alterados para melhor compreender o papel de um gene em particular no processo de crescimento do osso. Os nossos estudos anteriores têm utilizado o sistema de cultura de órgãos metatarso para determinar o papel de supressor de citocina-2 (SOCS2) no crescimento do osso endocondral. Usando ossos metatarsos de ratinhos deficientes em SOCS2, temos mostrado que o hormônio do crescimento é capaz de simular a sua independência crescimento longitudinal de insulina como fator de crescimento (IGF-1), ao contrário dos ossos metatarsos do tipo selvagem que não respondem ao crescimento tratamento hormonal 34, 41. Isto realça a medida em que as culturas metatarsos pode ser manipulado para examinar os efeitos de diferentes genes e / ou factores exógenos de crescimento de osso endocondral. Em resumo, temos detaiconduziu a um método para a extracção e cultura bem sucedida de ossos metatarsos embrionárias que podem ser manipulados e examinada usando uma variedade de análises. Este modelo ex vivo mantém célula-célula e as interacções célula-matriz, assim como contém condrócitos em diferentes fases de condrogénese, proporcionando assim um modelo mais fisiológico do que as células em monocamada ou cultura 3D. culturas de órgãos metatarsos são, portanto, um modelo único para investigar os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela ossificação endocondral, e são essenciais para promover nossa compreensão de ambos fisiologia óssea e fisiopatologia

O esqueleto é um órgão altamente complexa, dinâmico e complexo que tem uma gama de funções que vão desde a locomoção, a homeostasia iónica. Composto de osso e cartilagem, o esqueleto consiste em populações de células funcionalmente distintos que operam para manter a sua integridade estrutural, bioquímica e mecânica 1. Uma das funções primárias do esqueleto é o seu papel no desenvolvimento e crescimento. Esses processos requerem a orquestração de várias populações celulares que são reguladas através do sistema endócrino apertado e controle genético. Com a excepção da escápula ossos chatos por exemplo, crânio e esterno, o esqueleto dos mamíferos é formado por meio do processo conhecido como ossificação endocondral. Este processo, regulada tanto molecularmente e espacialmente, começa com a condensação de células mesenquimais derivadas principalmente a partir da mesoderme 2. Sob a influência do factor de transcrição SOX9, células em the interior das condensações diferenciar em condrócitos, expressar e segregar componentes de cartilagem específicos da matriz extracelular (ECM), tais como o colagénio de tipo II e agrecana. Células na margem da condensação, expressam colágeno tipo I e formar o pericôndrio, delineando o osso prospectivo 3. Mais tarde, os osteoprogenitores do pericôndrio diferenciar em osteoblastos, dirigido por a expressão dos factores de transcrição, e Runx2 osterix 4. Isto leva a uma predominância de osteoblastos e esta camada é renomeado o periósteo que forma um colar ósseo mineralizado em torno da secção média do osso. Penetração vascular do periósteo e invasão do andaime cartilaginoso ocorre trazendo com ela, haematopoetically células derivadas de osso, reabsorção de osteoclastos, que reabsorvem os restos de condrócitos e a maior parte da matriz cartilaginosa 5. Os espaços formados são preenchidos por osteoprogenitoras que dão origem à ossificação primáriacentro que ocupa o núcleo progressivamente da diáfise e funde-se com o periósteo. Outras células dão origem à medula óssea. Por volta de nascimento, vasos sanguíneos e osteoprogenitoras penetrar na matriz rica cartilagem em ambos os lados (epífise) da diáfise desenvolvimento para formar o centro de ossificação secundário. Situado entre a epífise e diáfise em cada extremidade dos ossos longos é uma banda da cartilagem - a placa de crescimento epifisária - que é responsável pela coordenação de crescimento linear de todos os ossos longos 6. Condrócitos dentro da placa de crescimento inicialmente proliferar e posteriormente progredir através de zonas morfologicamente distintas, coordenados pela expressão seqüencial de fatores de transcrição e de crescimento. A culminação dessa sequência de eventos é a saída do ciclo celular e hipertrofia dos condrócitos no centro deste precursor cartilagem. condrócitos hipertróficos expressar fortemente colágeno X tipo e metaloproteinases da matriz-13 (MMP13) e sua ampliação considerável volume na direção do crescimento longitudinal fornece a maior contribuição para o crescimento ósseo em mamíferos 7,8. Além disso, condrócitos hipertróficos mineralizar sua ECM envolvente através da liberação de vesículas da matriz, estruturas de membrana delimitada especializada para a produção de fosfato de cálcio amorfo através da sua inclusão das fosfatases (tecido não-específico de fosfatase alcalina (TNAP) e PHOSPHO1) e proteínas de cálcio canalização (Anexinas ) 9-11. Esta cartilagem calcificada é invadido por vasos sanguíneos a partir da medula subjacente resultando no recrutamento de osteoclastos e reabsorção da matriz. Isto é seguido pela migração de osteoblastos e de alinhamento para a superfície dos restos de cartilagem calcificada onde eles estabelecem uma camada de osteóide que é rapidamente mineralizado. O tecido ósseo da esponjosa primária é posteriormente remodelado para osso lamelar da esponjosa secundária 12. fusão resulta na epifisárioscessação de ossificação endocondral 13. Ossificação endocondral está sob regulação apertada por muitos hormônios endócrinos e parácrinos e fatores de crescimento, de modo a prevenir o desenvolvimento perturbado e / ou crescimento ósseo longitudinal 14. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e celulares que sustentam esses processos é, portanto, imperativo em nossa busca de avanços clínicos no sentido de benefício humano. Pesquisas anteriores sobre as semelhanças e diferenças entre placas de crescimento de diferentes idades, locais e espécies têm melhorado bastante a nossa compreensão dos mecanismos fisiológicos que cercam a dinâmica da placa de crescimento 15,16. No entanto, o estudo de condrócitos isolados é difícil, tal como a remoção de condrócitos a partir de seu ambiente pode conduzir a desdiferenciação, acompanhado de perda de expressão de marcadores de chave, tais como COL2A1 17. O mouse metatarso cultura explante órgão, pioneered pelo Prof. Elisabeth Burger e colegas na Holanda, é um modelo altamente fisiológico ex vivo para estudar a ossificação endocondral e crescimento ósseo como a taxa de crescimento dos ossos na cultura que imitam visto in vivo 18. De forma única, a cultura de órgãos metatarso permite o exame de condrócitos em diferentes fases de condrogénese e mantém-célula e as interacções célula-matriz, o que proporciona condições para mais perto a situação in vivo do que as células em cultura de 19-21. Além disso, este modelo permite o exame directo do crescimento ósseo linear que não é possível em culturas de condrócitos primários. Além disso, permite a separação de factores sistémicos e locais, por conseguinte, que permitem a análise específica dos efeitos locais sobre a placa de crescimento. A cultura dos metatarsos permite a investigação de vários parâmetros. medições diárias de comprimento total e das regiões mineralizadas derudimentos pode ser realizada com microscopia de contraste de fase normal e software de análise de imagem. Histológica, hibridação in situ e a coloração imuno-histológica pode ser prontamente realizada em secções do metatarso, o que permite a resolução espacial de ambas as entidades moleculares e celulares, uma vantagem importante sobre os métodos tradicionais de cultura de células. A imuno-histoquímica abordagem inclui a detecção e quantificação de 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina absorção (BrdU) a proliferar por condrócitos 22. Adicionalmente, o tratamento posterior dos tecidos metatarsos podem ser realizados para permitir a análise a jusante da expressão de ARNm (RT-qPCR), proteína e análise intracelular de sinalização (Western blotting), ou composição lipídica (espectrometria de massa). A maioria dos estudos até agora usar metatarsos embrionárias cultivadas em vez de metatarsos dos animais pós-natais. Embora ambos os modelos podem ser informativo, o estudo dos ossos embrionárias tem várias vantagens: eles crescem mais rapidamente e pode ser exploITED para estudar a iniciação e progressão do processo de mineralização 23-25. Este protocolo descreve em detalhes a dissecção intrincada de metatarsos embrionárias a partir do membro posterior do dia embrionário 15 (E15) embriões de ratinho. Além disso, o crescimento e mineralização dos metatarsos anatomicamente distintas é mostrada.

<table><tbody><tr><td>Dissection scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #5 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #4 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>SuperFine Vannas scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Dilute to 70% v/v in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM without nucleosides</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters (0.22 &amp;mu;m) 33 mm diameter</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Add directly to the media prior to experimentation</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td>Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Nunc cell-culture treated 24-well plates</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

O objectivo deste método foi isolar metatarsos e cultura los embrionárias para exame do crescimento longitudinal do osso e ECM mineralização. Utilizando o nosso protocolo aqui descrito, ossos metatarsos embrionários foram dissecados com sucesso, como visualizado por microscopia de luz. As medições de ossos metatarsos, realizados como indicado na Figura 1, demonstrou a sua capacidade para crescer em comprimento longitudinal e mineralizar sua ECM (Figuras 2 e 3). Mineralização da matriz é referido pela primeira vez em meados da diáfise do rudimento óssea e é facilmente observado por microscopia de luz. Nenhuma coloração é necessária, embora a absorção de calceína pode oferecer visualização melhorada do mineral recém-formado. Estudos utilizando metatarsos embrionárias até à data 22,27,28 reuniram a dissecados 2º, 3º e 4º (CENtrais três) metatarsos, assumindo o crescimento in vitro e mineralização de ser comparáveis. In vivo do desenvolvimento de metatarsos murino, no entanto, revela que os 3º e 4º dígitos ter provas de mineralização antes de todas as outras metatarsos e falanges 29. Avaliação do potencial de crescimento e mineralização dos individualmente isoladas e cultivadas E15 2º, 3º e 4º metatarsos não revelou diferenças significativas na aparência ou a extensão da mineralização após 7 dias de cultura (Figura 2). Nenhuma diferença na percentagem de aumento da linha de base foi encontrado durante o período de cultura. Como há diferenças no potencial de mineralização foi observado o protocolo padrão de congregar as 2ª 3ª e 4ª metatarsos parece válida para estudos futuros. Tradicionalmente, os investigadores acrescentaram βGP aos meios de comunicaçãousado para cultura metatarsos embrionárias para promover ECM mineralização. No entanto, em estudos de cultura de células, demonstrou-se que se TNAP enzima é adicionada aos meios de comunicação osteogénicos contendo βGP, a deposição mineral de hidroxiapatite ectópica ainda ocorre mesmo na ausência de células 30. Para examinar os efeitos de vários substratos de mineralização e agonistas da capacidade do metatarso mineralização, foi realizada cultura metatarsos E15 em meios de cultura contendo uma variedade de suplementos, e as imagens e medições de comprimento foram registados diariamente. Os resultados indicaram que E15 ossos metatarsos ainda crescer e mineralizar sua ECM na ausência de βGP. E15 ossos metatarsos cultivadas em ácido ascórbico meios que apenas apresentaram aumentos comparáveis de comprimento e mineralização como metatarsos cultivadas na presença de βGP (Figura 3). Também mostrámos que lentivírus podem ser utilizados para transfectar ADN exógeno em metata cultivadasrsals. Aqui nós transfectadas com sucesso ossos metatarsos no dia 0 de cultura (isto é, dia da dissecção) com 2 x 10 6 de proteína fluorescente (GFP) partículas de vírus por verdes metatarso. Para permitir que a transdução de vírus, polibreno foi adicionada simultaneamente às culturas a 1: 500. As culturas foram deixados durante 7 dias, sem mudanças de meio, conforme necessário para E15 metatarso mineralização de ocorrer, antes de serem incubados com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) mancha durante 5 min e, em seguida, directamente visualizadas utilizando um microscópio confocal ( A Figura 4). A nossa prova de conceito experiências mostram claramente a transdução eficaz. No entanto, seria prudente examinar as secções ao longo da totalidade do metatarso para avaliar a sua transfecção e eficaz manipulação genética. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> Figura 1: Metodologia padrão utilizada para medir tele Comprimento e Mineralização Zone of embrionárias Metatarsos. (A) Total de medição do comprimento dos metatarsos E15 no dia 0 da cultura (dia de dissecção), tomada através do centro do metatarso. (B) Medidas de comprimento longitudinal total de um metatarso após sete dias em cultura. Note-se a ligeira curvatura no metatarso. (C) A medição do comprimento da zona de mineralização após sete dias de cultura. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> Figura 2: Crescimento e Mineralização Capacidade de Anatomicamente Distintas E15 Metatarsos de imagem e medição do 2º, 3º e 4º metatarsos do membro posterior de ratos E15 w.como foi executado. (A) imagens em série do 2º, 3º e 4º metatarsos durante todo o período de cultura. (B) Aumento percentual do comprimento a partir do dia 0 em cada dia de cultura. (C) comprimento Mineral do 2º, 3º e 4º metatarsos durante o período de cultura, expressa em percentagem do comprimento total metatarso. Dados em são representados como média ± erro padrão da média (SEM), (n = 6). (D) C57BL / 6J comprimentos metatarso em cada dia de cultura. Dados em são representados como média ± desvio padrão (n = 6). Preto bar = 1 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> Figura 3: Crescimento e mineralização Capacidade do tipo selvagemE15 Metatarsos cultivadas em vários meios de comunicação Osteogénica. (A) imagens seriadas de metatarsos cultivadas em apenas ácido ascórbico, βGP 1 mM, fosfocolina 3 mM, cloreto de cálcio 1,5 mM ou cloreto de cálcio 3 mM contendo mídia. (B) Aumento percentual em comprimento desde o dia 0 de metatarsos cultivadas com os vários suplementos. (C) de comprimento mineral de metatarsos cultivadas em vários meios, expressa em percentagem do comprimento total do metatarso. Os dados são representados como média ± erro padrão da média (SEM), (n = 6). Preto bar = 1 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> Figura 4: Transfecção de E15 Metatarsos com vírus GFP Partigos. ossos metatarsos (A) E15 foram transfectadas com partículas de vírus GFP para prova de conceito. (B) Os ossos foram coradas com DAPI para visualização DNA. (C) as imagens duplas indicada a transfecção bem sucedida de vírus GFP em toda a totalidade dos ossos metatarsos. As barras brancas = 0,5 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification at JoVE.com

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Cultura de murino embrionárias Metatarsos: Um modelo fisiológico de Endocondral ossificação

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

culture-murine-embryonic-metatarsals-physiological-model-endochondral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K visualizações.  The University of Edinburgh. We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development. 

Vídeo: Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Biologia do Desenvolvimento

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy human bones makes particularly valuable the use of mammalian models, such as mouse and rat, to look into different aspects of bone growth and homeostasis. Additionally, the development of sophisticated genetic tools in mice allows more complex studies of long bone growth and asks for an expansion of techniques used to study bone growth. Here, we present a detailed protocol for ex vivo murine bone culture, which allows the study of bone and cartilage in a tightly controlled manner while recapitulating most of the in vivo process. The method described allows the culture of a range of bones, including tibia, femur, and metatarsal bones, but we have focused mainly on tibial culture here. Moreover, it can be used in combination with other techniques, such as time-lapse live imaging or drug treatment.

Here, we present a method for ex vivo culture of long murine bones at both fetal and newborn stages, suitable for analyzing bone and cartilage development and homeostasis in controlled conditions while recapitulating the in vivo process.

Cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Um Defeito modelo simples Critical porte Femoral em Ratos

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Medicina

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Estabelecimento de um Defeito Modelo segmentar Femoral Critical-size em Ratos estabilizada por osteossíntese Placa

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Um modelo minimamente invasivo para analisar a fratura endocondral cura em ratos sob condições biomecânicas padronizadas

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

A geração de fraturas fechadas de fêmur em ratos: um modelo para estudar a consolidação óssea

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

Estudo preciso de lesão da placa de crescimento usando camundongos fluorescentes de trilinhagem

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones are overloaded.&#160;Better treatments for severely fractured growth plates are needed because the response to injury is a bony bridge that prematurely fuses the growth plate, leading to stunted and/or crooked limbs. Murine models of growth plate injury are advantageous for mechanistic studies, but&#160;are challenging because it is difficult to visualize and precisely injure the small growth plates in young mice.&#160;We describe here an improved growth plate injury model using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X.
These mice show native fluorescence associated with the three primary substrata of the growth plate. A growth plate injury similar to a Salter-Harris Type II injury is created reproducibly with a bur using the hypertrophic section of the growth plate as a reference during live imaging under fluorescence stereo microscopy guidance. Frozen histology analysis of the native fluorescence simplifies assessing the cellular response to injury. This methodology represents a substantial leap in growth plate injury research, providing a detailed and reproducible method for investigating pathology and evaluating new therapeutic strategies.

Autor em destaque: Avançando o modelo de lesão da placa de crescimento usando repórteres fluorescentes de trilinhagem em camundongos

This protocol describes an improved mouse model for adolescent bone growth plate injuries. Using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X, the primary matrices associated with three different substrata of the growth plate, injury placement is guided by native fluorescence under the microscope.

Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

Cultura de murino embrionárias Metatarsos: Um modelo fisiológico de Endocondral ossificação

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido

Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Um Defeito modelo simples Critical porte Femoral em Ratos

Estabelecimento de um Defeito Modelo segmentar Femoral Critical-size em Ratos estabilizada por osteossíntese Placa

Um modelo minimamente invasivo para analisar a fratura endocondral cura em ratos sob condições biomecânicas padronizadas

A geração de fraturas fechadas de fêmur em ratos: um modelo para estudar a consolidação óssea

Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento

Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento

Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento