Agradecemos a equipe e veterinários no Scott &amp; White Hospital Department of Comparative Medicine, Temple, Texas, para os seus conselhos e ajuda inestimável durante o desenvolvimento desta técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto para a medicina regenerativa fundos do programa, Scott &amp; White RGP concessão # 90172, NIH 2P40RR017447-07 e NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Agradecemos ao Dr. Suzanne Zeitouni para provas do manuscrito.

NOTA: Este protocolo é projetado para nu (Nu / J) camundongos fêmeas (18-25 g, 6 semanas) adquirido de Jackson Laboratories. Desde linhagens de camundongos variar um pouco em termos de anatomia e taxa de crescimento, aconselhamos que a fabricação de pinos é otimizado para a tensão, sexo e idade dos beneficiários antes da implantação em seres vivos. Se as estirpes são cuidadosamente combinados, o ajuste de interferência entre a cavilha e a cavidade da medula é altamente reprodutível. Procedimentos para a habitação, alimentação e criação de animais em geral estão fora do âmbito deste protocolo, mas todos os ratos foram alojados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição) e as políticas institucionais criados pelo Animal Care e Institucional Use Committee (IACUC) e Departamento de Medicina Comparativa (DCM) com Scott e Hospital White. 1. Fabricação de Pinos <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52368 / 52368fig2highres.jpg&quot; /&gt; Figura 2: montagem Pin. (A) Fotografias da tubulação de aço cirúrgico em várias fases de montagem e de 4 mm de diâmetro corte cilindro de 5 milímetros de espessura folha Gelfoam. (B) após o polimento o pino montado (acima), o cilindro Gelfoam é aparada, posicionada sobre o aço colar (meio), a seguir autoclavadas, resultando em um pino revestido com Gelfoam estéril seco. Isto melhora a fixação das células no local da lesão e mantém a direcção de cura (abaixo). (C) Um fémur excisada equipado com a cavilha medular. (D) Exemplos de conjuntos de pinos em várias espessuras e comprimentos de demonstrar a flexibilidade desta abordagem. (E) μCT reconstrução de um defeito do fémur estabilizado pinos que ilustra a interacção da cavilha medular ao osso trabecular das extremidades proximal e distal do fémur. <ol><li> Cortar um comprimento de 9 mm hipodérmica 22 G tubagem inoxidável, e um comprimento de 3 mm de 19 L utilizando tubagem de um serviço pesado roda de corte de diâmetro de fibra de vidro reforçada 23,8 milímetros equipado com uma ferramenta rotativa. Use um pequeno alicate de ponta fina para imobilizar a tubulação (Figura 2A, acima). Use óculos de proteção adequado e lidar com ferramenta rotativa com cuidado. </li><li> Colocar uma pequena quantidade (aproximadamente 10 ul) de adesivo de cianoacrilato para o meio do eixo 9 mm. Passe o colar 3 milímetros ao longo do eixo 9 milímetros até no centro e torcer para distribuir uniformemente a cola entre o colar e o veio. Medir as dimensões com um par de pinças digitais e comparar com a Figura 1. Deixa-se para definir, pelo menos, 15 h (Figura 2A, centro). </li><li> Utilize um disco impregnado de esmeril 220 grit para remover as rebarbas e cola em excesso. </li><li> Usando a ferramenta rotativa, polir o pino usando um disco de polimento sentia. </li><li> Enxágüe com água deionizada e seco, com comprear sseD. </li><li> Teste de integridade, colocando uma agulha hipodérmica 19 G romba sobre o eixo do pino de impulso e feitos recentemente contra o colar. Certifique-se de que o colar pode resistir a cerca de 25 g de peso. </li><li> Lavar o pino em filtrada estéril salina tamponada com fosfato (Figura 2B, em cima). Certifique-se de que o eixo do pino se encaixa perfeitamente na cavidade medular femoral com o colar contra as bordas do osso corte (Figura 2C). Protótipo várias configurações para os fins específicos do estudo e do destinatário (Figura 2D). Certifique-se de que as extremidades do pino de penetrar dentro do osso trabecular da diáfise de forma a maximizar a fixação e melhorar o ajuste de interferência (Figura 2E). NOTA: Recomenda-se que o ajuste é testado em peças ósseas antes da implantação em camundongos vivos (por exemplo Figura 2C). </li><li> Use a 4 mm de diâmetro de punção-biópsia cortador para cortar um cilindroa partir de uma folha de cinco milímetros de espessura de esponja cirúrgica gelatina. Usar um bisturi para cortar o cilindro de 3 mm de comprimento e passar uma agulha hipodérmica 20 G longo do comprimento do cilindro para gerar um furo (Figura 2A, abaixo). NOTA: Verificou-se que o posicionamento de uma gelatina ou colagénio andaime no local do defeito melhora a retenção de células e induz o crescimento ao longo do eixo longitudinal do osso. </li><li> Passe o cilindro de espuma de gelatina sobre o pino e alinhar com o colar (Figura 2B, centro) e um ciclo de autoclave em seco a 120 ° C a 15 psi. A espuma de gelatina irá secar e escurecer em cor (Figura 2B, abaixo). </li></ol> 2. Técnica Cirúrgica NOTA: O procedimento a seguir é escrito observando todas as orientações definidas pelo Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição). Por favor, observe todas as políticas adicionaisdefinido pelo IACUC local e garantir um protocolo uso de animais IACUC-aprovado (ou equivalente) está no local antes de prosseguir com as seguintes seções. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig3highres.jpg" /> Figura 3: Instrumentos cirúrgicos. (A) kit cirúrgico. Micro-broca (1), o corte de roda (2), fio absorvível (3), sutura exterior (4), lâminas de bisturi (5), cabo de bisturi (6), os pinos medulares estéreis embrulhados em papel (7), medidor de profundidade medular feito formulário tubulação hipodérmica (8), uma pinça de nariz fino (9), uma pinça de ratos dentes (10), agulhas de fresagem sem corte (11), motoristas de agulha (12), pequenas hemostats (13), uma tesoura fina (14), elevador periosteal (15), fórceps modificados Kern (16) (b):. modificações necessárias para produzir Kern estilo ósseas-apertos para os ratos. <ol><li> Escolha uma sala de procedimento cirúrgico ou de laboratório, limpo, com uma porta que pode ser fechado e nenhum tráfego de trânsito. Higienizar a surfac trabalho adequadoe com um desinfectante líquido de limpeza à base de quaternário de grau clínico. </li><li> Enquanto o uso de luvas estéreis descartáveis ​​e robe, criou um campo estéril de aproximadamente 60 x 90 cm 2, na superfície de trabalho higienizado com cortinas de pano autoclavada. NOTA: É aconselhável ter um assistente remover a embalagem exterior e apresentar os materiais estéreis à colocação do campo investigador. </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento higienizado equipado com um re-circulador de água quente sobre o pano e cubra com cortinas descartáveis ​​estéreis. Aqueça um esterilizador talão a temperatura de funcionamento (250-265 ° C, isto leva até 30 min). </li><li> No campo estéril, providenciar o kit cirúrgico (Figura 3A) para fornecer acesso conveniente a todos os componentes. Além disso, proporcionar algodão gaze estéril (2 x 2 polegadas, 2), estéreis cotonetes, uma bacia de aço estéril (500 ml) contendo solução salina estéril (0,9% w / v) aplicadores, clorexidina e desinfectantes / álcool isopropílico cirúrgico. </li><li> Montar uma pequenaunidade de anestesia de animais ao lado do campo estéril com uma câmara de indução e conjunto de ponta de cone, de acordo com orientação veterinária e manual do usuário. Use oxigênio clínica grau que o fornecimento de gás e isoflurano, USP. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig4highres.jpg" /> Figura 4: O procedimento cirúrgico. (AC) Abordagem e exposição do fêmur. (DE) Elevation e cortes. (FK) Reaming e dimensionamento de canais medulares. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig5highres.jpg" /> Figura 5: O procedimento cirúrgico. (AB) Instalação de pin. (CD) Encerramento. (E) imagem típica de devidamente posicionado pin 24 horas após a cirurgia. <ol start="6"><li> Coloque um mouse na câmara de indução do sistema de anestesia e set a saída de 2 L min -1 de O 2 e a concentração de isoflurano a 3% (v / v). <ol><li> Verifique se o mouse está inconsciente dentro de 1 min; elevar a concentração de 4% (v / v), se necessário. Remover o mouse, coloque no campo estéril com a almofada de aquecimento posicionado abaixo e aplicar o cone do nariz. Transferência de fluir para o cone, e reduzir o isoflurano a 2,5%, aguarde mais 20 seg, e teste para plano cirúrgico adequado, de acordo com a política institucional. Normalmente, a falta de um reflexo dos membros posteriores quando pressiona suavemente é adequado para a determinação anestesia adequada. </li><li> Durante todo o processo, tem um monitor assistente de uma forte respiração regular e coloração rosa das extremidades e região boca para assegurar um nível adequado de oxigenação enquanto inconsciente. Ajuste anestesia, de acordo com a orientação da política veterinária e institucional, se necessário. Aplicar estéril lágrimas artificiais unguento lubrificante (15% (v) v óleo / mineral, 83% v / v) wh (petrolato ite) para os olhos. </li></ol></li><li> Vire o mouse em um lado com a traseira de membros virada para cima em uma nova cortina descartável. Se necessário, retire a pele com um barbeador elétrico ou creme de depilação. Esfregue o local com solução salina estéril e retire a cortina adicional com o excesso de pele. Coloque uma nova cortina fenestrated sobre o mouse de forma a cobrir todas as partes, mas a toda a região posterior do membro (Figura 4A), mas manter a vista da face e da pata para monitorar coloração e respiração. </li><li> Localize as extremidades proximais e distais do fêmur e da incisão na pele por 5-10 mm ao longo do eixo longitudinal (Figura 4B). Separa-se a camada de pele da fáscia com um bisturi # 15, expondo uma abordagem lateral ao fémur através do bíceps femoral e vasto lateral. Localizar onde o septos de satisfazer ambos os músculos (que é uma linha de tecido branco contra a coloração rosa do músculo). Com um bisturi, com cuidado dissecar ao longo da fronteira até intermuscularo fémur é visível (Figura 4B). </li><li> Desenvolver a incisão com um elevador periosteal romba de modo a expor a totalidade da diáfise (Figura 4C). Use o elevador para expor ainda mais os dois terços centrais do fêmur e tomando cuidado para preservar o feixe neurovascular posterior do lado medial (Figura 4D). Raspe suavemente tecidos moles fora do osso com um bisturi, e seque com um Q-tip estéril ou equivalente. </li><li> Localize o centro do fêmur com calipers se necessário, e marca com um bisturi estéril ou marcador, em seguida, marcar 1,5 milímetros proximal e distal do centro. Gentilmente segure o fêmur usando um par de fórceps nariz-finas previamente formado no estilo Kern para evitar a pressão excessiva sobre o osso. NOTA: As dimensões exatas para as modificações são fornecidos na Figura 3B. É aconselhável para testar a pinça sobre um espécime sacrificados antes da utilização para assegurar o osso não irão quebrar sob pressão requeremd para imobilização durante o corte. </li><li> Usando uma broca bem equipado com uma roda de corte fino revestido de diamante-grit (diâmetro x 0,1 mm de largura 8 mm), fazer o primeiro corte com o elevador no local para proteger o tecido abaixo (Figura 4E). Aumentar o fêmur corte para 45 °, enquanto segurando firmemente a extremidade da diáfise, fazer o segundo corte, remoção de um segmento de 3 mm. NOTA: A proteção Rosto é recomendada nesta fase. </li><li> Com o osso imobilizada por meio de fórceps, resma cuidadosamente as cavidades medulares de cada extremidade com uma agulha hipodérmica 23 G romba. Utilizando um pré-fabricados profundidade de calibre feita a partir de um comprimento de 22 L tubagem colocado em tubos de 19 G (Figura 3A, i MET 8), avaliar a profundidade da cavidade medular fresado e garantir que ele é de 3 mm (Figura 4F-K) . Se a cavidade medular resiste a profundidade de calibre 22 G, resma de novo com uma agulha hipodérmica 22 G romba. </li><li> Com cuidado, insira o pino medular na proximal então distal c medularavities para trazer o fêmur de volta ao seu tamanho original e estabelecer uma estável, de 3 mm de folga (Figura 5A, B). Se necessário, aplicar uma pequena quantidade de tensão manual para atingir um bom encaixe de interferência da haste com o osso cortical do fémur. Certifique-se de que o pino encaixa-se perfeitamente nas cavidades medulares de ambos os lados e as extremidades do osso corte estão alinhadas com o colar. Se existe uma diferença, resma, mais uma vez com uma agulha romba 22 G. </li><li> Mude a posição do músculo e tecido periférico sobre o pino e fechar com uma contínua absorvível 5-0 (Figura 5C). Fechar pele incisão com 5-7 praça nó nylon 5-0 e vedação com adesivo cirúrgico (Figura 5D). </li></ol> 3. Os procedimentos pós-operatórios <ol><li> Depois de fechar a incisão na pele, retirar a anestesia, mas permitir O 2 a permanecer fluindo até que o mouse começa a se mover; esta deve levar menos de 1 min. Se o mouse permanece imóvel após 5 min deO 2 a administração, referem-se a políticas institucionais sobre a intervenção veterinária. </li><li> Quando o rato começa a se mover, gentilmente transferi-lo para uma gaiola contendo preferencialmente, roupas de cama autoclavado seco. <ol><li> Coloque um ninho tipo iglu em cada gaiola e o mouse vai recuar para ele, reduzindo o movimento. Verifique se o mouse recupera mobilidade hind-limb 5-10 min após a recuperação da consciência. </li><li> Realizar o monitoramento pós-operatório diariamente, de acordo com as políticas institucionais. Fornecer hidratação gelatinizado e comida no chão da gaiola para os primeiros 5-7 dias e administrar analgesia e acompanhamento pós-operatório, de acordo com as políticas institucionalmente aprovados. NOTA: Nós administrar 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorfina 24 com 0,25 ml de solução salina por via subcutânea, duas vezes por dia durante os primeiros três dias e, posteriormente, se o mouse não recuperar utilitário normal. </li></ol></li><li> Após as primeiras 24 horas de recuperação, tocar ao vivo com animais de raios-X de imagem undeanestesia r para visualizar colocação da cavilha (Figura 4E). Se o pino é deslocado, considerar a cirurgia imediata revisão. </li><li> No dia 7 pós-cirurgia, remover suturas sob anestesia e casa em grupos de acordo com as políticas de criação de animais institucional. </li><li> Depois de 2-5 semanas, humanamente eutanásia de animais de acordo com a American Veterinary Medical Association aprovado métodos de eutanásia 25. NOTA: Uma injeção intraperitoneal de produtos comercialmente disponíveis cocktail barbitúrico combinação eutanásia é eficaz e humana, mas as políticas institucionais locais sobre a eutanásia deve ser seguido. </li><li> Dissecar cuidadosamente afastado o hind-limb expondo o fêmur proximal e da pelve do lado medial. Pressione suavemente a articulação para dentro do lado lateral do membro enquanto retirar a cabeça do fêmur do acetábulo (encaixe do quadril) com um bisturi. Corte restante músculo e pele com um bisturi afiado ou micro-tesoura, liberandotoda a pata formar a pélvis. Com um par de fórceps afiada ou tesoura pesados, corte o menor traseira de membros (tíbia / fíbula) aproximadamente 5 mm abaixo da articulação do joelho. NOTA: Recomenda-se que todas as amostras são armazenadas de forma idêntica antes da análise. </li><li> Retire a pele, mas deixe músculo no lugar. Fixar o tecido em 10% de formalina tamponada suplementado com 10 mM de CaCl2 fixador durante 1 semana, seguidas por armazenamento em solução salina tamponada com fosfato suplementada com 10 mM de CaCl2 até 1 mês antes da imagiologia. Realizam a fixação e armazenamento a 4 ° C. Alternativamente, digitalizar espécimes imediatamente, sem fixação. </li></ol> 4. Análise de amostras NOTA: a cicatrização do osso pode ser avaliada por uma grande variedade de metodologias que estão fora do âmbito deste protocolo. O seguinte é um método que nós empregamos com sucesso usando um gerador de imagens espécime microCT (μCT). Recomenda-se que os seguintes parâmetros de are testado inicialmente, em seguida, otimizado para as necessidades específicas do projeto. <ol><li> Enrole espécime em uma fina camada de filme plástico de vedação e posicioná-lo verticalmente na câmara de instrumento. Certifique-se de que o fêmur é perpendicular ao palco amostra durante todo o exame. Defina a varredura com os seguintes parâmetros; Tensão = 29 kV, corrente = 661 mA, energia = 19 W, tamanho do pixel da imagem (mm) = 21,00; Rotação de 360 ​​graus = yes; quadro de média = on (5); etapa de rotação (deg) = 1,00, movimento aleatório = on. Salve as imagens como arquivos JPEG em uma pasta de destino único por scan (eg Figura 6A). NOTA: A verificação deve ser concluída em 57 min. </li><li> Utilizar o software de reconstrução para gerar imagens axiais com base nos seguintes parâmetros; suavização = on (4), a compensação de desalinhamento = on, redução anel artefato = on (5), a correção de endurecimento do feixe (40%), a rotação CS (deg) = 0,00. Definir a saída 2,000-15,000 unidades Hounsfield. Salve as imagens como arquivos JPEGem uma pasta de destino único por digitalização. </li><li> Usando as imagens axiais e software analítico, definir a região de interesse (ROI) definindo primeiro bordas proximal e distal do defeito original. Conseguir isso selecionando as seções que abrangem apenas o colarinho. Como o colar é mais espessa do que a cavilha medular, estas secções são facilmente definidos (Figura 6B, esquerda). Excluir o colar a partir de cálculos por desenhar uma zona de exclusão em torno dela (com uma margem de 100 mm) e transferência de zona a cada uma das seções do ROI (Figura 6B, à direita). NOTA: momentos de inércia polar, reconstruções 3D e cálculos, tais como o volume de osso novo (Figura 6C, D) pode ser facilmente alcançado utilizando o software. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+micro-CT+to+evaluate+cortical+bone+geometry+and+strength+in+nude+rats:+correlation+with+mechanical+testing,+pQCT+and+DXA.">The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA.</a> Bone. 38, 136-144 (2006).</li><li>Hadjiargyrou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+bone+regeneration.+Insight+into+the+molecular+complexity+of+wound+repair.">Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair.</a> J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).</li><li>Clough, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+regeneration+with+osteogenically+enhanced+mesenchymal+stem+cells+and+their+extracellular+matrix+proteins.">Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins.</a> J Bone Miner Res. , (2014).</li><li>Lu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+for+age-related+changes+in+fracture+repair.">Cellular basis for age-related changes in fracture repair.</a> J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).</li><li>Jepsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+patterns+of+skeletal+progenitor+cell+differentiation+and+progression+during+endochondral+bone+formation+affects+the+rate+of+fracture+healing.">Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing.</a> J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).</li><li>Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nonobese+diabetic+mice+to+understand+human+type+1+diabetes.">Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes.</a> Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).</li><li>Jee, W. S., Yao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+animal+models+of+osteopenia+and+osteoporosis.">Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Relata-se um método simples para gerar um defeito crítico porte estabilizado pinos do fêmur murino usando padrão de laboratório e equipamentos veterinários. Enquanto a montagem dos pinos e do próprio procedimento cirúrgico requer prática, é bem dentro das capacidades de um cientista de pesquisa biomédica bem treinado ou veterinário. O pino é posicionado no canal medular, sem fixação adicional, tornando o procedimento tecnicamente mais viável do que as abordagens mais complicados que empregam fixadores externos ou parafusos de bloqueio. Enquanto algum movimento de torção pode ocorrer durante as fases iniciais da cicatrização, este é minimizado pela atenção cuidadosa para o diâmetro do pino e a fresagem adequada do canal medular, de modo a atingir um encaixe firme de interferência entre o implante e endósteo. Com cuidadosa seleção de tensão pura e harmonização da idade e sexo, o ajuste torna-se reprodutível robusto dentro de alguns dias. No entanto, with o advento das técnicas de impressão 3D, espera-se que o movimento de torção pode ser ainda mais reduzido por versões mais sofisticadas do pino que incorporar superfícies rugosas e / ou locais de fixação farpado. A facilidade de fabricação pino e a disponibilidade de uma grande variedade de tamanhos de tubos hipodérmicas também permitir a optimização da técnica para virtualmente qualquer ratinhos consanguíneos adulto, independentemente de fenótipo natural, ou experimental osso. O desenho do colarinho pino original serve duas finalidades: (i) para prevenir o estreitamento aberrante do defeito e danos das extremidades do osso por meio de deslizamento longitudinal, e (ii) para proporcionar pontos de referência que definem as extremidades originais do defeito. Como tal, volumétricas e PMI medições podem ser feitas facilmente utilizando um scanner μCT espécime tal como uma Skyscan 1174. De facto, esta abordagem permite um nível de quantificação, que não é facilmente obtidos com técnicas de fracturas de tamanho não críticas padrão que exibem frequentemente variável ou poolesões rly definido. Enquanto uma unidade μCT é preferível para a quantificação de cura, a avaliação por uma avaliação objectiva de imagens de raios-X ortogonais ou técnicas de análise de imagem em 2D podem representar alternativas viáveis. Devido ao seu conteúdo mineral tamanho pequeno e relativamente baixa, membros murino podem ser facilmente preparados para histologia e montado como peças inteiras para histomorfometria convencional. Isso descarta questões de amostragem frequentemente enfrentados pelos pesquisadores que realizam histomorfométrica de grandes fraturas animais. Nas experiências aqui descritas, o tempo de cura foi relativamente curto em 3 semanas, o que corresponde à fase rápida, anabólico da cicatrização óssea. A partir daí, a remodelação óssea é um processo muito lento 28. Geralmente, se ponte não é observada após 4 semanas, é improvável que ocorra e de acordo cura, observa-se muito pouco o crescimento ósseo adicional após 4 semanas neste sistema. Além disso, uma lacuna três milímetros de satisfazer os critérios de Key et uml. 16 para um defeito de tamanho crítico e Garcia et al. demonstraram que uma lacuna tão estreito como 1,8 milímetros não é suficiente para curar após 10 semanas e esta poderia ser adiada para 15 semanas com pericôndrio despojado 23. Enquanto o tamanho e fragilidade dos ossos apresentam sérias dificuldades técnicas para a investigação ortopédica, a utilização de ratinhos é vantajoso em muitas maneiras. Por exemplo, há uma variedade de estirpes comprometida-imunes que permitem o teste de células humanas e as proteínas, sem receio de rejeição imunológica, e seu pequeno tamanho reduz a necessidade de quantidades excessivas de materiais valiosos experimentais, células ou compostos. Isto é exemplificado pelo nosso estudo recente que demonstra a eficácia de células estaminais humanas adultas e as suas proteínas extracelulares para osteoregeneration 29. A vida útil relativamente curta de camundongos também apresentam a oportunidade para a investigação sobre o envelhecimento 30 e da grande variedade de linhagens puras peRMIT o estudo do genótipo global sobre a cura 31. Há também um certo número de modelos de doenças que são facilmente estabelecido em ratinhos, tais como diabetes e osteoporose 32,33. De nota importante é a disponibilidade de muitas ratinhos transgénicos que podem ser utilizados com esta técnica para promover nossa compreensão da fisiologia do osso de regeneração sob condições de trauma extremo.

Estima-se que metade da população dos EUA experimentar uma fratura por 65 anos de idade 1. Para aqueles pacientes com fraturas tratadas cirurgicamente, 500.000 procedimentos envolvem o uso de um enxerto ósseo 2 e este número deverá aumentar com uma população cada vez mais envelhecida 3 . Embora o osso é um dos poucos órgãos que tem a capacidade de curar completamente sem formação de cicatrizes, existem casos em que o processo falha 3,4. Dependendo das circunstâncias e qualidade do tratamento, 2-30% das fraturas de ossos longos falhar, resultando na não-união 3,5. Embora ainda haja alguma debate para a definição, pseudo-artrose, lesões ósseas críticas porte ou não sindicalizados geralmente se refere a uma lesão que não cicatriza sobre a vida natural do sujeito 6. Para fins experimentais, a sua duração for encurtado para o tempo médio necessário para a cura completa de uma lesão óssea de tamanho médio. Lesões ósseas não-sindicalizados ocorrer numerous razões, mas os principais fatores incluem trauma extremo resultando em uma lacuna crítica porte, infecção, má angiogênese, o uso do tabaco, ou a capacidade osteoregenerative inibido devido a doença ou 7 anos de idade. Mesmo se não uniões são tratados com sucesso, pode custar mais de US $ 60.000 por procedimento, dependendo do tipo de lesão e as abordagens empregadas 8. Nos casos moderados, enxerto ósseo autólogo é empregado. Esta estratégia envolve a recuperação do osso a partir de um local dador e o implante no local da lesão. Enquanto esta abordagem é extremamente eficaz, o volume disponível de osso derivadas de dador é limitada e o procedimento envolve uma cirurgia adicional, que resulta em dor persistente em muitos pacientes 9,10. Além disso, a eficácia do enxerto ósseo autólogo é dependente da saúde do paciente. Substitutos ósseos feitos de materiais sintéticos ou de osso de doador falecido processados ​​estão disponíveis em abundância 11-13, mas eles have limitações significativas, incluindo propriedades fraca adesão da célula hospedeira, reduzida osteocondutividade, e do potencial de rejeição imunológica 14. Há, portanto, uma necessidade urgente de tecnologias de regeneração óssea que são seguros, eficazes e amplamente disponível. A nossa capacidade de melhorar as estratégias de regeneração óssea é extremamente dependente da capacidade de imitar trauma ósseo grave em animais de laboratório, mas a geração e estabilização das lesões ósseas grandes é tecnicamente desafiador. Na maioria dos casos, o trauma grave ossos longos é mimetizado experimentalmente através da criação de um defeito que não irá naturalmente curar. Embora possa variar com as espécies de 15, isto é conseguido por remoção completa de um segmento de osso que é maior do que 1,5 vezes o diâmetro da secção transversal do osso 16. O osso é então estabilizada com um implante de metal para manter a orientação adequada das arestas de fractura e para permitir a mobilidade. Devido ao seu pequeno tamanho e da fragilidade doseus ossos longos, o estabelecimento de tais lesões em camundongos estão além das capacidades da maioria dos grupos de pesquisa. Como tal, os modelos de defeitos dos ossos longos são confinadas a ratos e animais maiores. No entanto, os ratinhos proporcionam vantagens significativas de investigação em que eles podem ser modificados geneticamente e criadas estirpes como o sistema imunitário comprometido que não rejeitam as células e tecidos humanos. Para aplicações baseadas em células humanas, os ratos imunocomprometidos são atraentes para trabalhar com eles, porque são fisiologicamente bem caracterizado, fácil de casa, de baixo custo e facilmente analisados ​​radiologicamente e histologicamente. De suma importância é que os ratos imunocomprometidos não rejeitam as células de diferentes espécies, incluindo os seres humanos. O seu pequeno tamanho também permite o teste de um pequeno número de células ou volumes de andaimes experimentais em aplicações ortopédicas. Vários modelos murinos ortopédicos têm sido relatado que proporcionam vários graus de estabilidade óssea 17,18. Aqueles systems que resultam em níveis muito elevados de estabilidade, como fixadores externos e placas de bloqueio predominantemente curar por ossificação intramembranosa embora a cura endochondral tem sido relatada 19. Em contraste, aqueles que permitem alguma micro e / ou macro-motion, como as que utilizam pinos medulares não corrigidos ou parcialmente fixos, geralmente curar com uma predominância de ossificação 20,21. Retarde ou defeitos não sindicalizados de ossos longos são particularmente difíceis de alcançar em camundongos devido ao nível extra de estabilização necessária. No entanto, há relatos de um número de abordagens, incluindo pinos medulares com hastes bloqueadas, placas de bloqueio e fixadores externos 22. Esses sistemas geralmente funcionam bem, mas dado o seu projeto complicado que pode ser tecnicamente desafiadora para instalar. Por exemplo, Garcia et al. 23, concebeu um sistema de pino de bloqueio elegante para utilização em ratinhos, mas o procedimento envolve incisões em dois locais separadoss e extensa modificação do fémur para acomodar os pinos. Estes procedimentos foram realizados sob um microscópio de dissecação. Descrevemos uma cavilha medular femoral simples, com uma gola central, concebido para impedir o fechamento de um défice de osso, 3 mm e também delinear as extremidades originais do defeito. Enquanto o pino não foi fixado ao próprio osso, dimensionamento preciso do diâmetro de pino e a fresagem dos resultados de cavidades medulares em interferência suficiente para minimizar o movimento de torção (Figura 1). Com cuidadosa seleção de idade inato, gênero e camundongos correspondida-deformação, o resultado é uma alta reprodutibilidade hipertrófica não-uniondefect 22, que pode ser facilmente avaliada radiologicamente. Além disso regiões de interesse podem ser reprodutível definido após computadorizada de micro tomografia (μCT) para a medição de de formação de osso novo e parâmetros histomorfológicos. Os pinos foram protótipo em nosso laboratório usando ferramentas facilmente disponíveis.<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig1highres.jpg" /> Figura 1: princípio Experimental resumo esquemática do modelo de defeito segmentar.. O centro de segmento de 3 mm 9-10 mm de um fémur murino é excisado cirurgicamente (esquerda). Um, de calibre 19 de tubo de aço cirúrgico 3 milímetros de comprimento é passado sobre um 9, 22 mm de comprimento L do tubo de aço inoxidável e fixado com adesivo no centro exacto (à direita). O pino resultante é encaixada os canais medulares das restantes porções proximais e distais do fémur com a gola 19 G substituindo o segmento de 3 mm de osso (em baixo, ao centro).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">Name of Equipment/Material*</td>
			<td style="width:207px;">Company</td>
			<td style="width:180px;">Catalog or model</td>
			<td style="width:179px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pin Assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dremel rotary tool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8220</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heavy duty cut off wheel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 19G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMZ8LY</td>
			<td>OD 1.07mm, ID 0.889mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 21G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMZ8YQ</td>
			<td>OD 0.82mm, ID 0.635mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 22G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMYLZS</td>
			<td>OD 0.719mm, ID 0.502mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 23G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FN0SY0</td>
			<td>OD 0.643mm, ID 0.444mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emery disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rubber polishing point</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Felt polishing disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin sponge</td>
			<td>Surgifoam/Ethicon</td>
			<td>1974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Punch biopsy cutter</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgery/post-operative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Warm pad and circulator pump</td>
			<td>Stryker/Thermocare</td>
			<td>TP700, TP700C, TPP722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coverage quaternary spray</td>
			<td>Steris</td>
			<td>1429-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bead sterilizer</td>
			<td>Germinator/CellPoint Scentific</td>
			<td>Germinator 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anesthesia system</td>
			<td>VetEquip Inc</td>
			<td>901806 or 901807/901809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isofluorane anesthetic</td>
			<td>VETone/MWI</td>
			<td>501017, 502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical disinfectant</td>
			<td>Chloraprep/CareFusion</td>
			<td>260449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>various</td>
			<td>recommend German made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Face protection</td>
			<td>Splash Shield</td>
			<td>4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rechargable high speed drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diamond cutting wheel</td>
			<td>Strauss Diaiond</td>
			<td>361.514.080HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbable sutures&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>UM-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Outer sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>668G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydration gel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diet gel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt and Benckser</td>
			<td>12496-0757-01</td>
			<td>controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse igloos</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>K3328, 3570,3327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Euthanasia cocktail</td>
			<td>Euthasol/Virbac</td>
			<td>710101</td>
			<td>controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Live animal imager&#160;</td>
			<td>Orthoscan</td>
			<td>FD Pulse</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-CT unit and software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Skyscan1174</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sealing film/Parafilm M</td>
			<td>VWR or Fisher</td>
			<td>100501-338, S37441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple critical-sized femoral defect model in mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Ratos normalmente recuperar a consciência e traseiras-limb mobilidade 5-10 minutos após a retirada da anestesia. Durante os primeiros 5 dias, é aconselhável para abrigar os ratinhos individualmente e introduzir enriquecimento ambiental para evitar a utilização excessiva do membro. Para o efeito, do tipo iglu ninhos reduzir a necessidade de construção de ninhos e incentivar repouso. Observamos, também, que o fornecimento de alimentos e hidrogel no chão da gaiola reduz a probabilidade de pin deslocamento. Durante o período de 5 dias, a analgesia deve ser administrado conforme necessário, de acordo com as políticas institucionalmente aprovados. A perda de peso até aproximadamente 15% do peso pré-operatória inicial é possível, durante o período pós-operatório de 5 dias. Vinte e quatro horas após a cirurgia, raios-X do membro afetado são recomendados para avaliar pin-colocação. Os pinos devem ser completamente inseridas nas proximais e distais canais medulares com as bordas do defeito nivelada contra a gola (Figura 2C,2E, a figura 5E, e Figura 6A). Em casos raros (&lt;5% dos casos), os pinos podem tornar-se deslocado em estágios iniciais de protocolos de uso de cura e animais devem prever a cirurgia de revisão, se isso ocorrer. Embora seja tecnicamente desafiador para quantificar o movimento de torção em fêmures murino, palpação manual dos espécimes confirmou que o movimento de torção e longitudinal é marginal após 7 dias como o tecido conjuntivo se acumula ao redor do pino. Após 5 dias de acompanhamento pós-operatório, os ratos podem ser devolvidos à habitação comunal padrão como por políticas institucionalmente aprovados. Sem intervenção terapêutica, as bordas do defeito tipicamente estender 0,5 milímetros durante 21 dias, mas em casos raros, o crescimento de osso novo pode ser de até 1 mm (Figura 6A). Detenções crescimento ósseo após este período como os estágios inflamatórios e anabolizantes de cessar regeneração resultando em um defeito de não-união. Após 14-21 dias de cura, o volume of de novo osso pode ser prontamente determinada a partir de imagens geradas por varrimento axiais μCT. Usando o varrimento, os procedimentos de selecção e de reconstrução ROI axiais descritos no protocolo, o volume de osso novo aumenta com o tempo gerada, mas geralmente não excede um total de 1 mm3, na ausência de intervenção terapêutica (Figura 6C) em comparação com 6- 7 milímetros 3 em uma região anatomicamente equivalente de fêmur ileso. Embora o teste biomecânico convencional é tecnicamente difícil, devido ao tamanho da amostra e da natureza do método de fixação, o momento de inércia polar (PMI), uma estimativa da capacidade de um material para resistir à torção com base na área da secção transversal e a densidade, tem sido mostrado para representar uma estimativa apropriado de resistência em ossos longos 26,27. Usando este método, axiais secções transversais em diferentes distâncias das bordas da lesão pode ser seleccionado para análise. Após 21 dias, o PMI de osso de novo 0,25 milímetros from a lesão arestas varia de entre 0,05-0,35 mm em comparação com 4 0,02-0,08 mm 4 no centro da lesão confirmando ainda mais a presença de não união, em casos não tratados (Figura 6D). O PMI de fémur não lesionado num local anatomicamente equivalente varia tipicamente entre 0,5-0,7 mm 4 utilizando as condições descritas aqui. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig6highres.jpg" /> Figura 6: Os resultados típicos. Scans (A) de raios-X de fêmures no dia 7, 14 e 21 de pós-cirurgia demonstrando ingrowth limitado de osso Painel B:. Representação esquemática dos parâmetros de ROI para a medição volumétrica óssea. Secção transversal axial representativas com uma zona de exclusão (EX) sobre o pino de colarinho incluindo uma margem de 100 um para excluir a medição de artefactos na interface metal-tecido (esquerda). Cintilografia óssea completa (right, parte superior), demonstrando a ROI longitudinal definida pelas secções de osso entre as extremidades do colar com o tecido ósseo original é excluído (EX). As bordas da lesão originais estão localizados nas secções axiais, utilizando a diferença entre o diâmetro da cavilha e da gola (direita, em baixo). (C) medições volumétricas típicas ao dia 7, 14 e 21 após a cirurgia sem intervenção terapêutica (com meios desvios-padrão, n = 3). (D) medições do PMI em cortes axiais 0,25 milímetros a partir das bordas proximais e de lesão distal e do ponto médio (médias, desvios padrão, n = 3). (manchadas de trichrome E) de Masson parafina-embedded seção (à esquerda) corte no sentido longitudinal demonstrando excrescência óssea constituído por cartilagem (ca) e osso esponjoso (b) (barra de escala = 0,5 mm). A posição do campo está indicada na verificação de raios-X (para a direita). (F) não-decalcified, metacrilato de metila secção coronal incorporado de defeito de um dia de idade coradas com HE (escala bar = 1,0 mm). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52368/52368fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A descalcificação dos tecidos normalmente leva 10-14 dias, utilizando condições convencionais, e é facilmente monitorado por varrimento de raios-X. É aconselhável manter alguma musculatura nos espécimes durante a descalcificação para melhorar a estabilidade durante o manuseio. Após descalcificação, pinos podem ser cuidadosamente removida com um bisturi afiado permitindo inclusão em parafina e histologia. Trichrome coloração de cortes longitudinais de Masson permite a visualização de excrescência óssea endocondral com um bordo de ataque da cartilagem (ca), seguido de osso esponjoso (cb) (Figura 6E). Enquanto alguns danos ocorrerão inevitavelmente durante a dissecção, a estrutura histológica de ossoe do tecido conjuntivo permanece claro se o pino é removido com cuidado. Alternativamente, metil metacrilato e corte de secções não desmineralizados pode ser realizada com o pino no lugar (Figura 6F).

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A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Um Defeito modelo simples Critical porte Femoral em Ratos

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K visualizações.  Texas A&M Health Science Center. Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice. 

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A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Um método simples parafuso Guia para intracraniana Estudos Xenoenxerto em Ratos

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Medicina

Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role in healing of bone injuries. In the worst-case scenario mechanical instability can lead to delayed or non-union in humans. However, motion can also stimulate the healing process. In fractures that have motion cartilage forms to stabilize the fracture bone ends, and this cartilage is gradually replaced by bone through recapitulation of the developmental process of endochondral ossification. In contrast, if a bone fracture is rigidly stabilized bone forms directly via intramembranous ossification. Clinically, both endochondral and intramembranous ossification occur simultaneously. To effectively replicate this process investigators insert a pin into the medullary canal of the fractured bone as described by Bonnarens4. This experimental method provides excellent lateral stability while allowing rotational instability to persist. However, our understanding of the mechanisms that regulate these two distinct processes can also be enhanced by experimentally isolating each of these processes. We have developed a stabilization protocol that provides rotational and lateral stabilization. In this model, intramembranous ossification is the only mode of healing that is observed, and healing parameters can be compared among different strains of genetically modified mice 5-7, after application of bioactive molecules 8,9, after altering physiological parameters of healing 10, after modifying the amount or time of stabilization 11, after distraction osteogenesis 12, after creation of a non-union 13, or after creation of a critical sized defect. Here, we illustrate how to apply the modified Ilizarov fixators for studying tibial fracture healing and distraction osteogenesis in mice.

This article describes a method for stabilizing long bone fractures that is based on the application of modified Ilizarov external fixators 1-3. After application of the fixators and creation of the bone injury, healing can be assessed, distraction osteogenesis can be performed, or non-union or critical sized defect can be created and used to study therapeutic interventions.

Criando Fraturas rigidamente estabilizadas para a Avaliação ossificação intramembranosa, Distração Osteogênica, ou Cura de defeitos críticos Sized

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role ...

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. Adipose-derived stromal cells (ASCs) have proven to be an abundant source of multipotent stem cells capable of undergoing osteogenic, chondrogenic, adipogenic, and myogenic differentiation. Many studies have explored the osteogenic potential of these cells in vivo with the use of various scaffolding biomaterials for cellular delivery. It has been demonstrated that by utilizing an osteoconductive, hydroxyapatite-coated poly(lactic-co-glycolic acid) (HA-PLGA) scaffold seeded with ASCs, a critical-sized calvarial defect, a defect that is defined by its inability to undergo spontaneous healing over the lifetime of the animal, can be effectively show robust osseous regeneration. This in vivo model demonstrates the basis of translational approaches aimed to regenerate the bone tissue - the cellular component and biological matrix. This method serves as a model for the ultimate clinical application of a progenitor cell towards the repair of a specific tissue defect.

This protocol describes the isolation of adipose-derived stromal cells from lipoaspirate and the creation of a 4 mm critical-sized calvarial defect to evaluate skeletal regeneration.

Reparação de um modelo de defeito crítico porte calvária Usando derivadas de tecido adiposo células do estroma colhidas lipoaspirado

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Um método simples de intubação Lung Rato

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to atherosclerotic plaque development or the rupturing of established plaques, interrupts normal blood flow leading to various morbidities such as myocardial infarction and stroke. In the clinic endovascular procedures such as angioplasty are commonly performed to reopen the lumen. However, these treatments inevitably damage the vessel wall as well as the vascular endothelium, triggering an excessive healing response and the development of a neointimal plaque that extends into the lumen causing vessel restenosis (re-narrowing). Restenosis remains a major cause of failure of endovascular treatments for atherosclerosis. Thus, preclinical animal models of restenosis are vitally important for investigating the pathophysiological mechanisms as well as translational approaches to vascular interventions. Among several murine experimental models, femoral artery wire injury is widely accepted as the most suitable for studies of post-angioplasty restenosis because it closely resembles the angioplasty procedure that injures both endothelium and vessel wall. However, many researchers have difficulty utilizing this model due to its high degree of technical difficulty. This is primarily because a metal wire needs to be inserted into the femoral artery, which is approximately three times thinner than the wire, to generate sufficient injury to induce prominent neointima. Here, we describe the essential surgical details to effectively overcome the major technical difficulties of this model. By following the presented procedures, performing the mouse femoral artery wire injury becomes easier. Once familiarized, the whole procedure can be completed within 20 min.

The mouse femoral artery wire injury model of restenosis is technically challenging. In this protocol we show the key technical details essential for successfully performing wire injury to induce consistent&#160;neointima for studies of restenosis.

Um modelo murino de Arterial Restenosis: Aspectos Técnicos do Femoral Injury Fio

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Estabelecimento de um Defeito Modelo segmentar Femoral Critical-size em Ratos estabilizada por osteossíntese Placa

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

A Repetitive Concussive Head Injury Model in Mice

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of knowledge on the injury and its effects. To develop a better understanding of concussions, animals are often used because they provide a controlled, rigorous, and efficient model. Studies have adapted traditional animal models to perform mTBI to stimulate mild injury severity by changing the injury parameters. These models have been used because they can produce morphologically similar brain injuries to the clinical condition and provide a spectrum of injury severities. However, they are limited in their ability to present the identical features of injuries in patients. Using a traditional impact system, a repetitive concussive injury (rCHI) model can induce mild to moderate human-like concussion. The injury degree can be determined by measuring the period of loss of consciousness (LOC) with a sign of a transient termination of breathing. The rCHI model is beneficial to use for its accuracy and simplicity in determining mTBI effects and potential treatments.

Concussion presents the most common type of traumatic brain injury. Therefore, a repetitive concussive animal model, which replicates the important features of an injury in patients, may provide a means to study concussion in a rigorous, controlled, and efficient manner.

A principal modelo lesões repetitivas Concussive em Ratos

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...