用于研究生长板损伤的 Tricolor 转基因小鼠模型

我想为骨折的儿童开发更好的治疗方法。具体来说，我想防止骨折的软骨生长板中形成骨头，因为，否则。骨折的肢体不会正常延长。

第一步，我们必须开发一个更准确的小鼠模型来测试新疗法并确定作用机制。常规治疗包括受伤后切除骨桥，并插入脂肪组织等插入材料。这些方法不能再生生长板软骨，并且通常需要额外的手术。

然而，我们现在正在测试的新兴组织工程方法包括局部分子，以促进软骨再生，同时防止骨桥形成。动物模型对于测试受伤生长板软骨再生的组织工程方法至关重要。精度和成本之间存在权衡。

像绵羊这样的大型动物在损伤建模方面具有更高的精度和一致性，但比像老鼠这样的小型动物要贵得多。我们在这里努力的目标是了解生长板受伤后发生的这种组织反应的细胞基础。使用我们的三色荧光小鼠，我们能够绘制发出这些颜色的细胞，以及其他荧光染色剂和抗体中的体细胞矿物质，并将它们定位回熟悉的显色染色剂。

这使我们能够欣赏修复的动态性，并确定负责这种组织反应的细胞。这些年轻的转基因小鼠中肥厚软骨细胞的天然荧光使研究人员能够在实时成像下精确地创建模拟儿童损伤的临床相关生长板损伤。此外，关节软骨未受伤，并且可以使用可用于小鼠机制研究的广泛试剂。

首先，在 X 射线柜中一次将三只麻醉的小鼠平行放置在它们的腹部。张开小鼠的腿，使胫骨不会在它们下面被遮挡。为了记录初始肢体长度，在小鼠附近放置一个不透射线的刻度，并以 26 KB 和 800 毫安进行 X 射线成像以捕获它们的胫骨图像。

在动物手术室，组装电子高速牙科钻孔系统。将电子脚踏控制器和手机连接到控制单元，并用消毒过的表面阻隔管袜子盖住手机绳。将控制器设置为一比一的传动比，最大每分钟 30， 000 转。

接下来，将覆盖有消毒管袜的柔性异氟醚机软管放在荧光立体显微镜载物台上。首先，通过 X 射线成像确定小鼠的初始肢体长度。将无菌 0.5 毫米圆形牙科车针连接到手机上，并选择所需的其他手术器械。

麻醉动物后，立即皮下注射规定剂量的一半丁丙诺啡。涂抹眼部润滑剂以保护小鼠的眼睛不干燥，并将小鼠转移到立体显微镜载物台上的仰卧位。依次用聚维酮碘消毒右后肢、骨盆区域、左后肢前部和尾巴，然后用 70% 乙醇消毒。

在使用 15 号手术刀的强光照射下，在膝关节正下方创建一个 5 毫米的皮肤切口，露出右胫骨的近端。保持左侧对侧胫骨未受伤，使其作为内部未受伤的对照。接下来，使用 15 号手术刀刀片的背面，通过胫骨近端的上覆肌肉进行垂直钝性解剖，去除软组织以清晰地暴露胫骨头。

关闭手术室灯后，选择正确的荧光通道以照亮生长板的所需区域。接下来，将小鼠的皮肤开口稍微调整为更近端，然后是远端，以确保可以看到胫骨生长板的肥大生长板区域，而不是股骨生长板。要创建 Salter-Harris II 型样病变，请将 0.5 毫米的牙钻车针放置在肥大生长板区的中间。

保持车针和肢体与工作表面平行，这样车针入口通道不会倾斜到骨骺中，也不会穿过整个柔软的生长板。在钻头踏板上施加压力以启动车针旋转，然后轻轻地将车针压入生长板，在缺陷超过车针直径之前停止。用一滴无菌 PBS 冲洗病变部位以去除任何碎屑。

使用牙周探针，确认缺损深度为 0.5 毫米。然后，小心地重新对齐蒙皮边缘。然后，采用间断缝合技术和 5-0 聚乙醇酸缝合线来密封皮肤切口。

对于组织解剖，将两个完整的后肢与被安乐死的动物隔离开来，并从骨骼和膝关节囊区域去除皮肤和肌肉。然后，使用显微解剖剪刀，小心地切除髌骨。使用 29 号胰岛素注射器将冷的 10% 缓冲福尔马林彻底分布在膝腔的所有区域内。

最后，切断股骨和胫骨的骨干区域，以改善对骨髓空间的固定通路。用纱布将关节组织绑在细销钉上。将后肢放入固定剂中，将组织置于 4 摄氏度，使其保持完全伸展位置 24 至 36 小时。

与未受伤的对照组相比，受伤的胫骨在术后 3 周内骨骼的 2D 横截面长度增长减少。受伤的生长板显示肥大区和临时钙化层的破坏，增殖区仅有轻微的干扰。在所有 6 只小鼠中都一致观察到受伤生长板内的骨桥形成，并且大多数形成于生长板的中间附近，尽管是横向入路。

多色荧光方法能够详细检查骨桥区域内的软骨细胞分化。